實驗二 外植體的滅菌與接種

1、1實驗二 外植體的滅菌與接種2 一、實驗?zāi)康?通過實驗，初步掌握外植體植物材料消毒、接種的無菌操作技術(shù)以及外植體愈傷組織誘導(dǎo)和分化的方法。 v二、實驗原理植物組織培養(yǎng)是應(yīng)用無菌操作的方法培養(yǎng)離體的植物器官或組植物組織培養(yǎng)是應(yīng)用無菌操作的方法培養(yǎng)離體的植物器官或組織，甚至單個細(xì)胞的過程?？?，甚至單個細(xì)胞的過程。如果組織培養(yǎng)使用的植物材料是帶菌的，在接種前就必須選擇如果組織培養(yǎng)使用的植物材料是帶菌的，在接種前就必須選擇合適的消毒劑對植物外植體進行表面消毒，獲得無菌材料去進合適的消毒劑對植物外植體進行表面消毒，獲得無菌材料去進行組織培養(yǎng)，這是取得組織培養(yǎng)成功的最基本的前提和重要保行組織培養(yǎng)，這是取得

2、組織培養(yǎng)成功的最基本的前提和重要保證。證。植物細(xì)胞具有全能性，外植體在合適的培養(yǎng)基上，通過脫分化，植物細(xì)胞具有全能性，外植體在合適的培養(yǎng)基上，通過脫分化，形成一種能迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞團形成一種能迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞團愈傷組愈傷組織?？?。植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織和愈傷組織分化的植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織和愈傷組織分化的重要影響因素。重要影響因素。 3v消毒目的：通過表面消毒劑殺死植物材料(外植體)表面微生物,同時要盡可能保持植物材料的生命力。v三、實驗材料、試劑及器具三、實驗材料、試劑及器具(1)材料：材料：煙草葉片(2)試劑及培養(yǎng)基試劑及培養(yǎng)

3、基10% aClO (全班配全班配2000mL)75%乙醇 (全班配全班配2000mL,已配已配)無菌水0.1%新潔爾滅 (全班配全班配2000mL，已配，已配)煙草葉片的培養(yǎng)基煙草葉片的培養(yǎng)基(8組組)(3)器具器具：超凈工作臺、無菌吸水紙、脫脂棉花、標(biāo)簽紙、記號筆、酒精燈、燒杯、鑷子、剪刀、解剖刀等4v四、操作步驟四、操作步驟v培養(yǎng)基、用具滅菌培養(yǎng)基、用具滅菌(實驗一已完成實驗一已完成)打開超凈工作臺紫外燈打開超凈工作臺紫外燈20min,關(guān)燈后要等關(guān)燈后要等20min才能進入實驗室才能進入實驗室進入接種室進入接種室:穿已滅菌工作服穿已滅菌工作服, 換拖鞋換拖鞋,接種接種前前75%酒精或酒精

4、或0.1%新潔爾滅擦手新潔爾滅擦手選取外植體選取外植體自來水沖洗自來水沖洗75%酒精浸泡酒精浸泡30saClO 浸泡15-20min無菌水沖洗無菌水沖洗4-5次次無菌吸水紙吸干無菌吸水紙吸干分割成邊長為分割成邊長為0.81cm的正方形的正方形火焰上方接種火焰上方接種蓋緊瓶蓋蓋緊瓶蓋培養(yǎng)培養(yǎng)在超凈工作臺上進行在超凈工作臺上進行貼標(biāo)簽貼標(biāo)簽清理超凈工作臺清理超凈工作臺5接種注意事項接種前接種前75%酒精或酒精或0.1%新潔爾滅擦手新潔爾滅擦手進入接種室進入接種室:穿已滅菌工作服穿已滅菌工作服, 換拖鞋換拖鞋接種時盡量不要說話接種時盡量不要說話(防交叉污染防交叉污染)不要在接種室來回走動不要在接種室

5、來回走動(防超凈工作臺氣流波動防超凈工作臺氣流波動) 6超凈工作臺的使用超凈工作臺的使用接種前，用接種前，用75酒精棉球或用酒精棉球或用1%新潔爾滅溶新潔爾滅溶液擦拭超凈工作臺臺面液擦拭超凈工作臺臺面將培養(yǎng)基及接種用具放入超凈工作臺臺面將培養(yǎng)基及接種用具放入超凈工作臺臺面打開超凈工作臺紫外燈，照射約打開超凈工作臺紫外燈，照射約2030 min關(guān)閉紫外燈，打開送風(fēng)開關(guān)關(guān)閉紫外燈，打開送風(fēng)開關(guān)通風(fēng)通風(fēng)10 min后后,開日光燈即可進行外植體的消開日光燈即可進行外植體的消毒和接種等無菌操作毒和接種等無菌操作7標(biāo)簽格式標(biāo)簽格式(例例)材料名稱材料名稱:煙草煙草(葉葉)培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基名稱:MS+NAA2mg/L+6-BA1mg/L接種日期接種日期: xxx姓名姓名:xxx8五、觀察記錄五、觀察記錄觀察污染情況觀察污染情況細(xì)菌性污染細(xì)菌性污染:菌斑呈粘液狀菌斑呈粘液狀,接種后接種后1-2天出現(xiàn)天出現(xiàn)真菌性污染真菌性污染:出現(xiàn)不同顏色出現(xiàn)不同顏色(霉菌霉菌),接種后接種后3-10天出現(xiàn)天出現(xiàn)材料發(fā)黃材料發(fā)黃,組織變軟組織變軟,可能是因消毒時間過長可能是因消毒時間過長,組織破壞死亡組織破壞死亡污染率污染率(%)=污染的材料數(shù)污染的材料數(shù)/接種材料總數(shù)接種材料總數(shù)100觀察愈傷組織情況觀察愈傷組織情況愈傷組織出現(xiàn)時間愈傷組織出現(xiàn)時間愈傷組織形態(tài)特征愈傷組織形態(tài)特征v顏色顏色v