SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)及western

1、實驗八實驗八SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE） 1. 1.學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)SDS-PAGESDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理測定蛋白質(zhì)分子量的原理 2.2.掌握垂直板電泳的操作方法掌握垂直板電泳的操作方法 3.3.熟悉蛋白印跡技術(shù)原理和方法熟悉蛋白印跡技術(shù)原理和方法二. 實驗原理 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳:是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉） 1967年，Shapiro等人首先發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素：蛋白大小，形狀和電荷)系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決

2、于蛋白質(zhì)的分子量大?。縎DS的作用 SDS是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負(fù)電荷。因此蛋白質(zhì)在含有強還原劑的SDS溶液中與SDS分子結(jié)合時，可形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種復(fù)合物由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用 因此在電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)分子大小 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15,000200,000之間時，樣品的遷移率與其分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。 符合如下方程式：Lg MW =b m R + K 其中，MW 為蛋白質(zhì)的分子量，m R 為相對遷移率，b為斜率，K為截距。

3、當(dāng)條件一定時，b與K均為常數(shù) 因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可以得出未知蛋白的分子量 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng) 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳

4、分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素/PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進(jìn)行特異性蛋白的半定量實驗操作大致流程圖 1. 1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干, , 準(zhǔn)備準(zhǔn)備2 2個干個干凈的小燒杯凈的小燒杯2.2.把玻璃板在灌膠支架上固定好把玻璃板在灌膠支架上固定好( (放好密封放好密封條和隔離板條和隔離板) ) * *固定玻璃板時，兩邊用力一

5、定要均勻，固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板防止夾壞玻璃板分離膠分離膠( (10% 10ml10% 10ml) )濃縮膠濃縮膠(5% 10ml)(5% 10ml)ddHddH2 2O O4.05ml4.05ml6.8ml6.8ml30%Acr30%Acr3.3ml3.3ml1.7ml1.7mlBufferBuffer1.5mol/L pH=8.8 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5mlTris-HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25mlTris-HCl 1.25ml10%SDS10%SDS

6、100l100l100l100l10%Ap10%Ap50l50l100l100lTEMEDTEMED10l10l10l10l 配配 膠膠 3.按比例配好分離膠,用移液管快速加入（或直接用小燒杯倒入）,大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水（或異丙醇除泡）,靜置至膠凝 * 凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡 * 水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡 * 膠凝好的標(biāo)志：膠與水層之間形成清晰的界面 4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入梳子,靜置到膠凝 * 梳子需一次平

7、穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平 5.拔出樣梳后,拆掉密封條，在內(nèi)槽中加入緩沖液 *用吸瓶將加樣孔內(nèi)和玻璃板下面放密封條位置的氣泡全部排出6.上樣： （1）marker 5l （2）細(xì)胞樣品10 l + 2上樣buffer 10l 共20l 100沸水浴，3-5min ？（蛋白變性） 7. 微量注射器（加樣器）上樣, 上樣量 15l *微量注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高, 樣品下沉?xí)r易發(fā)生擴(kuò)散，溢出加樣孔 8.電泳槽中加入緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳，開始電流恒定在10mA（120V），當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為20mA（180V），溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約數(shù)cm時，停止電泳 9.凝膠板剝離與染

8、色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入考馬斯亮藍(lán)染色染色液，染色1小時左右 10.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰 *剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分 11.實驗結(jié)果分析按下式計算相對遷移率： 每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性五五. .分析計算分析計算= 蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離cm 相對遷移率 蛋白質(zhì)電泳 常用的SDS-PAGE：單一亞基組成的蛋白質(zhì) 非變性PAGE：

9、多個不同亞基組成的蛋白質(zhì) 聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套？ 在不連續(xù)體系SDS-PAGE中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為什么? 電極緩沖液中甘氨酸的作用? 在不連續(xù)體系SDS-PAGE中,分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP,試述其作用? 樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘?濃縮膠的作用 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選Tris/HCL緩沖液，電級液選Tris/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸

10、根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層常見問題及解決辦法常見問題及解決辦法1 1.紋理和拖尾現(xiàn)象：由于樣品溶解不好引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素 2 2.蛋白帶過寬，與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量 3 3.電泳時間比正常要長。可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH

11、和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強度太高 4 4.指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形），說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率所致 5 5.指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向下的曲線形），由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片得凝膠聚和不完全 6 6.凝膠時間不對。通常膠在30min-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂 試劑配制 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）

12、：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中。 4，1-2月（2）10%SDS（十二烷基磺酸鈉）（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl緩沖液：稱取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.8， 最后用蒸餾水定容至100ml（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液：稱取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8， 最后用蒸餾水定容至100ml（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl緩沖液：稱取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.0，最后用蒸

13、餾水定容至100ml （7）10%過硫酸銨(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）樣品溶解液： SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+ 溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。（11）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R250 0.125g，加上述固定液250ml，過濾后備用 （12）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml （13）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：

14、稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml影響因素影響因素 1.溶液中SDS單體的濃度，當(dāng)單體濃度大于1mmol/L時大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單休濃度降到0.5 mmol/L以下時，兩者的結(jié)合比僅為1: 0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別，為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:3 2.樣品緩沖液的離子強度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，通常是10100mmol/L 3.二硫鍵是否完全被還原轉(zhuǎn)膜1 帶手套切2張（L：8.4cm，W：7.6cm）尼龍膜和12張（L：8.2cm，W：7.4c

15、m）的濾紙，并用去離子水浸泡（浸泡時要讓水從下往上慢慢濕透）過午。并用鉛筆在膜上做+/-標(biāo)記。2 在轉(zhuǎn)膜前10min，把膜取出浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中。3 在一托盤中注入500ml左右的轉(zhuǎn)移緩沖液，放入4塊海綿和12張濾紙及轉(zhuǎn)膜所用模具。4 在模具的黑色板上先鋪一塊海綿，接著依次放3張浸濕的濾紙，對齊后，用玻璃棒趕凈氣泡（很關(guān)鍵）。 5 在濾紙上放凝膠，放的時候可加一點緩沖液在凝膠上。2 放好膠后，放尼龍膜。注：尼龍膜一旦放到膠上就不可再作移動，因為這時已有蛋白結(jié)合到膜上。然后，在膜上加一點緩沖液，用玻璃棒盡量使之鋪平 3 在膜上依次放好三張濾紙和海綿后，即可夾好轉(zhuǎn)膜模具。注：每層間都要注意趕氣泡 4

16、 黑對黑，白對紅在電泳槽中放好模具。并加一塊冰在電泳槽中，以防轉(zhuǎn)膜過程中溫度過高，影響轉(zhuǎn)膜效率。5 在用轉(zhuǎn)移緩沖液注滿電泳槽后。紅對紅，黑對黑接好轉(zhuǎn)膜裝置（及電泳裝置）。設(shè)置電泳參數(shù)：60v ，2.5hours麗春紅染色 1. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下轉(zhuǎn)膜裝置，打開夾板，小心用鑷子取出尼龍膜，蛋白面朝上置于10ml 1的麗春紅染液中，搖床上染色10min左右 2. 蛋白面朝上，用去離子水洗3-4次，至紅色基本褪去后，拍照。 3. 再用去離子水洗膜至紅色完全褪去 封閉 取出兩塊膜，用濾紙將殘留液體吸凈后，將兩塊膜的蛋白面相對放入封閉液2. RT，1-2hours 或 4過夜一抗 1 把膜從冰箱中取出，R

17、T ，30min。 注： 封閉液可回收 四個角蘸點水鋪好保鮮膜后，加1：100的一抗500ul（抗體稀釋液495ul+5ul mouse p65抗體）于保鮮膜上 蛋白面朝下，使尼龍膜和一抗充分接觸。注避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡，可用鑷子將膜的四角輕輕提起，排出氣泡蓋上玻璃平皿，RT下孵育2hoursTBST 10min2 ； TBS 10min1二 抗 1.同上鋪好保鮮膜，加1：1000 的二抗1000ul（1ul mouse 抗人IgG-HRP+ 999ul抗體稀釋液）2.同上蛋白面朝下放好尼龍膜，要避免產(chǎn)生氣泡3. 蓋上平皿，同上RT孵育2 hours4. TBST 10min 2 ； TBS

18、 10min1 顯 色 1 鋪好保鮮膜，分別滴加5滴發(fā)光試劑A和B，混合1min2 同上蛋白面朝下放好尼龍膜，要避免產(chǎn)生氣泡。反應(yīng)1min3 用鑷子夾起尼龍膜，用濾紙將多余的發(fā)光試劑吸盡，至沒有液體滴下為止4 將尼龍膜蛋白面朝上置于另外兩塊鋪好的保鮮膜上。用濾紙將膜邊的殘余液體吸凈后，折回保鮮膜，將之放到壓膜用的夾板里 轉(zhuǎn)膜 戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因為手上的油脂會阻斷轉(zhuǎn)移 濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致 以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜5min 方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極 排去濾紙、膠和膜間的氣泡 電轉(zhuǎn)時間：200mA 1-2h,轉(zhuǎn)移結(jié)束后，膜用麗春紅膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置5脫脂奶粉或3BSA （含0.1Tween20 TBS或P