實驗8SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量

1、實驗8 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子量Mr原理 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的遷移率取決于它所帶凈電荷及分子的大小和形狀。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate,簡稱SDS）和還原劑（如巰基乙醇）處理蛋白質(zhì)樣品，則蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵被還原，1g蛋白質(zhì)可定量結(jié)合1.4g SDS。由于SDS呈解離狀態(tài)，使蛋白質(zhì)亞基帶上大量的負(fù)電荷，其數(shù)值大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物表現(xiàn)出相等的電荷密度，在聚丙烯酰胺凝膠上電泳時，它們純粹按照分子的大小由凝膠

2、的分子篩效應(yīng)來進行分離，有效遷移率與相對分子量的對數(shù)成很好的線性關(guān)系。用這種方法測定蛋白質(zhì)的Mr，簡便、快速，只需要廉價的設(shè)備和g量的蛋白質(zhì)樣品。所得的結(jié)果，在Mr范圍內(nèi)，與用其他方法測得的Mr相比，誤差一般在10%以內(nèi)。因此SDS測定Mr的方法，已得到非常廣泛的應(yīng)用和迅速的發(fā)展。現(xiàn)在經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠研究過的蛋白質(zhì)已經(jīng)有很多種了。 實驗證明，在蛋白質(zhì)溶液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵；SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。在一定的條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋

3、白質(zhì)。由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電，使各種蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類的蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。 在用SDS-凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的Mr時，應(yīng)注意以下幾個問題：1. 如果蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物不能達到1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)的比率并具有相同的構(gòu)象，就不能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。影響蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合的因素主要有以下3個：二硫鍵是否完全被還原：只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原的情況下，SDS才能定量地結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上去，并使之具有相同的構(gòu)象。一般以巰基乙醇作為還原劑。在有些情況下，還需要進一步將形成的巰基烷基化，以免在電泳過程中

4、重新氧化而形成蛋白質(zhì)聚合體。溶液中的SDS濃度：溶液中SDS的總量，至少要比蛋白質(zhì)的量高3倍，一般需達10倍以上。溶液的離子強度：溶液的離子強度應(yīng)很低，最高不能超過0.26，因為SDS在溶液中是以單體和分子團的混合體而存在的，SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量，僅決定于平衡時SDS單體的濃度而不是總濃度，在低離子強度的溶液中，SDS具有較高的平衡濃度。2. 不同的凝膠濃度適用于不同的Mr范圍，Weber 的實驗指出，在5%的凝膠中，Mr25000200000的蛋白質(zhì)，其Mr的對數(shù)與遷移率呈直線關(guān)系；在10%的凝膠中，1000070000Mr蛋白質(zhì)呈直線關(guān)系；在15%的凝膠中，1000050000Mr

5、的蛋白質(zhì)呈直線關(guān)系；3.33%（以上各種濃度的凝膠，其交聯(lián)度都是2.6%）的凝膠可用于Mr更高的蛋白質(zhì)。 可根據(jù)所測Mr范圍選擇最合適凝膠濃度，并盡量Mr范圍和性質(zhì)與待測樣品相近的蛋白質(zhì)做標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率（蛋白質(zhì)的電泳遷移距離除以染料遷移距離即為相對遷移率）最好在0.20.8之間均勻分布。 在凝膠電泳中，影響遷移率的因素較多，而在制膠和電泳過程中，很難每次都將各項條件控制的完全一致，因此，用SDS-凝膠電泳法測定Mr，每次測定樣品必須同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而不得利用另一次電泳的標(biāo)準(zhǔn)曲線。3. 有許多蛋白質(zhì)，由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS與

6、巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-凝膠電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的Mr而不是完整分子的Mr。為了得到更全面的資料，還必須用其他方法測定其Mr及分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS-凝膠電泳的結(jié)果相對照。4. 不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳法測定其Mr，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測出的Mr是不可靠的.這些蛋白質(zhì)有：電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì),帶有較大輔基的蛋白質(zhì)(如某些糖蛋白)以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。例如組蛋白F1，它本身帶有大量的正電荷，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，她Mr是21000，但SDS-凝膠電泳測得

7、的結(jié)果卻是35000。因此在分析SDS-凝膠電泳所測得的結(jié)果時，應(yīng)該小心。一般至少用兩種方法來測定未知樣品的Mr，互相驗證。為了判斷待測樣品是否可用SDS-凝膠電泳法來測定Mr，也可使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在不同濃度（交聯(lián)度相同）的SDS凝膠中電泳，得到Ferguson圖。如果待測樣品的自由遷移率m0與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的m0基本交于一點，而且在不同濃度的SDS-凝膠中測得的Mr都相同，則表明此蛋白質(zhì)在SDS-凝膠電泳中的行為是正常的，可以用SDS-凝膠電泳法測定其 Mr。 現(xiàn)在常用做SDS-凝膠電泳的緩沖系統(tǒng)有好幾種，有連續(xù)系統(tǒng)的也有不連續(xù)系統(tǒng)的。操作方法一 貯液及凝膠溶液的配置方法，參照聚丙烯酰胺凝

8、膠電泳中的貯液配制方法，只是在分離膠和濃縮膠液中加入SDS，使SDS的濃度達到0.4%，電極緩沖液中SDS濃度達到1mg./ml,樣品緩沖液中的SDS濃度為2g/100ml. SDS-凝膠電泳可采用垂直柱型，也可采用垂直板型。由于垂直板型電泳操作方便，樣品泳動的起點一致，便于對樣品的分離情況做比較，目前大多采用此型。二 樣品的制備 一般是將樣品溶解在含1%SDS、1%巰基乙醇的0.01mol/L,pH7.2的磷酸緩沖液中，在100加熱25分鐘。蛋白質(zhì)的最后濃度一般為0.051mg/ml。 也可以將上述溶液在37保溫2小時而不是100加熱。一般說來，兩種處理的結(jié)果都一樣。但如果蛋白質(zhì)樣品中混有少

9、量蛋白水解酶，37保溫處理就會引起樣品的水解，使測定失敗，而100加熱3分鐘一般都能使蛋白酶失活，得到滿意的結(jié)果。也有少數(shù)例外的情況，需采用特殊的樣品處理方法。1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的制備 稱取細(xì)胞色素c、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、卵清蛋白、牛血清清蛋白各0.2mg左右，分別放入小試管中，按0.5mg/ml溶液的比例，向樣品中加入“樣品溶解液”（見試劑的配制），使充分溶解，輕輕蓋上軟木塞（不要蓋緊，以免加熱時迸出），將小試管放入沸水浴中加熱3分鐘，取出冷至室溫。2. 待測蛋白質(zhì)樣品的制備 固體樣品的制備與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相同。 如待測樣品已在溶液中，可先配制“濃樣品溶解液”（各種溶質(zhì)的濃度均比“樣品溶

10、解液”高1倍，將待測液與“濃樣品溶解液”等體積混勻，然后同上加熱。若待測溶液太稀可事先濃縮：若溶液的含鹽量太高，則需先行透析。 處理好的樣品即可用于電泳。每個凝膠樣品孔內(nèi)加5g蛋白質(zhì)（或更少）便可得到清晰的區(qū)帶。 處理好的樣品溶液可在冰箱中保存較長的時間，使用前在100水浴中加熱1分鐘，以除去可能出現(xiàn)的亞穩(wěn)態(tài)聚合物。三 電泳 將聚合好的凝膠連同制膠模具裝置在電泳槽上，拔掉樣品槽模板（梳子），用電泳緩沖液清洗樣品孔，然后將上下電極槽注滿緩沖液，檢查上槽無泄露，即可加樣。 用微量注射器按號向凝膠樣品孔中加樣，沒孔加20l（含蛋白質(zhì)15g），稀的樣品可適量增加其體積。 加樣完畢后，打開直流穩(wěn)壓電源（

11、負(fù)極接上槽，正極接下槽，事先接好），將電流調(diào)至5080mA（根據(jù)凝膠板的橫截面積適當(dāng)調(diào)節(jié)增減），保持電流強度不變，待染料（染料已事先加在“樣品溶解液“中）遷至距凝膠下端約1cm處，停止電泳。四 染色、脫色 將凝膠取出，滑入一白瓷盤或大培養(yǎng)皿中，在染料區(qū)的中心插入細(xì)銅絲做為標(biāo)志，加入染色液，染色1小時左右。傾出染色液，用蒸餾水洗凝膠數(shù)次后加入脫色液，數(shù)小時換液一次，直至背景清晰。五 Mr的計算 通常以相對遷移率mR來表示遷移率，相對遷移率的計算方法如下： 用直尺分別量出樣品區(qū)帶中心及銅絲與凝膠頂端的距離見圖3，按下式計算： 相對遷移率mR=樣品遷移距離(cm)/染料遷移距離（cm） 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)

12、Mr的對數(shù)對相對遷移率做圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，根據(jù)待測樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其Mr。 圖3、4試劑和器材試劑 1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（純品）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)來源Mr細(xì)胞色素c馬心12500胰凝乳蛋白酶原牛胰25000胃蛋白酶豬胃35000卵清蛋白雞卵43000牛血清清蛋白牛血清670002. 0.2mol/l,pH7.2磷酸鹽緩沖液：取280ml 0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液，加入720ml0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液，混勻后調(diào)pH至7.2。此溶液用來進一步配置凝膠緩沖液、電極緩沖液和樣品溶解液。3.樣品溶解液：0.01mol/ L,pH7.2磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1%SDS，1%巰基

13、乙醇，10%甘油，0.02%溴酚藍。用來溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測蛋白質(zhì)樣品。配制方法如下： SDS 100mg 巰基乙醇 0.1ml 甘油 1ml 溴酚藍 2mg 試劑2 0.5ml 加蒸餾水至總體積 10ml4.電極緩沖液：0.1%SDS，0.1mol/L,pH7.2磷酸鹽緩沖液（或Tris-HCl緩沖液）：取1g SDS，加入500ml試劑2，用蒸餾水定容到1000ml.5.染色液：0.25g考馬斯亮藍R250，加入454ml 50%甲醇和46ml冰乙酸。6.脫色液：75ml冰乙酸，875ml蒸餾水與50ml甲醇混合。7.SDS：市售化學(xué)純SDS需要結(jié)晶后使用。重結(jié)晶的方法如下：稱取20gSD

14、S，放入50ml圓底燒瓶中，加約半牛角匙活性炭及300ml無水乙醇，攪拌，搖勻。燒瓶上接一個小冷凝管。在水浴上加熱到乙醇微沸，回流約10分鐘，用熱過濾漏斗趁熱過濾。濾液應(yīng)是無色透明。濾液冷至室溫后，移至20冰箱中過夜。次日，通過預(yù)冷的布氏漏斗抽濾，用少量20無水乙醇洗沉淀3次，盡量抽干，將結(jié)晶置真空干燥器中干燥或40以下烘箱烘干。簡明操作方法1.將成套的兩塊玻璃板正確防如硅膠條中，然后夾在電泳槽中，按對角線順序旋緊螺絲， 注意用力均衡以免夾碎玻璃。安裝好電泳槽后，用1.5%瓊脂封底，待瓊脂凝固后即可制 膠。2. 將已經(jīng)配制好的分離膠液輕輕混勻后，灌入玻板膠腔中至適當(dāng)高度，表面加一薄層蒸餾水或雙

15、蒸水封閉膠液表面。開始加入水后，會在凝膠液和水之間形成分界線，在聚合過程中，分界線會逐漸消逝，待分界面再次出現(xiàn)時，說明分離膠已經(jīng)聚合完全。3. 待分離膠聚合后，倒掉表面的水，再將配制好的濃縮膠輕輕混勻后灌滿玻璃板膠腔，迅速插入樣品梳，靜置聚合。4. 待測樣品用樣品緩沖液制成0.51.0mg/ml左右的溶液，在沸水浴中加熱34分鐘，冷卻后點樣。5. 濃縮膠聚合后，拔掉樣品梳，裝好電泳槽，在上下槽中注入電極緩沖液，用微量注射器點樣，每個樣品槽中點樣2040l。如果樣品濃度太低，可以適當(dāng)加大點樣量。6. 上槽為負(fù)極，下槽為正極，連接好電泳儀電源，用恒壓（100V）或恒流（30mA）左右電泳，也可以在樣品通過濃縮膠后，加大電壓到250V進行電泳。當(dāng)指示劑染料溴酚藍到達凝膠前沿還有12cm時停止電泳，倒掉電極緩沖液(上槽中的電極緩沖液還可重復(fù)利用，可以對它進行回收),剝膠染色。7. 剝膠后用蒸餾水洗滌