熒光分析法-3

1、第三章 分子熒光分析法16世紀(jì)：在礦物和植物提取液中發(fā)現(xiàn)熒光；1575年：Monardes植物愈創(chuàng)木切片黃色水溶液天蘭色熒光；1852年：Stokes闡明熒光發(fā)射機(jī)制（分光計(jì)觀測(cè)奎寧和葉綠素的熒光，發(fā)現(xiàn)熒光波長(zhǎng)稍長(zhǎng)于入射光的波長(zhǎng)認(rèn)識(shí)到熒光為“重新發(fā)光”而不是漫射光；1905年：Wood發(fā)現(xiàn)氣體分子的共振熒光；1926年:Gaviola直接測(cè)定了熒光壽命；1965年：熒光分析在生物分析中廣泛應(yīng)用；熒光分析法發(fā)展簡(jiǎn)史分子發(fā)光：處于基態(tài)的分子吸收能量（電、熱、化學(xué)和光能等）被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱(chēng)為發(fā)光。發(fā)光分析包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等。 物

2、質(zhì)吸收光能后所產(chǎn)生的光輻射稱(chēng)之為熒光和磷光。熒光產(chǎn)生的基本原理熒光產(chǎn)生的基本原理分子發(fā)光的類(lèi)型分子發(fā)光的類(lèi)型可以按兩種不同的辦法加以分類(lèi),其中一種以激發(fā)的模式加以分類(lèi),另一種是按分子激發(fā)態(tài)的類(lèi)型來(lái)分類(lèi). 按分子激發(fā)態(tài)的類(lèi)型可分為熒光和磷光,熒光:由第一電子激發(fā)單重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象.磷光:由最低的電子激發(fā)三重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象. 按激發(fā)模式分類(lèi),可分為:a.光致發(fā)光:分子因吸收外來(lái)輻射的光子能量被激發(fā)所產(chǎn)生的發(fā)光.b.化學(xué)發(fā)光:分子的激發(fā)能量是由反應(yīng)的化學(xué)能提供.c.生物發(fā)光:分子的激發(fā)能量是由生物體釋放出來(lái)的能量提供.d.熱致發(fā)光:由熱活化的離子復(fù)合激發(fā)模式所

3、引起的發(fā)光現(xiàn)象.e.場(chǎng)致發(fā)光:由電荷注入激發(fā)模式所產(chǎn)生的發(fā)光.f.摩擦發(fā)光:由摩擦激發(fā)模式所產(chǎn)生的發(fā)光.處于單線態(tài)和三線態(tài)下的分子的電子受激發(fā)激發(fā)單重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋仍然配對(duì)，為單重態(tài)，稱(chēng)為激發(fā)單重態(tài)，以S1，S2表示激發(fā)三重態(tài)：分子吸收能量，電子自旋不再配對(duì)為三重態(tài)，稱(chēng)為激發(fā)三重態(tài)，以T1，T2.表示?；鶓B(tài)：電子自旋配對(duì)多重度=2s+1=1，為單重態(tài)，以S0表示。熒光產(chǎn)生的基本原理 處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過(guò)輻射或非輻射躍遷等去活化過(guò)程返回至基態(tài) 。這些過(guò)程包括：1）振動(dòng)弛豫（Vibrational Relaxation, VR） 在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞

4、將能量以熱的形式傳遞給周?chē)姆肿樱瑥亩鴱母哒駝?dòng)能層失活至低振動(dòng)能層的過(guò)程，稱(chēng)為振動(dòng)弛豫。2）內(nèi)轉(zhuǎn)換（Internal Conversion，IC） 對(duì)于具有相同多重度相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過(guò)振動(dòng)耦合產(chǎn)生無(wú)輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。去活化過(guò)程去活化過(guò)程（Deactivation）3）外轉(zhuǎn)換（External Conversion，EC） 受激分子與溶劑或其它分子相互作用發(fā)生能量轉(zhuǎn)換而使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失的過(guò)程，也稱(chēng)“熄滅”或“猝滅”。4）系間跨躍（Intersystem Conversion，I

5、SC） 系間跨躍是發(fā)生在兩個(gè)不同多重態(tài)之間的無(wú)輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當(dāng)不同多重態(tài)的兩個(gè)電子能層有較大重疊時(shí)，處于這兩個(gè)能層上的受激電子的自旋方向發(fā)生變化，即可通過(guò)自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無(wú)輻射躍遷，該過(guò)程稱(chēng)為系間跨躍。5）熒光發(fā)射 分子電子從單重激發(fā)態(tài)（Kasha規(guī)則）的最低振動(dòng)能級(jí)在很短時(shí)間（10-9-10-6s）躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能層時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱(chēng)為熒光。由于各種去活化過(guò)程的存在，熒光輻射能通常要比激發(fā)能量低，或者說(shuō)，熒光波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)（Stokes效應(yīng)）。6）磷光發(fā)射 從單重態(tài)到三重態(tài)分子間發(fā)生系間跨躍躍遷后，再經(jīng)振動(dòng)弛豫回到三重態(tài)最低振動(dòng)能層，最后，在10-

6、4-10s內(nèi)躍遷到基態(tài)的各振動(dòng)能層所產(chǎn)生的輻射。0 0S S光光發(fā)發(fā)射射（低低振振動(dòng)動(dòng)能能層層）1 1T T振振動(dòng)動(dòng)弛弛豫豫（高高振振動(dòng)動(dòng)能能層層）1 1T T系系間間跨跨躍躍1 1S S磷磷熒光的類(lèi)型發(fā)射機(jī)制考慮：瞬時(shí)熒光和遲滯熒光（1）.瞬時(shí)熒光:通常在吸收激發(fā)光后大約10-8s 內(nèi)發(fā)射的,是由激發(fā)過(guò)程中最初生成的S1電子態(tài)所產(chǎn)生的輻射.瞬時(shí)熒光可能由處于S1電子態(tài)的分子或S1激發(fā)態(tài)分子與基態(tài)分子所形成的激發(fā)態(tài)二聚體產(chǎn)生的.低濃度(10-6M)芘溶液,熒光是紫色的,熒光光譜有結(jié)構(gòu)特征高濃度(10-3M)芘溶液,熒光是藍(lán)色的,熒光光譜沒(méi)有結(jié)構(gòu)特征(2).遲滯熒光 物質(zhì)分子在剛性或粘稠介質(zhì)中,

7、除了磷光譜外,還可能觀察到另一種長(zhǎng)壽命的發(fā)射譜帶,但這個(gè)發(fā)射譜帶波長(zhǎng)比磷光譜帶波長(zhǎng)要短.往往把這種長(zhǎng)壽命發(fā)射的譜帶稱(chēng)為遲滯熒光.遲滯熒光分為E-型遲滯熒光,P-型遲滯熒光和復(fù)合熒光三種類(lèi)型.E-型遲滯熒光:處于T1電子態(tài)的分子,經(jīng)熱活化提高能量后而處于S1電子能態(tài),然后自S1電子態(tài)輻射躍遷產(chǎn)生熒光.P-型遲滯熒光: 這類(lèi)熒光,其S1電子激發(fā)分子的布居,是由兩個(gè)處于T1電子態(tài)的分子相互作用時(shí)所引起的,此過(guò)程稱(chēng)為“三重態(tài)-三重態(tài)粒子湮(yan)沒(méi)”,結(jié)果產(chǎn)生一個(gè)激發(fā)單重態(tài)分子.復(fù)合熒光其第一電子激發(fā)單重態(tài)分子的布居，是由自由基離子和電子復(fù)合或具有相反電荷的兩個(gè)自由基離子復(fù)合引起的。熒光的類(lèi)型n比較

8、熒光和激發(fā)光的波長(zhǎng)考慮：n.斯托克斯（stokes)熒光n.反斯托克斯熒光（antistokes)n.共振熒光.斯托克斯（stokes)熒光 在溶液中觀察到的熒光,其發(fā)射的熒光比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng).激發(fā)光熒光分子碰撞引起的能量損失S0S1.反斯托克斯熒光（antistokes) 如果在吸收光子的過(guò)程又附加熱能給予激發(fā)態(tài)分子,則發(fā)射的熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光的波長(zhǎng)短.這種熒光可在高溫的稀薄氣體中觀察到.激發(fā)光熒光吸收熱能S0S1.共振熒光 與激發(fā)光具有相同波長(zhǎng)的熒光,這類(lèi)熒光在氣體和結(jié)晶才有可能發(fā)生. 激發(fā)光熒光S0S1.瑞利散射 如果激發(fā)波長(zhǎng)太長(zhǎng)，其能量不足以使分子中的電子躍遷到電子激發(fā)態(tài)，但能將電子激

9、發(fā)到基態(tài)中較高振動(dòng)能級(jí)。若電子在受激后能量沒(méi)有損失并在瞬間（10-12s)內(nèi)又回到原來(lái)的能級(jí)。于是便在各個(gè)不同的方向發(fā)射出與激發(fā)光波長(zhǎng)相同的輻射。.拉曼散射 被激發(fā)至基態(tài)中較高振動(dòng)能級(jí)的電子,當(dāng)返回到比原來(lái)稍低的振動(dòng)能級(jí)時(shí),便產(chǎn)生波長(zhǎng)略長(zhǎng)于激發(fā)波長(zhǎng)的拉曼散射光.拉曼光的強(qiáng)度遠(yuǎn)比瑞利散射和熒光弱. 熒光譜帶有特征波峰,而拉曼光的波長(zhǎng)是隨激發(fā)光的波長(zhǎng)的改變而改變.熒光的檢測(cè) 光譜特征 任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒（磷）光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜 改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在最強(qiáng)熒（磷）光發(fā)射波長(zhǎng)處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度作圖可得到激發(fā)光譜。 激發(fā)光譜形狀與吸收

10、光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展饽艿倪^(guò)程就是分子的激發(fā)過(guò)程。 激發(fā)光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)；在定量時(shí)，用于選擇最適宜的激發(fā)波長(zhǎng)。發(fā)射光譜 發(fā)射光譜即熒光光譜。一定波長(zhǎng)和強(qiáng)度的激發(fā)波長(zhǎng)輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長(zhǎng)和強(qiáng)度的熒光，以熒光強(qiáng)度對(duì)其波長(zhǎng)作圖可得熒光發(fā)射光譜。 由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。 如右圖所示。i）波長(zhǎng)比較 與激發(fā)（或吸收）波長(zhǎng)相比，熒光發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動(dòng)弛豫失活所致）ii）形狀比較 熒光光譜形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。盡管分子受激后可到達(dá)不同能層的激發(fā)態(tài)，但由于去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫）到第一

11、電子激發(fā)態(tài)的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達(dá)第一激發(fā)態(tài)一樣。 換句話說(shuō)，不管激發(fā)波長(zhǎng)如何，電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系iii）鏡像對(duì)稱(chēng) 通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。 熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層而形成，即其形狀與基態(tài)振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。 吸收光譜是由基態(tài)最低振動(dòng)能層躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。 由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動(dòng)能層分布具有相似性，因而呈鏡像對(duì)稱(chēng)。解釋解釋1：能層結(jié)構(gòu)相似性：能層結(jié)構(gòu)相似性F=2.

12、3FI0bc式中， F是熒光分子的熒光量子產(chǎn)率，I0是入射光強(qiáng)度，代表熒光分子的摩爾吸收系數(shù)，b代表熒光池厚度, c 代表熒光分子的濃度 。條件：溶液的濃度很稀，但是，如果bc0.05時(shí)，則引起熒光猝滅和自吸效應(yīng)，熒光強(qiáng)度與濃度不成線性關(guān)系。熒光強(qiáng)度熒光量子產(chǎn)率及其測(cè)量方法n熒光量子產(chǎn)率，它表示物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的本領(lǐng)。nF1和F2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；F1和F2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的積分熒光強(qiáng)度；A1和A2分別表示待測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)在激發(fā)波長(zhǎng)下的吸光度。(硫酸喹啉在0.05mol/L硫酸中的熒光量子產(chǎn)率為0.55,是測(cè)量熒光量子產(chǎn)率時(shí)經(jīng)常使用的一種參照物.)

13、熒光與結(jié)構(gòu)的關(guān)系n分子的電子結(jié)構(gòu)n1.鍵n沿核間連線方向由電子云重疊而形成的化學(xué)鍵稱(chēng)為鍵. 鍵可分為共價(jià)鍵和配位鍵兩種,共價(jià)鍵的兩個(gè)電子分別來(lái)自?xún)蓚€(gè)原子,配位鍵的兩個(gè)電子來(lái)自同一原子而后由兩個(gè)原子共享.(頭對(duì)頭)n2.鍵n當(dāng)兩個(gè)原子的軌道(p軌道)從垂直于成鍵原子的核間連線方向接近,發(fā)生電子云的重疊而成鍵.(肩并肩)3.未成鍵電子(n電子)n在元素周期表中,有些元素的原子,其外層電子數(shù)多于4(如N,S和O),他們?cè)诨衔镏型形磪⑷氤涉I的價(jià)電子,這些電子稱(chēng)為n電子.如右圖甲醛的成鍵情況.4反鍵軌道n物質(zhì)的分子,除了組成化學(xué)鍵的那些能量低的分子軌道外,每個(gè)分子還有一系列能量較高的空軌道.這些空

14、軌道稱(chēng)為反鍵軌道. 有機(jī)分子中的價(jià)電子排列在能量不同的軌道上.這些軌道的能量高低順序?yàn)?軌道軌道 n軌道*軌道 *軌道有機(jī)試劑結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系當(dāng)分子因吸光而被激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)后, 他可能以一系列的不同途徑失去本身過(guò)剩的能量而返回電子基態(tài),這些途徑有:a.發(fā)射熒光b.非輻射衰減(內(nèi)轉(zhuǎn)換)c.光化學(xué)反應(yīng)躍遷類(lèi)型：通常，具有*及n*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才會(huì)產(chǎn)生熒光。而且具*躍遷的量子效率比n*躍遷的要大得多。強(qiáng)熒光物質(zhì)往往具有如下特征:a.具有大的共軛結(jié)構(gòu).b.具有剛性的平面結(jié)構(gòu)c.具有最低的單線電子激發(fā)態(tài)S1為1,1型d.取代基團(tuán)為給電子基團(tuán)分子共軛體系大小對(duì)熒光的影響共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強(qiáng)分子

15、共軛體系大小對(duì)熒光的影響共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光越強(qiáng)分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。共軛大鍵共平面及其剛性的影響聯(lián)苯(2)由鍵連接，兩個(gè)苯環(huán)由于立體結(jié)構(gòu)效應(yīng)或空間位阻不能共平面，處于最大自由度， F是0.18。芴(1)相當(dāng)于由一個(gè)-CH2-把聯(lián)苯的兩個(gè)苯環(huán)固定在一個(gè)平面上，不扭動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)，其共平面性比聯(lián)苯大，而且剛性強(qiáng)， F接近于1。聯(lián)苯芴共軛大鍵共平面及其剛性的影響分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。熒光素(3)比酚酞（4）多了一個(gè)氧橋（-O-)，熒光素在溶液中的熒光很強(qiáng)（

16、0.1M NaOH, F=0.97）酚酞(4)無(wú)熒光熒光素酚酞共軛大鍵共平面及其剛性的影響分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的三苯甲烷類(lèi)染料，羅丹明B(5) (乙醇介質(zhì)，F(xiàn)=0.97）亮綠(6)無(wú)熒光羅丹明亮綠共軛大鍵共平面及其剛性的影響分子剛性（Rigidity）越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高。取代基的影響給電子取代基增強(qiáng)熒光（p-共軛），如-OH、-OR、 -NH2、-CN、NR2等；吸電子基降低熒光，如 -COOH、 -C=O、 -NO2、-NO、-X等；取代基的影響重原子降低熒光但

17、增強(qiáng)磷光，如苯環(huán)被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現(xiàn)象也稱(chēng)重原子效應(yīng)。重原子的取代化學(xué)環(huán)境的影響（1）.溫度的影響（2）.溶劑效應(yīng)（3）.pH值影響（4）.重原子效應(yīng)（5）.溶解氧效應(yīng)（1）.溫度的影響不同溫度下鄰菲羅啉的熒光光譜(在聯(lián)苯中) 1. 24; 2. -78;3. -150; 4. -168; 5. -196(oC)熒光量子產(chǎn)率與溫度的關(guān)系A(chǔ).羅丹明的甘油溶液B.硫酸鈾酰的硫酸溶液大多數(shù)熒光物質(zhì)的熒光效率和強(qiáng)度隨著溫度升高而降低.因?yàn)闇囟鹊纳咴黾恿朔肿拥膬?nèi)部能量轉(zhuǎn)化.溫度升高溶液中沒(méi)有猝滅劑熒光量子產(chǎn)率的數(shù)值與輻射過(guò)程和非輻射過(guò)程的相對(duì)速率有關(guān).輻射過(guò)程的速率與溫度

18、無(wú)關(guān),因此熒光量子產(chǎn)率的變化反映了非輻射躍遷過(guò)程速率的改變.溶液溫度降低 ,介質(zhì)粘度增大 ,熒光分子與溶劑分子的碰撞猝滅機(jī)會(huì)減小 ,熒光強(qiáng)度增大 .溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響比較復(fù)雜,此時(shí)因溫度對(duì)分子的擴(kuò)散,活化,分子內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化和溶液中各種平衡都有一定的影響.如猝滅劑與熒光物質(zhì)分子之間的碰撞,則熒光強(qiáng)度隨溫度升高而降低.或者這兩種分子形成復(fù)合物也會(huì)使熒光強(qiáng)度隨溫度升高而降低.溶液中含有猝滅劑（2）.溶劑效應(yīng)熒光體吸收和再發(fā)射之間存在一定的能量損失,從而產(chǎn)生斯托克斯位移.此種現(xiàn)象是由振動(dòng)弛豫,激發(fā)態(tài)熒光體偶極矩的改變引起的周?chē)軇┓肿又须娮拥闹嘏?溶劑分子圍繞激發(fā)態(tài)偶極的重新定向和熒光體與溶劑分子之

19、間的特殊作用.溶質(zhì),溶劑分子間的相互作用,是偶極子間的靜電作用,氫鍵,電荷轉(zhuǎn)移等因素能改變熒光分子的量子產(chǎn)率.Ru(phen)2(dppz)2+在幾種代表性的溶劑中的發(fā)光光譜.Ru(phen)2(dppz)2+（3）.pH值影響 如果熒光物質(zhì)是一種弱酸或弱堿,溶液的pH改變將對(duì)熒光強(qiáng)度產(chǎn)生較大的影響. 在金屬離子測(cè)定中,溶液pH的改變將會(huì)影響到金屬離子與有機(jī)試劑所生成的熒光配合物的穩(wěn)定性以及配合物的組成,并進(jìn)一步影響它們的熒光性質(zhì). 在pH3-4,如Ca2+與2,2-二羥基偶氮苯形成1:1配合物,發(fā)熒光. 在pH6-7,如Ca2+與2,2-二羥基偶氮苯形成1:2配合物,無(wú)熒光.（4）.重原子效

20、應(yīng) 往熒光物質(zhì)中加入Br-, I-等鹵素離子的水溶液，則造成熒光猝滅,稱(chēng)為“外部重原子效應(yīng)”. 此種現(xiàn)象被認(rèn)為是鹵素與熒光分子形成弱的電荷轉(zhuǎn)移型絡(luò)合物,加大了系間竄躍(S1 T1 )而產(chǎn)生的.a.外部重原子效應(yīng)表 金屬-8-羥基喹啉絡(luò)合物的重原子效應(yīng)在熒光性金屬配合物中,隨著中心金屬離子的原子序號(hào)從小到大的變化,同樣會(huì)引起熒光強(qiáng)度減弱,磷光強(qiáng)度增強(qiáng)的現(xiàn)象,稱(chēng)為“內(nèi)部重原子效應(yīng)”. 下表列出了8-羥基喹啉衍生物的金屬絡(luò)合物的熒光量子產(chǎn)率與中心金屬離子的原子序號(hào)的關(guān)系.原子序號(hào)增加,熒光強(qiáng)度降低,Tl則不產(chǎn)生熒光.b.內(nèi)部重原子效應(yīng)溶解在溶液中的氧往往會(huì)降低熒光體的熒光強(qiáng)度。特別是芳烴化合物如萘和

21、蒽等的熒光性會(huì)被氧猝滅.但是,對(duì)于不同的熒光體其影響程度是不同的.如沒(méi)有取代基的芳烴化合物,溶解氧的猝滅作用大,含取代基芳烴或雜環(huán)化合物,氧分子幾乎沒(méi)有猝滅作用.有人認(rèn)為可能是由于三重態(tài)的氧分子和激發(fā)單重態(tài)的熒光物質(zhì)分子相碰撞,形成了激發(fā)單重態(tài)的氧分子和三重態(tài)的熒光物質(zhì)分子而引起的.也有人認(rèn)為氧分子的順磁性增加了自旋軌道的相互作用,從而助長(zhǎng)了系間交叉竄躍(S1 T1, T1 S1)（5）.溶解氧效應(yīng)解釋溶劑的瑞利散射，容器表面的散射光和膠粒的散射光的波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)相同。散射光和拉曼光的影響1/ex-1/x=0.338x對(duì)應(yīng)峰就是拉曼散射峰拉曼散射峰的位置隨激發(fā)波長(zhǎng)的改變而變化,是可以預(yù)測(cè)和計(jì)算

22、出來(lái)的.Ru(phen)2(dppz)2+-DNA 的激發(fā)-發(fā)射光譜(ex=453nm). a.Ru(phen)2(dppz)2+溶液b. Ru(phen)2(dppz)2+-DNA溶液 453nm598nm535nm波數(shù) 波長(zhǎng)的倒數(shù),每厘米長(zhǎng)度內(nèi)含有 波長(zhǎng)的數(shù)目,單位cm-1.波數(shù)的換算關(guān)系如右圖,哪一個(gè)發(fā)射峰為拉曼散射峰?/cm-1=1/(,cm)=104/(,m)1cm=104 m, 1 m=103nm453=453nm=0.453 m 598=598nm=0.598 m535=535nm=0.535 m1/453=1/0.453 m=2.2075m-11/598=1/0.598 m=1

23、.6722 m-1 1/535=1/0.535m=1.8692 m-1 1/ex- 1/598 =2.2075-1.6722=0.5353 m-1 1/ex- 1/535=2.2075-1.8692=0.3383 m-1 結(jié)論:535nm 處的發(fā)射峰為拉曼散射峰!1/ex-1/x=0.3381/x = 1/ex- 0.338x = 1/(1/ex- 0.338)注意! 1/ex和1/x的單位是m-1!如何得到拉曼散射峰?如果激發(fā)波長(zhǎng)是480nm,拉曼散射峰是多少?x = 1/(1/ex- 0.338) =1/(1/0.48 -0.338) =1/(2.083 -0.338) =1/1.745 =0.573m =573nm結(jié)論:拉曼散射峰是573nm.如果激發(fā)波長(zhǎng)是500nm,拉曼散射峰是多少?熒光儀器的主要組件1.激發(fā)光源： 常用的光源有氙燈和汞燈理想化的光源應(yīng)具備：.足夠的強(qiáng)度.在紫外-可見(jiàn)光區(qū)級(jí)有連續(xù)的光譜.它的強(qiáng)度與波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，即光源的輸出應(yīng)有連續(xù)平滑等強(qiáng)度的輻射。.光強(qiáng)要穩(wěn)定2.單色器：濾光片，棱鏡或光柵3.檢測(cè)器：光電倍增管或光子計(jì)數(shù)器4.樣品池