第二章 核酸的結(jié)構(gòu)與功能

1、第第 二章二章 核酸的結(jié)構(gòu)與功能核酸的結(jié)構(gòu)與功能 概述：概述： 1 1、核酸的發(fā)現(xiàn)及命名、核酸的發(fā)現(xiàn)及命名 核酸是脫氧核糖核酸（核酸是脫氧核糖核酸（DNA）與核糖核酸與核糖核酸（RNA）的通稱的通稱 2 2、核酸的分類、分布及生理功用、核酸的分類、分布及生理功用 分分 類類 主要分布主要分布 主要生理功用主要生理功用 DNA 細(xì)胞核細(xì)胞核 遺傳信息的載體遺傳信息的載體 RNA 細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì) 參與蛋白質(zhì)的生物合成參與蛋白質(zhì)的生物合成 3、核酸的水解核酸的水解核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖堿基堿基水水解解基本結(jié)構(gòu)單位基本結(jié)構(gòu)單位*：核苷酸核苷酸；基本組成成分；基本組成成分*：磷酸、戊

2、糖和堿基磷酸、戊糖和堿基一、核酸的化學(xué)組成及特點(diǎn)一、核酸的化學(xué)組成及特點(diǎn)組成核苷酸的元素：，組成核苷酸的元素：，與蛋白質(zhì)相比組成上的兩大特點(diǎn)：與蛋白質(zhì)相比組成上的兩大特點(diǎn)：核酸不含元素，核酸不含元素，核酸中元素的含量多核酸中元素的含量多, 且恒定（）且恒定（） (可用于核酸含量測(cè)定可用于核酸含量測(cè)定)第一節(jié)第一節(jié) 核酸的化學(xué)組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)核酸的化學(xué)組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)(H)HHHOHOHHOCH2H12345OHRAN: -D-核糖核糖DNA: -D-2-脫氧核糖脫氧核糖. 為區(qū)別堿基中的碳原子的為區(qū)別堿基中的碳原子的編號(hào)編號(hào), 戊糖中的碳原子標(biāo)戊糖中的碳原子標(biāo)以以C-1, C-2 . . .1.戊

3、糖戊糖脫氧部位脫氧部位C-2DNA 比比 RNA 穩(wěn)定穩(wěn)定!二、核酸分子中的基本組成成分二、核酸分子中的基本組成成分2. 堿基（堿基（base):嘌呤堿嘌呤堿 (purine)鳥鳥嘌呤嘌呤 (guanine G)腺腺嘌呤嘌呤 (adenine A)嘧啶堿嘧啶堿( (pyrimidinepyrimidine) )胞嘧啶胞嘧啶 (cytosine C)尿尿嘧啶嘧啶( (uracil U)胸腺胸腺嘧啶嘧啶(thymime T)堿基都具有芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)特征（含共軛雙鍵）堿基都具有芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)特征（含共軛雙鍵）嘧啶環(huán)嘧啶環(huán)NN123456嘌呤環(huán)嘌呤環(huán)NNNN234986751 腺腺 嘌嘌 呤呤 ( A)

4、鳥鳥 嘌嘌 呤呤 ( G) NH2NNN NONNN NH2N 胞嘧啶（胞嘧啶（C） 尿嘧啶（尿嘧啶（U） 胸腺嘧啶胸腺嘧啶 （T）NNONH2NNOONNOOCH3小結(jié)：小結(jié)：DNADNA、RNARNA基本組成的異同基本組成的異同* * 戊戊 糖糖 堿堿 基基 磷酸磷酸 DNADNA 脫氧核糖脫氧核糖 A A、G G、C C、T T 磷酸磷酸 RNARNA 核核 糖糖 A A、G G、C C、U U 磷酸磷酸 3、核苷（核苷（nucleoside)nucleoside) 1 1）核苷的定義：堿基與戊糖通過(guò)）核苷的定義：堿基與戊糖通過(guò)糖苷鍵糖苷鍵相相 連而成的化合物。連而成的化合物。 2 2）

5、堿基與戊糖的連接部位）堿基與戊糖的連接部位： 3 3）分類：核糖核苷分類：核糖核苷 脫氧核糖核苷脫氧核糖核苷糖苷鍵糖苷鍵 4 4、核苷酸、核苷酸( (nucleotide)nucleotide) 1 1）定義：核苷與磷酸通過(guò)）定義：核苷與磷酸通過(guò)酯鍵酯鍵相連而成的化相連而成的化 合物合物 2 2）連接部位：戊糖的）連接部位：戊糖的第五位第五位碳上的羥基磷碳上的羥基磷 酸化酸化 3 3）分類：核糖核苷酸分類：核糖核苷酸 脫氧核糖核苷酸脫氧核糖核苷酸 注：一磷酸核苷注：一磷酸核苷 monophosphatemonophosphate (MP) (MP) 二磷酸核苷二磷酸核苷 diphosphate

6、diphosphate (DP) (DP) 三磷酸核苷三磷酸核苷 triphosphatetriphosphate (TP) (TP) 核苷酸的結(jié)構(gòu)核苷酸的結(jié)構(gòu)堿基連接（糖苷鍵）堿基連接（糖苷鍵）酯酯 鍵鍵（對(duì)（對(duì)DNA為為H） 三、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)三、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu) 1 1、定義：、定義：組成組成 DNADNA（或（或RNARNA）的脫氧核苷酸）的脫氧核苷酸 （或核苷酸）的排列順序（或核苷酸）的排列順序 2 2、連接鍵：、連接鍵：3535- - 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 （多核苷酸鏈的方向：（多核苷酸鏈的方向：5353） 3 3、表達(dá)方式：結(jié)構(gòu)式、表達(dá)方式：結(jié)構(gòu)式 線條式線條式 文字式文字式 15

7、5端端3端端CGAA G P5 P T PG PC PT P OH 3 5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 第二節(jié)第二節(jié) DNADNA的空間結(jié)構(gòu)與功能的空間結(jié)構(gòu)與功能 一、一、DNA堿基組成的特點(diǎn)堿基組成的特點(diǎn) 1 1、A+T/G+CA+T/G+C的比值有物種特異性，且物種的比值有物種特異性，且物種 親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，差異越大；親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，差異越大； 2 2、無(wú)組織器官特異性、無(wú)組織器官特異性: : 不同組織器官中不同組織器官中 的的DNA堿基組成相同，而且不因年齡、堿基組成相同，而且不因年齡、 環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)變化而改變；環(huán)境及營(yíng)養(yǎng)變化而改變； 3 3、組成的規(guī)律

8、性：組成的規(guī)律性：DNA分子中四種堿基的分子中四種堿基的 摩爾百分比，即摩爾百分比，即A=T、G=C、A+G=T+CDNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)二、二、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（B型）型） 1 1、反向平行的、反向平行的右手雙螺旋結(jié)右手雙螺旋結(jié) 構(gòu)構(gòu)，螺距為，螺距為 3.43.4nmnm，直徑直徑 為為2.02.0nmnm。每圈每圈1010對(duì)對(duì)堿基，堿基， 存在大溝、小溝存在大溝、小溝2、主鏈位于螺旋外側(cè)，堿基、主鏈位于螺旋外側(cè)，堿基 位于內(nèi)側(cè)。位于內(nèi)側(cè)。3、兩鏈間、兩鏈間A與與T互補(bǔ)形成互補(bǔ)形成兩個(gè)兩個(gè) 氫鍵氫鍵，G與與C互補(bǔ)形成互補(bǔ)形成三個(gè)三個(gè) 氫鍵氫鍵

9、4、螺旋的穩(wěn)定因素為、螺旋的穩(wěn)定因素為氫鍵和氫鍵和 堿基堆砌力堿基堆砌力堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì) DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性DNA雙螺旋分子在空間進(jìn)一步折疊或環(huán)繞雙螺旋分子在空間進(jìn)一步折疊或環(huán)繞成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，即成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，即DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)。（人體每個(gè)體細(xì)胞（人體每個(gè)體細(xì)胞DNA長(zhǎng)長(zhǎng)2m, 細(xì)胞直徑細(xì)胞直徑0.1mm, 細(xì)胞核細(xì)胞核0.05mm）（一）一）DNA 超螺旋超螺旋 原核生物原核生物DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)正正超螺旋超螺旋:盤旋方向與盤旋方向與DNA雙螺旋方向相同雙螺旋方向相同負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋：盤旋方向與盤旋方向與DNA雙螺旋方向相反雙螺旋方向相反超螺旋超

10、螺旋核核小小體體（二）（二）DNA 在真核細(xì)胞內(nèi)的組裝在真核細(xì)胞內(nèi)的組裝四、四、DNA的功能的功能:基因基因：DNA分子中有功能的特定區(qū)段分子中有功能的特定區(qū)段基因組基因組：泛指一個(gè)有生命體、病毒或細(xì)胞器的：泛指一個(gè)有生命體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）染色體（單倍體）DNA。 DNA的基本功能是以的基本功能是以基因基因的形式荷載遺傳信息，的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的信息基礎(chǔ)。的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的信息基

11、礎(chǔ)。 人類的遺傳物質(zhì)是人類的遺傳物質(zhì)是DNA，它的總和就是它的總和就是人類基因組，由大約人類基因組，由大約30億堿基對(duì)組成，億堿基對(duì)組成，分布在細(xì)胞核的分布在細(xì)胞核的23對(duì)染色體中。對(duì)染色體中。 “人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃”的核心，就是測(cè)定的核心，就是測(cè)定人類基因組的全部人類基因組的全部DNA序列序列 2-2.52-2.5萬(wàn)個(gè)基因萬(wàn)個(gè)基因 3737個(gè)基因個(gè)基因4.6 x 104.6 x 109 9堿基對(duì)（堿基對(duì)（bpbp）16.6 x 1016.6 x 103 3堿基對(duì)堿基對(duì)雙鏈線狀雙鏈線狀雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)基因只占結(jié)構(gòu)基因只占3%3%幾乎全是結(jié)構(gòu)基因幾乎全是結(jié)構(gòu)基因基因組學(xué)基因組學(xué)(g

12、enomics)(genomics)就是發(fā)展和應(yīng)用就是發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測(cè)序新制圖、測(cè)序新技術(shù)以及計(jì)算機(jī)程序，分析生命體（包技術(shù)以及計(jì)算機(jī)程序，分析生命體（包括人類）全部基因組括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能。結(jié)構(gòu)及功能。基因組學(xué)的概念基因組學(xué)的概念: :基因組學(xué)包括基因組學(xué)包括3 3個(gè)不同的亞領(lǐng)域個(gè)不同的亞領(lǐng)域 亞領(lǐng)域亞領(lǐng)域 研究?jī)?nèi)容研究?jī)?nèi)容結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué) 整個(gè)基因組的遺傳制圖、物理制整個(gè)基因組的遺傳制圖、物理制 圖、圖、DNA測(cè)序測(cè)序 功能基因組學(xué)功能基因組學(xué) 認(rèn)識(shí)、分析整個(gè)基因組所包含的認(rèn)識(shí)、分析整個(gè)基因組所包含的 基因、非基因序列及其功能基因、非基因序列及其功能 比較基因組學(xué)

13、比較基因組學(xué) 比較不同物種的整個(gè)基因組，增比較不同物種的整個(gè)基因組，增 強(qiáng)對(duì)各個(gè)基因組功能及發(fā)育相強(qiáng)對(duì)各個(gè)基因組功能及發(fā)育相 關(guān)性的認(rèn)識(shí)關(guān)性的認(rèn)識(shí) 轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics） 1.轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄組:是指轉(zhuǎn)錄后的所有是指轉(zhuǎn)錄后的所有mRNA的總稱。的總稱。 2.研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的的 類型類型與與拷貝數(shù)拷貝數(shù)。 3.與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含 了了時(shí)間時(shí)間和和空間空間的限定。的限定。RNA的種類、分布、功能的種類、分布、功能核核蛋蛋白白體體RNA信信使使RNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)RNA核核內(nèi)內(nèi)不不

14、均均一一RNA核核內(nèi)內(nèi)小小RNA胞胞漿漿小小RNA 細(xì)細(xì)胞胞核核和和胞胞液液線線粒粒體體功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核核蛋蛋白白體體組組分分蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)合合成成模模板板轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)氨氨基基酸酸成成熟熟mRNA的的前前體體參參與與hnRNA的的剪剪接接、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)rRNA的的加加工工、修修飾飾蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)內(nèi)內(nèi)質(zhì)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)定定位位合合成成的的信信號(hào)號(hào)識(shí)識(shí)別別體體的的組組分分核核仁仁小小RNA核核蛋蛋白白體體RNA信信使使RNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)RNA核核內(nèi)內(nèi)不不均均一一RNA核核內(nèi)內(nèi)小小RNA胞胞漿漿小小RNA

15、 細(xì)細(xì)胞胞核核和和胞胞液液線線粒粒體體功功能能rRNAmRNA mt rRNAtRNAmt mRNAmt tRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA 核核蛋蛋白白體體組組分分蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)合合成成模模板板轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)氨氨基基酸酸成成熟熟mRNA的的前前體體參參與與hnRNA的的剪剪接接、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)rRNA的的加加工工、修修飾飾蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)內(nèi)內(nèi)質(zhì)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)定定位位合合成成的的信信號(hào)號(hào)識(shí)識(shí)別別體體的的組組分分核核仁仁小小RNA第三節(jié)第三節(jié) RNA的空間結(jié)構(gòu)與功能的空間結(jié)構(gòu)與功能 主要主要RNA的分類及功用的分類及功用 分分 類類 主要功用主要功用 mRNA mRNA 蛋白質(zhì)生物合成的模

16、板蛋白質(zhì)生物合成的模板 tRNAtRNA 氨基酸的搬運(yùn)工具氨基酸的搬運(yùn)工具 rRNArRNA 與蛋白結(jié)合成核蛋白體，為與蛋白結(jié)合成核蛋白體，為 蛋白質(zhì)生物合成提供場(chǎng)所蛋白質(zhì)生物合成提供場(chǎng)所 RNA的總體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的總體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 以單鏈形式存在；局部可形成雙螺旋；堿基以單鏈形式存在；局部可形成雙螺旋；堿基組成比例無(wú)規(guī)律性組成比例無(wú)規(guī)律性一、一、 信使信使RNA（ mRNA）蛋白質(zhì)合成的直接模板蛋白質(zhì)合成的直接模板5端帽子結(jié)構(gòu)端帽子結(jié)構(gòu)（m7GpppNm )3端多聚端多聚 A尾尾 (AAAA)mRNA 前體前體 hnRNA（真核生物）（真核生物）成熟成熟mRNA只有外顯子只有外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子外顯

17、子外顯子真核細(xì)胞真核細(xì)胞 mRNA原核生物的原核生物的mRNA是是多順?lè)醋佣囗樂(lè)醋樱阂粭l：一條mRNA可編碼幾種蛋白質(zhì)?？删幋a幾種蛋白質(zhì)。真核生物的真核生物的mRNA是是單順?lè)醋訂雾樂(lè)醋樱阂粭l：一條mRNA只編碼一種蛋白質(zhì)只編碼一種蛋白質(zhì) 真核生物真核生物mRNAmRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1 1）mRNAmRNA含量少、更新快、分子大小不一含量少、更新快、分子大小不一 2) 2) mRNAmRNA可形成局部雙螺旋結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)?？尚纬删植侩p螺旋結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 3) 3) mRNAmRNA在真核生物中的初級(jí)產(chǎn)物稱為在真核生物中的初級(jí)產(chǎn)物稱為HnRNAHnRNA 4) 5- 4) 5-端

18、有端有7- 7-甲基鳥苷三磷酸甲基鳥苷三磷酸( (m m7 7GTP)GTP)的的帽子帽子 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 5) 3- 5) 3-端有多聚腺苷酸端有多聚腺苷酸( (PolyAPolyA) )尾巴結(jié)構(gòu)尾巴結(jié)構(gòu) 二、二、tRNAtRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1) 1) 分子最小分子最小；大小均一；含有；大小均一；含有稀有堿基最多稀有堿基最多 2) 局部雙鏈形成局部雙鏈形成莖莖- -環(huán)樣結(jié)構(gòu)環(huán)樣結(jié)構(gòu)/ /發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)夾結(jié)構(gòu) 3) 3) 二級(jí)結(jié)構(gòu)：呈二級(jí)結(jié)構(gòu)：呈“三葉草三葉草”型。型。 包括：包括：氨基酸臂氨基酸臂、DHUDHU環(huán)、環(huán)、反密碼環(huán)反密碼環(huán)、附、附 加環(huán)、加環(huán)、 TCTC環(huán)等環(huán)等 4 4）三級(jí)

19、結(jié)構(gòu)：）三級(jí)結(jié)構(gòu)：倒倒“L”L”型型NNHNHNNOCH3CH3NNNHNNHCH2CHCCH3CH3NHNHOOHHHHNHNHSON,N二甲基鳥嘌呤二甲基鳥嘌呤N6-異戊烯腺嘌呤異戊烯腺嘌呤雙氫尿嘧啶雙氫尿嘧啶4-巰尿嘧啶巰尿嘧啶 稀有堿基稀有堿基 tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草形結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)：三葉草形結(jié)構(gòu)氨基酸臂氨基酸臂額外環(huán)額外環(huán)* * tRNAtRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 倒倒L L形形* * t tRNARNA的功能的功能活化、搬運(yùn)氨基活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。白質(zhì)的翻譯。與蛋白質(zhì)結(jié)合形成與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白核蛋白體體成為蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所成為蛋白質(zhì)合

20、成的場(chǎng)所三、核蛋白體三、核蛋白體RNA（ rRNA）：大分子物質(zhì)在超速離心沉降中的一個(gè)大分子物質(zhì)在超速離心沉降中的一個(gè) 物理學(xué)單位，反映分子質(zhì)量的大小物理學(xué)單位，反映分子質(zhì)量的大小S 小亞基小亞基 大亞基大亞基 原核生物原核生物 70S 含：含： 30S 50S 真核生物真核生物 80S 含：含： 40S 60S rRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1 1）rRNA是是含量最多含量最多的的RNA，占總量的占總量的8080。 2 2）rRNA與蛋白質(zhì)構(gòu)成核蛋白體與蛋白質(zhì)構(gòu)成核蛋白體 （由大、小亞基組成）（由大、小亞基組成） 原核生物：原核生物：5 5S, S, 16S, 23S16S, 23S 小

21、亞基含：小亞基含：16S16S 大亞基含：大亞基含：5 5S S和和2323S S 真核生物：真核生物：5 5S S，5.8S5.8S，18S18S，28S28S 小亞基含：小亞基含：18S18S 大亞基含：大亞基含：5.85.8S S，5S5S，28S28S 第四節(jié)第四節(jié) 核酸的理化性質(zhì)、核酸的理化性質(zhì)、 變性和復(fù)性及其應(yīng)用變性和復(fù)性及其應(yīng)用 一一、核酸的一般理化性質(zhì)核酸的一般理化性質(zhì) （一）為兩性電解質(zhì)；呈酸性；分子大，（一）為兩性電解質(zhì)；呈酸性；分子大， 粘度高粘度高 （二）紫外吸收特性：（二）紫外吸收特性： 1 1、最大紫外吸收峰：、最大紫外吸收峰：260260nmnm 2 2、產(chǎn)生原

22、因：、產(chǎn)生原因：堿基中的共扼雙鍵堿基中的共扼雙鍵 3 3、應(yīng)用：定量分析；鑒定純度、應(yīng)用：定量分析；鑒定純度 A260= 1.0 相當(dāng)于相當(dāng)于: 50ug/ml 雙鏈雙鏈DNA 40ug/ml 單鏈單鏈DNA或或RNA 20ug/ml 寡核苷酸寡核苷酸A260/A280 = 1.8 （DNA 純品）純品） = 2.0 （RNA 純品）純品）ODOD260260的應(yīng)用的應(yīng)用* *1. DNA或或RNA的定量的定量2. 2.判斷核酸樣品的純度判斷核酸樣品的純度 三、核酸變性（三、核酸變性（DNA變性）變性） 1 1、定義：定義：在理化因素作用下，在理化因素作用下，DNA雙螺旋雙螺旋 的兩條互補(bǔ)鏈松

23、散而分開(kāi)變成單鏈的過(guò)程。的兩條互補(bǔ)鏈松散而分開(kāi)變成單鏈的過(guò)程。 2 2、變性的因素：高溫（常用）、變性的因素：高溫（常用） 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿強(qiáng)酸、強(qiáng)堿 有機(jī)溶劑等有機(jī)溶劑等 3 3、變性的實(shí)質(zhì)：、變性的實(shí)質(zhì)：氫鍵斷裂氫鍵斷裂（磷酸二酯鍵完好）（磷酸二酯鍵完好） 4 4、主要性質(zhì)改變：、主要性質(zhì)改變： 1 )1 )紫外吸收值增加紫外吸收值增加- -增色效應(yīng)增色效應(yīng) 增色效應(yīng)增色效應(yīng): :指指DNA變性后對(duì)變性后對(duì)260260nmnm紫紫 外光的光吸收度增加的現(xiàn)象。外光的光吸收度增加的現(xiàn)象。 2 )2 )旋光性下降旋光性下降 3 ) 3 ) 粘度降低粘度降低 4 ) 4 ) 原有生物功能部分或全部喪失原

24、有生物功能部分或全部喪失解鏈溫度解鏈溫度OD260TDNA熱變性曲線呈熱變性曲線呈S型型50DNA 變性變性四、四、DNA的熱變性的熱變性 1、定義：將、定義：將DNA稀鹽溶液加熱使之變性的過(guò)程稀鹽溶液加熱使之變性的過(guò)程（melting temperature): = 69.3 + 0.41 (%G+C)(用于小于用于小于20bp的寡核苷酸片段）的寡核苷酸片段）此外此外,Tm大小還與核酸大小還與核酸分子大小分子大小,溶液離子強(qiáng)度有關(guān)溶液離子強(qiáng)度有關(guān)復(fù)性：復(fù)性：變性變性DNA在適當(dāng)條件下可重新配對(duì)，恢復(fù)在適當(dāng)條件下可重新配對(duì)，恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)像的現(xiàn)象。天然的雙螺旋構(gòu)像的現(xiàn)象。退火：退火：熱變性

25、的熱變性的DNA隨著溫度的緩慢降低再重新隨著溫度的緩慢降低再重新形成雙螺旋的過(guò)程。形成雙螺旋的過(guò)程。復(fù)性過(guò)程：成核反應(yīng)復(fù)性過(guò)程：成核反應(yīng)拉鏈反應(yīng)拉鏈反應(yīng) DNA的變性與復(fù)性的變性與復(fù)性 七、核酸雜交七、核酸雜交(hybridization) 1 1、具有一定互補(bǔ)序列的多核苷酸鏈按、具有一定互補(bǔ)序列的多核苷酸鏈按 堿基配對(duì)規(guī)則結(jié)合成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程。堿基配對(duì)規(guī)則結(jié)合成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程。 2 2、結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：有互補(bǔ)序列、結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：有互補(bǔ)序列 3、分類分類： DNA-核酸探針核酸探針 Southern雜交雜交 待測(cè)者待測(cè)者 RNA-核酸探針核酸探針Northern雜交雜交 選用已知順序片段作為探針，經(jīng)放射

26、性同選用已知順序片段作為探針，經(jīng)放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記后，再與未知的位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記后，再與未知的目的核酸鏈進(jìn)行雜交反應(yīng)。目的核酸鏈進(jìn)行雜交反應(yīng)。 通過(guò)標(biāo)記信號(hào)的檢測(cè)對(duì)未知的目的核酸鏈通過(guò)標(biāo)記信號(hào)的檢測(cè)對(duì)未知的目的核酸鏈進(jìn)行進(jìn)行定性、定量定性、定量分析分析。放射性同位素、生物放射性同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記的素或熒光染料標(biāo)記的已知序列的核酸片段已知序列的核酸片段 探針的探針的種類種類: 根據(jù)探針的來(lái)源及核酸性質(zhì)不同根據(jù)探針的來(lái)源及核酸性質(zhì)不同:可分為可分為DNA探針、探針、 cDNA探針、探針、RNA探針及寡核苷探針及寡核苷酸探針等幾類。酸探針等幾類。 根據(jù)標(biāo)記物的不同分為：根

27、據(jù)標(biāo)記物的不同分為： 放射性探針?lè)派湫蕴结槪?2p、35s、3H 非非放射性探針?lè)派湫蕴结?生物素、地高辛、熒光素生物素、地高辛、熒光素 放射性探針?lè)派湫蕴结槪?2p、35s、3H 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏性高、靈敏性高、 特異性高、方法簡(jiǎn)便特異性高、方法簡(jiǎn)便 缺點(diǎn)：半衰期短，必須經(jīng)常標(biāo)記；費(fèi)用高；檢缺點(diǎn)：半衰期短，必須經(jīng)常標(biāo)記；費(fèi)用高；檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)；放射性同位素對(duì)人體有害，實(shí)驗(yàn)室和環(huán)測(cè)時(shí)間長(zhǎng)；放射性同位素對(duì)人體有害，實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境易被污染，放射性廢物處理困難。境易被污染，放射性廢物處理困難。 非非放射性探針?lè)派湫蕴结?生物素、地高辛、熒光素生物素、地高辛、熒光素 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1 1、無(wú)放射性污染；、無(wú)放

28、射性污染； 2 2、穩(wěn)定性好；、穩(wěn)定性好； 3 3、探針可長(zhǎng)時(shí)間保存。、探針可長(zhǎng)時(shí)間保存。 缺點(diǎn)：靈敏度及特異性不高。缺點(diǎn)：靈敏度及特異性不高。 (一一) Southern印跡雜交印跡雜交1、待測(cè)核酸樣品的制備、待測(cè)核酸樣品的制備 （1）裂解或破碎細(xì)胞）裂解或破碎細(xì)胞 （2）抽取純化基因組）抽取純化基因組DNA （3）限制酶消化）限制酶消化DNA為大小不同的為大小不同的DNA片段片段2、待測(cè)、待測(cè)DNA樣品的電泳分離樣品的電泳分離 （1）瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠）瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠分離小片段用高濃度膠 （ 2）凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子）凝

29、膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動(dòng)慢泳動(dòng)慢,小分子小分子DNA泳動(dòng)快，泳動(dòng)快， 大小相同的分子處于同一條帶大小相同的分子處于同一條帶 3、凝膠中核酸的變性（堿變性）、凝膠中核酸的變性（堿變性） 凝膠置于凝膠置于NaOH溶液中使溶液中使DNA變性斷裂為較變性斷裂為較 短的短的單鏈單鏈 DNA。 4、Southern印印跡跡 指將電泳分離的指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過(guò)程相支持物上的過(guò)程 （ 1）常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào) 本底低。缺點(diǎn)是本底低。缺點(diǎn)是DNA

30、分子結(jié)合不牢固分子結(jié)合不牢固 尼龍膜尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈、雙鏈：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈、雙鏈DNA的能力比的能力比 硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高 （2）印跡的常用方法）印跡的常用方法 毛細(xì)管虹吸印跡法毛細(xì)管虹吸印跡法: 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移到固相支持物上。電轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法: 利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到固相支持物上。固相支持物上。真空轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法: 利用真空作用將利用真空作用將凝膠中的凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持轉(zhuǎn)移到固相支持物上。物上。 5、Southern雜交雜交 （1）預(yù)雜交：封閉膜上能與）預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)結(jié)合的位點(diǎn); 預(yù)雜交液為不含預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液探針的雜交液 （ 2）雜）雜 交：液相中的交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)探針與膜上的待測(cè) DNA雜交雜