細(xì)胞培養(yǎng)工藝介紹

1、提綱提綱l為什么要培養(yǎng)細(xì)胞為什么要培養(yǎng)細(xì)胞l培養(yǎng)什么樣的細(xì)胞培養(yǎng)什么樣的細(xì)胞l如何培養(yǎng)細(xì)胞及培養(yǎng)過(guò)程的如何培養(yǎng)細(xì)胞及培養(yǎng)過(guò)程的注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)為什么要培養(yǎng)細(xì)胞為什么要培養(yǎng)細(xì)胞生命科學(xué)的基本研究方法生命科學(xué)的基本研究方法l科學(xué)研究需要科學(xué)研究需要細(xì)胞是生物體的最小單位細(xì)胞是生物體的最小單位l工業(yè)生產(chǎn)的需要工業(yè)生產(chǎn)的需要細(xì)胞培養(yǎng)可以獲得我們需細(xì)胞培養(yǎng)可以獲得我們需要的藥物、原料等要的藥物、原料等單克隆抗體單克隆抗體 l市場(chǎng)快速增長(zhǎng)市場(chǎng)快速增長(zhǎng)l08年銷(xiāo)售達(dá)年銷(xiāo)售達(dá)167億美元億美元l已有近已有近20個(gè)產(chǎn)品個(gè)產(chǎn)品l超過(guò)超過(guò)150個(gè)在臨床試驗(yàn)階段個(gè)在臨床試驗(yàn)階段l主要是主要是CHO表達(dá)的，超過(guò)表達(dá)的，

2、超過(guò)50現(xiàn)狀現(xiàn)狀l高需求量：數(shù)千公斤高需求量：數(shù)千公斤l國(guó)外水平：國(guó)外水平：1-10g/Ll國(guó)內(nèi)水平：國(guó)內(nèi)水平：1g/L培養(yǎng)何種細(xì)胞培養(yǎng)何種細(xì)胞l表達(dá)我們目的蛋白的細(xì)胞表達(dá)我們目的蛋白的細(xì)胞處理過(guò)處理過(guò)CHO細(xì)胞細(xì)胞基本概念基本概念lDNA染色體染色體遺傳物質(zhì)遺傳物質(zhì)l基因基因DNA片斷片斷l(xiāng)轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄：DNARNAl翻譯：翻譯：RNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)構(gòu)建表達(dá)特定產(chǎn)物的細(xì)胞株構(gòu)建表達(dá)特定產(chǎn)物的細(xì)胞株l將特定產(chǎn)物的基因引入細(xì)胞中將特定產(chǎn)物的基因引入細(xì)胞中l(wèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)l挑選克隆挑選克隆CHO陽(yáng)性克隆陽(yáng)性克隆將外源基因到入細(xì)胞內(nèi)將外源基因到入細(xì)胞內(nèi)l可選的細(xì)胞可選的細(xì)胞l構(gòu)建的表達(dá)載體構(gòu)建

3、的表達(dá)載體l轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染的方法l克隆的挑選克隆的挑選l表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)常用的表達(dá)細(xì)胞常用的表達(dá)細(xì)胞lCHOlNSOlSP2/0lHybridoma常用的表達(dá)體系常用的表達(dá)體系lGS表達(dá)系統(tǒng)lDHFR表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體的作用表達(dá)載體的作用讓細(xì)胞產(chǎn)生抗性讓細(xì)胞產(chǎn)生抗性同時(shí)表達(dá)目的蛋白同時(shí)表達(dá)目的蛋白谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)載體（谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)載體（GS）l谷氨酰胺是細(xì)胞生命必需物質(zhì)谷氨酰胺是細(xì)胞生命必需物質(zhì)l部分細(xì)胞不能合成谷氨酰胺，或合成不部分細(xì)胞不能合成谷氨酰胺，或合成不足足l載體中含有谷氨酰胺合成酶的基因載體中含有谷氨酰胺合成酶的基因l在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，只有整合在不

4、含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，只有整合了谷氨酰胺合成酶基因的細(xì)胞存活了谷氨酰胺合成酶基因的細(xì)胞存活l加入篩選劑加入篩選劑MSX，增加其表達(dá)量，增加其表達(dá)量二氫葉酸還原酶表達(dá)系統(tǒng)（二氫葉酸還原酶表達(dá)系統(tǒng)（DHFR）lDHFR是合成是合成dATP和和dGTP的關(guān)鍵酶的關(guān)鍵酶 l常用常用DHFR-的的CHO細(xì)胞不能合成四氫葉酸細(xì)胞不能合成四氫葉酸 l含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基l在氨甲酰喋呤（在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下，）存在下，增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白的表達(dá)水平，增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白的表達(dá)水平，使外源基因高效表達(dá)使外源

5、基因高效表達(dá) 轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染方法l脂質(zhì)體：融合細(xì)胞膜脂質(zhì)體：融合細(xì)胞膜l磷酸鈣：形成沉淀，細(xì)胞內(nèi)吞磷酸鈣：形成沉淀，細(xì)胞內(nèi)吞l電穿孔：膜上打孔，自由出入電穿孔：膜上打孔，自由出入為什么要挑選克隆為什么要挑選克隆l穩(wěn)定的種子穩(wěn)定的種子l高效的種子高效的種子l經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的種子經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的種子克隆就是從一個(gè)細(xì)胞增克隆就是從一個(gè)細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群殖形成的細(xì)胞群細(xì)胞篩選方法獲得單克隆細(xì)胞篩選方法獲得單克隆l貼壁培養(yǎng)的克隆形成貼壁培養(yǎng)的克隆形成克隆環(huán)克隆環(huán)ClonePix FLCell Xpressl有限稀釋法單克隆形成有限稀釋法單克隆形成l流式細(xì)胞術(shù)篩選細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)篩選細(xì)胞Re-clonesubclone

6、檢測(cè)手段檢測(cè)手段ldot-blotlELISAlSDS-PAGElWesternlFlow Cytometry Analysisdot-blotl上清l酶連抗體（1步或2步）l顯色劑酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）l夾心法夾心法l包被抗體包被抗體l加上清加上清l酶聯(lián)抗體酶聯(lián)抗體l顯色顯色l讀數(shù)讀數(shù)SDS-PAGEl分子量與泳動(dòng)距離分子量與泳動(dòng)距離lSDS帶電，與蛋白結(jié)合帶電，與蛋白結(jié)合l染色：溴酚藍(lán)、銀染等染色：溴酚藍(lán)、銀染等l定性及定量檢測(cè)定性及定量檢測(cè)Westernl基于電泳基于電泳l轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l抗體及酶（同抗體及酶（同ELISA）l染色或發(fā)光染色或發(fā)光Flow Cytometry Analy

7、sisl抗體與細(xì)胞結(jié)合抗體與細(xì)胞結(jié)合l熒光物質(zhì)連接抗體熒光物質(zhì)連接抗體l激光誘發(fā)熒光激光誘發(fā)熒光l可檢測(cè)上清或細(xì)胞可檢測(cè)上清或細(xì)胞高表達(dá)克隆的確定高表達(dá)克隆的確定l構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體l轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞l單克隆單克隆l上述篩選上述篩選l重復(fù)克隆及篩選重復(fù)克隆及篩選l保留保留35個(gè)克隆個(gè)克隆如何培養(yǎng)細(xì)胞如何培養(yǎng)細(xì)胞無(wú)血清、懸浮培養(yǎng)無(wú)血清、懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的方法培養(yǎng)細(xì)胞的方法l含血清培養(yǎng)含血清培養(yǎng)l無(wú)血清培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)價(jià)格便宜價(jià)格便宜品質(zhì)穩(wěn)定品質(zhì)穩(wěn)定生物污染少生物污染少減輕下游純化負(fù)擔(dān)減輕下游純化負(fù)擔(dān)貼壁變懸浮貼壁變懸浮貼壁貼壁 懸浮懸浮平面平面 立體立體血清替代血清替代l氨基酸氨基酸l維生素

8、維生素l生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子l微量元素微量元素l脂類成分脂類成分無(wú)血清培養(yǎng)基的分類無(wú)血清培養(yǎng)基的分類l無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基l無(wú)蛋白培養(yǎng)基無(wú)蛋白培養(yǎng)基l化學(xué)成分限定型培養(yǎng)基化學(xué)成分限定型培養(yǎng)基l無(wú)血清、無(wú)蛋白、化學(xué)成分限定型培養(yǎng)基無(wú)血清、無(wú)蛋白、化學(xué)成分限定型培養(yǎng)基無(wú)動(dòng)物源性成分無(wú)動(dòng)物源性成分優(yōu)化培養(yǎng)優(yōu)化培養(yǎng)如何優(yōu)化？l細(xì)胞株的選擇細(xì)胞株的選擇l培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)條件優(yōu)化l工藝調(diào)整工藝調(diào)整為什么要優(yōu)化？為什么要優(yōu)化？細(xì)胞株的選擇細(xì)胞株的選擇細(xì)胞株的選擇細(xì)胞株的選擇培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)條件優(yōu)化l主要是培養(yǎng)基的優(yōu)化主要是培養(yǎng)基的優(yōu)化l培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分l培養(yǎng)基的使用方法培養(yǎng)基的使用方法優(yōu)化考察指標(biāo)優(yōu)

9、化考察指標(biāo)生長(zhǎng)狀態(tài)生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)化考察指標(biāo)優(yōu)化考察指標(biāo)生長(zhǎng)曲線 表達(dá)水平優(yōu)化效果優(yōu)化效果工藝控制工藝控制l細(xì)胞狀態(tài)的觀察細(xì)胞狀態(tài)的觀察l工藝參數(shù)的設(shè)定工藝參數(shù)的設(shè)定l液體補(bǔ)充的控制液體補(bǔ)充的控制發(fā)酵模式發(fā)酵模式l批次培養(yǎng)批次培養(yǎng)l補(bǔ)料批次培養(yǎng)補(bǔ)料批次培養(yǎng)l連續(xù)灌注培養(yǎng)連續(xù)灌注培養(yǎng)培養(yǎng)放大培養(yǎng)放大l方瓶l搖瓶l小罐l大罐l優(yōu)化空間優(yōu)化空間培養(yǎng)控制培養(yǎng)控制l攪拌l通氣l營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充培養(yǎng)監(jiān)控培養(yǎng)監(jiān)控lpO2l溫度溫度l生化參數(shù)生化參數(shù)l營(yíng)養(yǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)消耗l表達(dá)監(jiān)控表達(dá)監(jiān)控AU% Composition-0.0100.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.1000.1100.1200.1300.1400.1500.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.00100.00Minutes21.0022.0023.0024.0025.0026.0027.0028.0029.0030.0031.0032.0033.0034.0035.0036.0037