實(shí)驗(yàn)二 過(guò)氧化氫的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)二：植物組織過(guò)氧化氫含量的測(cè)定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 掌握植物組織中過(guò)氧化氫含量的定量測(cè)定原理2. 了解H2O2對(duì)植物大分子物質(zhì)的損害機(jī)理二、 實(shí)驗(yàn)原理植物組織內(nèi)積累的H2O2 是由一些氧化酶（主要是超氧化物歧化酶SOD）催化超陽(yáng)陰離子發(fā)生氧化反應(yīng)而形成。H2O2相對(duì)超陽(yáng)陰離子性質(zhì)較穩(wěn)定，但還是一種催化劑，它的存在可以直接或間接地導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化損害，加速細(xì)胞衰老和解體。同時(shí)也有積極地一面，如參與植物抗病性和抗逆性的啟動(dòng)和誘導(dǎo)性過(guò)程。因此，了解植物組織中H2O2的代謝具有重要意義。H2O2與硫酸鈦（或四氯化鈦）反應(yīng)生成過(guò)氧化物鈦復(fù)合物黃色沉淀，溶解于硫酸后，在波長(zhǎng)410nm出有最大吸收峰，

2、可以進(jìn)行比色測(cè)定。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與H2O2濃度成線性關(guān)系 TiSO4 + NH3 + H2O2 O2-TiSO4 (TiO2）+ H2O2 TiO(H2O2)22 + H2SO4三、 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備和試劑1. 實(shí)驗(yàn)材料：雀麥葉片（經(jīng)過(guò)冰凍的和未經(jīng)冰凍的）2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備：研缽、離心管、離心機(jī)、試管、容量瓶、分光光度計(jì)等等3. 實(shí)驗(yàn)試劑： 4°條件下處理的丙酮 5umol/ml H2O2 濃氨水 5% TiSO4 2mol/L H2SO4四、 操作步驟1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 取7支試管，編號(hào)1-7，在通風(fēng)櫥中向各試管加入表1所列試劑，混勻，充分反應(yīng)后會(huì)有沉淀形成，5000r/min

3、,離心5min。留沉淀，棄上清液，并向各試管沉淀中加入2mol/L H2SO4 5ml，搖動(dòng)，使沉淀完全溶解。以1號(hào)試管對(duì)照調(diào)零，波長(zhǎng)410nm處比色測(cè)定溶液的吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，過(guò)氧化氫物質(zhì)的量為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖一）。表1 H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑加入量項(xiàng)目管號(hào) 1 2 3 4 5 6 75umol/ml H2O2/ml 00.10.20.4 0.6 0.8 1.04°預(yù)冷丙酮/ml 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0濃氨水/ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 5% TiSO4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

4、 0.1相當(dāng)于H2O2的物質(zhì)的量/umol 0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.02. 測(cè)定樣品中過(guò)氧化氫的量稱取樣品3g，加入3ml預(yù)冷的丙酮，在通風(fēng)櫥中冰浴條件下（由于氣溫低，可以不必使用冰?。┭心コ蓜驖{后，靜置片刻，加丙酮定容至5ml，5000r/min,離心5min。留上清液，并取上清液1ml，加入5% TiSO4 0.1ml，濃氨水0.2ml，出現(xiàn)沉淀后加入2mol/L H2SO4 5ml使之充分溶解，然后進(jìn)行比色測(cè)定。五、 結(jié)果處理 根據(jù)溶液吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的過(guò)氧化氫的物質(zhì)的量，表示單位為鮮重，計(jì)算公式：過(guò)氧化氫含量（umol/g鮮重）=其中n為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得

5、的溶液過(guò)氧化氫物質(zhì)的量（umol），v為樣品提取液總體積（ml），vs為吸取樣品液總體積，m為樣品鮮重（g）由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)所用數(shù)據(jù)分別為：冰凍的雀麥葉片 A1 =1.475，n=11.956umol，v=5ml，vs=1ml，m=3g則：過(guò)氧化氫含量 = （umol/g）=19.926（umol/g） 未經(jīng)冰凍的雀麥葉片A2=0.921，n=7.422umol，v=5ml，vs=1ml，m=3g則：過(guò)氧化氫含量 =（umol/g）=12.370（umol/g）結(jié)果表明：在寒冷條件脅迫下，雀麥葉片中過(guò)氧化氫的含量增加。說(shuō)明由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使過(guò)氧化氫發(fā)生積累，過(guò)氧化氫參與了植物抗逆性過(guò)程。六、 注意事項(xiàng)1. 丙酮在使用前必須要經(jīng)過(guò)預(yù)冷處理，并且在4°的條件下使用。因?yàn)椋诒l件下丙酮保持4°可以減少丙酮揮發(fā)，減少其對(duì)人體的毒害，而且可以降低過(guò)氧化氫的分解過(guò)程。2. 在先后加入5% TiSO4和濃氨水時(shí)，要進(jìn)行搖動(dòng)，搖動(dòng)次數(shù)和時(shí)間應(yīng)該保持一致，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。3. 根據(jù)比色皿的體積，加入硫酸的