-微生物的生長繁殖及其控制講課教案

1、第六章微生物的生長繁殖及其控制計劃學時：5重點：細菌生長曲線的定義、各時期的特點、應用及生產(chǎn)指導意義?？刂莆⑸锷L繁殖及控制微生物生長的條件及原理。第一節(jié)細菌純培養(yǎng)的群體生長規(guī)律一、細菌純培養(yǎng)的群體生長規(guī)律以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌數(shù)目的對數(shù)或生長速度為縱坐標作圖，可以得到如圖6-6的曲線，稱為繁殖曲線根據(jù)細菌生長繁殖速率的不同，可將生長曲線大致分為延遲期、對數(shù)期、調(diào)整期或滯留適應期。（一）延遲期處于延遲期細菌細胞的特點可概括為8個字：分裂遲緩、代謝活躍。延遲期出現(xiàn)的原因，可能是為了調(diào)整代謝。延遲期的長短與菌種的遺傳性、菌齡以及移種前后所處的環(huán)境條件等因素有關(guān)。在生產(chǎn)實踐中，通常采取的措施有

2、增加接種量，在種子培養(yǎng)中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些營養(yǎng)成分，采用最適種齡（即處于對數(shù)期的菌種）的健壯菌種接種以及選用繁殖快的菌種等措施，以縮短延遲期，加速發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率。（二）對數(shù)期（logphase）對數(shù)期又稱指數(shù)期（exponentialphase）。在此期中，細胞代謝活性最強，組成新細胞物質(zhì)最快，所有分裂形成的新細胞都生活旺盛。這一階段的突出特點是細菌數(shù)以幾何級數(shù)增加，代時穩(wěn)定，細菌數(shù)目的增加與原生質(zhì)總量的增加，與菌液混濁度的增加均呈正相關(guān)性。處于對數(shù)期的微生物，其個體形態(tài)、化學組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛，生長迅速，代時穩(wěn)定，所以是研究基本代謝的良好材料，也是發(fā)酵生產(chǎn)的良好種

3、子，如果用作菌種，往往延遲期很短以至檢查不出，這樣可在短時間內(nèi)得到大量微生物，以縮短發(fā)酵周期。（三）穩(wěn)定期（stationaryphase）又稱恒定期或最高生長期。處于穩(wěn)定期的微生物，新增殖的細胞數(shù)與老細胞的死亡數(shù)幾乎相等，整個培養(yǎng)物中二者處于動態(tài)平衡，此時生長速度，又逐漸趨向零。穩(wěn)定期的細胞內(nèi)開始積累貯藏物，如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等，大多數(shù)芽抱細菌也在此階段形成芽抱。生產(chǎn)上常常通過補料、調(diào)節(jié)pH、調(diào)整溫度等措施，延長穩(wěn)定期，以積累更多的代謝產(chǎn)物。（四）衰亡期（declinehpase）穩(wěn)定期后如再繼續(xù)培養(yǎng)，細菌死亡率逐漸增加，以致死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了&quo

4、t;負生長"，此階段叫衰亡期。二、微生物生長的測定測定生長量的方法很多，概括起來有以下幾種。（一）直接計數(shù)法（又稱全數(shù)法）1 .涂片染色法2 .計數(shù)器測定法用特制的細菌計數(shù)器或血球計數(shù)器進行計數(shù)。取一定容積稀釋的單細胞微生物懸液置于計數(shù)器載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室內(nèi)。由于計數(shù)室的容積是己知的（總面積為1平方毫米，高0.1毫米），并有一定刻度。因此，可根據(jù)計數(shù)器刻度內(nèi)的細菌數(shù)，計算出樣品中的含菌數(shù)。3 .比例計數(shù)法將待測的細菌懸液與等體積血液混合后涂片，在顯微鏡下可以測得細菌數(shù)與紅細胞數(shù)的比例。4 .電子自動計數(shù)器計數(shù)法電子計數(shù)器的工作原理，就是測定一個小孔中液體的電阻變化。5 .比濁

5、法是測定懸液中細胞數(shù)的快速方法。其原理是懸液中細胞濃度與混濁度成正比，與透光度成反比。菌體是不透光的，光速通過菌懸液時則會引起光的散射或吸收，從而降低透光量。細菌越多，透光量越低。因此，測定菌懸液的光密度或透光度可以反映細胞的濃度。（二）間接計數(shù)法（又叫活菌計數(shù)法）1 .平皿菌落計數(shù)法像稀釋平皿分離法一樣，先將待測菌液作一系列10倍稀釋，使平皿上長出的菌落數(shù)在30-300個之間。平皿菌落計數(shù)法是教學、生產(chǎn)、科研中最常見的一種活菌計數(shù)法。2 .稀釋法待測樣品作一系列稀釋，一直稀釋到該稀釋液的少量（如1毫升）接種到新鮮培養(yǎng)基中沒有或極少出現(xiàn)生長繁殖。根據(jù)沒有生長的最低稀釋度與出現(xiàn)生長的最高稀釋度（

6、即臨界級數(shù)），再用"或然率”理論，可以計算出樣品單位體積中細菌數(shù)的近似值。（三）測定細胞物質(zhì)量1 .測定細胞總含氮量來確定細菌濃度其方法要點：從一定量培養(yǎng)物中分離出細菌，洗滌，以除去培養(yǎng)基帶入的含氮物質(zhì)。再用凱氏定氮法法測定總含氮量，以表示原生質(zhì)含量的多少。一般細菌的含氮量約為原生質(zhì)干重的14%2 .DNA含量測定法利用DNAWDABA-2HC1（即新配制的20%W/VV3,5-二氨基苯甲酸-鹽酸溶液）能顯示特殊熒光反應的原理而設(shè)計的。3 .測定細胞干重法單位體積培養(yǎng)物中，細胞的干重可用來表示菌體的生長量。4 .基他生理指標測定法三、連續(xù)培養(yǎng)最簡單的連續(xù)發(fā)酵裝置包括：培養(yǎng)室、無菌培養(yǎng)

7、基容器以及可自動調(diào)節(jié)流速（培養(yǎng)基流入，培養(yǎng)物流出）的控制系統(tǒng)，必要時還裝有通氣、攪拌設(shè)備?？刂七B續(xù)培養(yǎng)的方法主要有兩種：（一）恒濁連續(xù)培養(yǎng)不斷調(diào)節(jié)流速而使細菌培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法叫恒濁連續(xù)培養(yǎng)，如圖6-7,Ao在恒濁連續(xù)培養(yǎng)中裝中濁度計，借光電池檢測培養(yǎng)室中的濁度（即菌液濃度），并由光電效應產(chǎn)生的電信號強弱變化，來自動調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入和培養(yǎng)物流出培養(yǎng)室的流速。（二）恒化連續(xù)培養(yǎng)控制恒定的流速，使由于細菌生長而耗去的營養(yǎng)物及時得到補充，培養(yǎng)室中營養(yǎng)物濃度基本恒定，從而保持細菌的恒定生長速率，故稱恒化連續(xù)培養(yǎng)，又叫恒組成連續(xù)培養(yǎng)。恒化連續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分中，必須將某種必需的營養(yǎng)物質(zhì)控

8、制在較低的濃度，以作為限制性因子。能作為恒化連續(xù)培養(yǎng)的限制因子的物質(zhì)很多。這些物質(zhì)必須是機體生長所必需的，在一定濃度范圍內(nèi)能決定該機體生長速率的。常用的限制性營養(yǎng)物質(zhì)有作為氮源的氨、氨基酸；作為碳源的葡萄糖、麥芽糖、乳酸；以及生長因子、無機鹽等。恒化連續(xù)培養(yǎng)方法，多用于微生物學的研究工作中。連續(xù)培養(yǎng)法用于工業(yè)發(fā)酵就稱為連續(xù)發(fā)酵（continuousfermentation）。我國已用于丙酮-西醇的發(fā)醇生產(chǎn)中，縮短了發(fā)酵周期，效果良好。四、同步生長能使培養(yǎng)的微生物處于比較一致的，生長發(fā)育在同一階段上的培養(yǎng)方法叫同步培養(yǎng)法；利用上述實驗室技術(shù)控制細胞的生長，使它們處于同一生長階段，所有的細胞都能同

9、時分裂，這種生長方式叫同步生長；用同步培養(yǎng)法所得到的培養(yǎng)物叫同步培養(yǎng)或同步培養(yǎng)物。獲得同步培養(yǎng)的方法很多，最常用的有以下幾種：（一）機械法（又稱選擇法）1 .離心沉降分離法2 .過濾分離法3 .硝酸纖維素薄膜法A.將菌液通過硝酸纖維素薄膜，由于細菌與濾膜帶有不同電荷，所以不同生長階段拓細菌均能附著于膜上；B.翻轉(zhuǎn)薄膜，再用新鮮培養(yǎng)液濾過培養(yǎng)；C.附著于膜上的細菌進行分裂，分裂后的子細胞不與薄膜直接接觸，由于菌體本身的重量，加之它所附著的培養(yǎng)液的重量，便下落到收集器內(nèi)；D.收集器在短時間內(nèi)收集的細菌處于同一分裂階段，用這種細菌接種培養(yǎng)，便能得到同步培養(yǎng)物。（二）調(diào)整生理條件的同步法1 .溫度調(diào)整

10、法將微生物的培養(yǎng)溫度控制在亞適溫度條件下一段時間，它們將緩慢地進行新陳代謝，但又不進行分裂。2 .營養(yǎng)條件調(diào)整法即控制營養(yǎng)物的濃度或培養(yǎng)基的組成以達到同步生長。（三）抑制DN蛤成法DNA勺合成是一切生物細胞進行分裂的前提。利用代謝抑制劑阻礙DN蛤成相當一段時間，然后再解除其抑制，也可達到同步化的目的。第二節(jié)物理、化學因素對微生物生長與死亡的影響消毒是指殺死或消除所有病原微生物的措施，可達到防止傳染病傳播的目的。滅菌是指用物理或化學因子，使非于物體中的所有生活微生物，永久性地喪失其生活力，包括最耐熱的細菌芽抱。這是一種徹底的殺菌措施?；熓侵咐媚承┚哂羞x擇毒性的化學藥物（如磺胺）或抗生素，對生

11、物體的深部感染進行治療，可以有效地消除宿主體內(nèi)的病原體，但對宿主卻沒有或基本上沒有損害。一、溫度溫度是影響有機體生長與存活的最重要的因素之一。它對生活機體的影響表現(xiàn)在兩方面：一方面隨著溫度的上升，細胞中的生物化學反應速率和生長速率加快。在一般情況下，溫度每升高10C,生化反應速率增加一倍；另一方面，機體的重要組成如蛋白質(zhì)、核酸等對溫度都較敏感，隨著溫度的增高而可能遭受不可逆的破壞。就總體而言，微生物生長的溫度范圍較廣，已知的微生在零下12-100C均可生長。而每一種微生物只能在一定的溫度范圍內(nèi)生長。各種微生物都有其生長繁殖的最低溫度、最適溫度、最高溫度和致死溫度。最低生長溫度是指微生物能進行繁

12、殖的最低溫度界限。處于這種溫度條件下的微生物生長速率很低，如果低于此溫度則生長完全停止。不同微生物的最低生長溫度不一樣，這與它們的原生質(zhì)的物理狀態(tài)和化學組成有關(guān)系，也可隨環(huán)境條件而改變。最適生長溫度使微生物迅速生長繁殖的溫度叫最適生長溫度。不同微生物的最適合生長溫度不一樣。應該著重指出：最適合生長溫度不一定是一切代謝活動的最好溫度。其他微生物的試驗也得到了類似的結(jié)果。微生物按其生長溫度范圍可分為低溫微生物、中溫微生物和高溫微生物三類。（一）低溫型微生物又稱嗜冷微生物，可在較低的溫度下生長。它們常分布在地球兩極地區(qū)的水域和土壤中，這里大部分地區(qū)幾乎終年冰凍，即使在其微小的液態(tài)水間隙中也有微生物的

13、存在；它們或者分布在平均溫度為5c左右的海洋中，或分布在只有1-2C的海洋深處；有的分布于冷泉。冷藏食物的腐敗往往由這類微生物引起。低溫微生物可分為專性嗜冷和兼性嗜冷兩種。專性嗜冷微生物的最適生長溫度是15C或更低，最高生長溫度約為20C,可在零度以下甚至零下12c的環(huán)境中生長。它們分布在常冷的環(huán)境中，即使短時受熱以至室溫條件，都會很快被殺死。由于低溫對微生物具有抑制或殺死作用，故低溫保藏食品已是最常用的方法。(二)中溫型微生物絕大多數(shù)微生物屬于這一類。最適生長溫度在20-40C之間，最低生長溫度10-20C,最高生長溫度40-50C。它們又可分為室溫性微生物和體溫性微生物。(三)高溫型微生物

14、它們適于在45-50C以上的溫度中生長，在自然界中的分布僅局限制于某些地區(qū)，如溫朱、日照充足的土壤面、堆肥堆、發(fā)酵飼料等腐爛有機物中，比如堆肥在發(fā)酵過程中溫度常高達60-70C。高溫型微生物能在如此高的溫度下生存和生長，可能是由于菌體內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)比起中溫型微生物更能抗熱，尤其蛋白質(zhì)對熱更穩(wěn)定；同時高溫型微生物的蛋白質(zhì)合成機構(gòu)-核糖體和其他成分對高溫也具較大的抗性；更明顯的是，細胞膜中飽和脂肪酸含量高，它比不飽和脂肪酸可以形成更強的疏水鍵，從而使膜在高溫下能保持其穩(wěn)定性并具正常的功能。如果超過了最高生長溫度則導致微生物死亡。不同微生物的致死溫度不同。但以細菌芽抱抗熱性最強，100c以下處理相當

15、時間才能致死。各種芽抱的抗熱能力不同。高溫致死微生物主要是引起蛋白質(zhì)和核酸不可逆的變性，或者破壞了細胞的其他組成，或者可能因為脂肪膜被熱溶解而形成了極小的孔，使細胞內(nèi)含物泄漏而引起死亡。高溫致死微生物的作用，現(xiàn)已廣泛用于消毒滅菌，高溫滅菌的方法分為干熱與溫熱兩大類。在一溫度下，濕熱滅菌比干熱法好。例如肉毒梭狀芽抱桿菌，采用濕熱滅菌法121c經(jīng)10分鐘即可殺芽抱。如果在干燥狀態(tài)下，用熱空氣殺菌，則需180C10分鐘才能殺死。所以干熱滅菌常采用160-180C經(jīng)1-2小時才能達到完全滅菌的目的。1 .干熱滅菌(1)焚燒滅菌法2 2)干熱滅菌法2.濕熱滅菌(1)煮沸消毒法(2)高壓蒸汽滅菌法(3)間

16、歇滅菌法(4)巴斯德消毒法、氫離子濃度(pH)每種微生物都有其最適pH值和一定的pH范圍。在最適范圍內(nèi)酶活性最高，如果其他條件適合，微生物的生長速率也最高。大多數(shù)細菌、藻類和原生動物的最適pH為6.5-7.5,在pH5-6的酸性環(huán)境，但生存范圍在pH1.5-10之間。有些細菌甚至可在強酸性或強堿性環(huán)境中生活，例如氧化硫桿菌能在pH1-2的環(huán)境中生活，有些硝化細菌能在pH11的環(huán)境下活動。隨著環(huán)境pH值的不斷變化，使得微生物繼續(xù)生長受阻，當超過最低或最高pH值時，將引起培養(yǎng)物的死亡。為了維持微生物生長過程中pH值的穩(wěn)定，不僅配制培養(yǎng)基時要注意調(diào)節(jié)pH值，而且往往還要加入緩沖物。最常用的是弱酸或弱

17、堿的鹽類。同一種微生物由于液的pH值不同，可能積累不同的代謝產(chǎn)物。在不同的發(fā)酵階段，微生物對pH的要求也有差異。三、氧化還原電位微生物生長過程中可能改變周圍環(huán)境中的氧化還原電位。氧化還原電位影響微生物細胞內(nèi)許多酶的活性，也影響細胞的呼吸作用。影響培養(yǎng)基中氧化還原電位的因素很多，分子態(tài)氧的影響（空氣的影響）尤為重要。四、輻射輻射是指通過空氣或外層空間以波動方式從一個地方傳播或傳遞到另一地方的能源。它們或是離子或是電磁波。電磁輻射包括可見光、紅外線、紫外線、X射線和丫射線等。光量子所含能量隨不同波長而改變，一般波長愈長，則所含能量愈低，反之則高。圖6-4示不同波長輻射與殺菌作用的關(guān)系。（一）紫外輻

18、射紫外線是非電離輻射，以波長265-266納米的殺菌力最強。紫外輻射的殺菌效果，因菌種及生理狀態(tài)而異，照射時間和劑量的大小也有影響。干細胞比濕細胞對紫外輻射抗性強，抱子比營養(yǎng)細胞更具抗性，帶色的細胞能更好地抵抗紫外輻射。（二）電離輻射X射線與“射線、3射線和丫射線均為電離輻射。它們的波長很短，有足夠的能量從分子中逐出電子而使之電離。電離輻射效應無專一性。五、干燥水分對于維持微生物的正常生命活動是必不可少的。干燥會導致細胞失水而造成代謝停止以至死亡。不同的微生物種類，干燥時微生物所處的環(huán)境條件，干燥的程度等均影響干燥對微生物的效果。革蘭氏陰性細菌如淋病球菌對干燥特別敏感，幾小時便死去；結(jié)核分枝桿

19、菌又特別耐干燥，在此環(huán)境中，100c20分鐘仍能生存；鏈球菌用干燥法保存幾年而不喪失致病性。休眠抱子抗干燥能力也很強，在干燥條件下可長期不死，這一特性已用于菌種保藏，如常用砂土管來保藏有抱子的菌中。真空干燥法，首先將細胞懸于少量保護劑（例如血清、血漿、肉湯、蛋白月東、脫脂牛乳）溶液中，分裝在安甑內(nèi)，置于零下45CC至零下75c低溫中迅速冰凍，隨即抽成真空，使達到真空干燥狀態(tài)。六、滲透壓七、超聲波超聲波（頻率在20000赫茲以上）具有強烈的生物學作用。超聲波的作用是使細胞破裂，所以幾乎所有的微生物都能受其破壞，其效果與頻率、處理時間、微生物種類、細胞大小、形狀及數(shù)量等均有關(guān)系。八、重金屬及其化合

20、物九、有機化合物對微生物具有害效應的有機化合物種類很多，其中酚、醇、醛等能使蛋白質(zhì)變性，是常用的殺菌劑。十、鹵族元素及其化合物H一、表面活性劑具有降低表面張力效應的物質(zhì)稱為表面活性劑。這類物質(zhì)加入培養(yǎng)基中，可影響細胞的生長與分裂。第三節(jié)化學療劑對微生物的作用能直接干擾原微生物的生長生繁殖并可用于治療感染性疾病的化學藥物即為化學療劑。一、抗代謝物有些化合物在結(jié)構(gòu)上生物體所必需的代謝很相似，以至可以和特定的酶結(jié)合，從而阻礙了酶的功能，干擾了代謝的正常進行，這些物質(zhì)稱為抗代謝物?？勾x種類較多，如葉酶對抗物（磺胺類藥物）、喋吟對抗物（6-疏基口K吟）氨基酸對抗物（5-甲基色氨酸）、口比哆醇對抗物（異煙腫）等?；前奉愃幬飶V泛用于臨床，是由于它們與微生物生長所必需的代謝物對氨基苯甲酸（PABA）間的競爭性抑制作用，細菌生長所必需的對氨基苯甲酸可以自行合成，也可從外界環(huán)境中獲得。若自行合成時，正常情況下，對氨基苯甲酸則和二氫喋咤在二氫葉酸合成酶的作用下，合成