第四講酶催化、生物催化與微生物

1、12 酶是生物催化劑，生物催化劑不僅包括從酶是生物催化劑，生物催化劑不僅包括從生物體（微生物、動物、植物）中提取的生物體（微生物、動物、植物）中提取的各種各種游離酶游離酶，還包括可以直接作為酶源使，還包括可以直接作為酶源使用的各種用的各種生物細胞生物細胞、固定化的酶固定化的酶和和固定化固定化細胞。細胞。3 因此生物催化劑可以是微生物、動物、植因此生物催化劑可以是微生物、動物、植物的物的整體細胞整體細胞，也可以是從細胞中提出來，也可以是從細胞中提出來的的酶酶。它們可以游離的形式使用，也可以。它們可以游離的形式使用，也可以采用固定化技術將其固定在多孔介質表面采用固定化技術將其固定在多孔介質表面后再

2、使用。后再使用。 4 利用酶或有機體（細胞、細胞器）作為催化利用酶或有機體（細胞、細胞器）作為催化劑實現(xiàn)化學轉化的過程，稱為劑實現(xiàn)化學轉化的過程，稱為生物催化生物催化。 生物催化中常用的有機體主要是微生物，其生物催化中常用的有機體主要是微生物，其本質是利用微生物細胞內的酶催化有機化合本質是利用微生物細胞內的酶催化有機化合物的生物轉化，又稱物的生物轉化，又稱微生物生物轉化。微生物生物轉化。 5 微生物生物轉化微生物生物轉化在有機合成中有著重要的在有機合成中有著重要的用途，它能提供廉價和多樣的生物催化用途，它能提供廉價和多樣的生物催化劑劑酶酶，或以，或以完整細胞完整細胞直接進行生物催直接進行生物催

3、化?；?。6 在生化反應過程中，若采用活細胞在生化反應過程中，若采用活細胞(包括微包括微生物、動物、植物細胞生物、動物、植物細胞)為催化劑時稱為催化劑時稱發(fā)酵發(fā)酵或細胞培養(yǎng)或細胞培養(yǎng)過程，若采用游離酶或固定化過程，若采用游離酶或固定化酶時稱為酶時稱為酶催化過程酶催化過程。7 它們的區(qū)別在于它們的區(qū)別在于發(fā)酵過程發(fā)酵過程中除得到反應產(chǎn)中除得到反應產(chǎn)物外，還可能得到更多的生物細胞，而物外，還可能得到更多的生物細胞，而酶酶反應過程反應過程中，酶則不會增長。上述兩類反中，酶則不會增長。上述兩類反應過程，從催化作用的實質看是沒有什么應過程，從催化作用的實質看是沒有什么區(qū)別的，利用活生物細胞作為催化劑的發(fā)區(qū)

4、別的，利用活生物細胞作為催化劑的發(fā)酵生化反應，其實質也是酵生化反應，其實質也是通過生物細胞內通過生物細胞內部的酶起催化作用。部的酶起催化作用。8第一節(jié)第一節(jié) 微生物轉化反應的特點微生物轉化反應的特點 微生物轉化反應，可以采用發(fā)酵方式進行微生物轉化反應，可以采用發(fā)酵方式進行轉化，也可以按靜止的洗滌細胞或固定化轉化，也可以按靜止的洗滌細胞或固定化細胞等方式進行連續(xù)生產(chǎn)。它與有機化學細胞等方式進行連續(xù)生產(chǎn)。它與有機化學合成和酶法合成相比較有下列特點。合成和酶法合成相比較有下列特點。91 對立體結構合成具有高度的專一選擇性對立體結構合成具有高度的專一選擇性 微生物轉化反應微生物轉化反應是一種酶的催化反

5、應，對是一種酶的催化反應，對底物底物(即反應物即反應物)作用時，具有高度的立體結作用時，具有高度的立體結構選擇性；它不僅對結構有構選擇性；它不僅對結構有化學選擇性化學選擇性和和非對映異構體選揮性非對映異構體選揮性，并且有嚴格的，并且有嚴格的區(qū)域區(qū)域選擇性選擇性、面選擇性面選擇性和和對映異構體選擇性對映異構體選擇性。10（1）化學選擇性）化學選擇性 同一微生物在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其轉同一微生物在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其轉化底物產(chǎn)生不同的化底物產(chǎn)生不同的化學選擇性化學選擇性。 NONH2NOOH紅球菌紅球菌COCl2CNNNC(10.1)(10.2)(10.3)2-甲基丁腈光氣3-氰基吡啶11 例

6、如紅球菌生長在含有例如紅球菌生長在含有COCl2培養(yǎng)基中，所培養(yǎng)基中，所產(chǎn) 生 的 酶 將 底 物 （產(chǎn) 生 的 酶 將 底 物 （ 1 0 . 1 ） 水 解 為 酰 胺） 水 解 為 酰 胺（10.2）；而生長在含有）；而生長在含有2-甲基丁腈甲基丁腈培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，所產(chǎn)生的酶將底物（中，所產(chǎn)生的酶將底物（10.1）水解為羧酸）水解為羧酸（10.3）。）。12（2） 非對映異構體選揮性非對映異構體選揮性 非對映異構體選擇性非對映異構體選擇性是指對非對映異構體是指對非對映異構體的氫或基團進行催化反應，導入一個非對的氫或基團進行催化反應，導入一個非對映體的基團。這類選擇性生物催化的例子，映體的

7、基團。這類選擇性生物催化的例子，大多是對亞甲基中大多是對亞甲基中2個非對映體氫的進行催個非對映體氫的進行催化，導入一個基團?；?，導入一個基團。 13OOCH3OOCH3HO黑根霉OOCH2OHOAcOOCH2OHOAcHO新月彎孢霉(10.4)(10.5)(10.6)(10.7)黃體酮黃體酮14 例如來自黑根霉生物體的酶選擇性氧化羥例如來自黑根霉生物體的酶選擇性氧化羥基基黃體酮黃體酮（10.4）的）的11-位氫，生成位氫，生成11-羥羥基黃體酮（基黃體酮（10.5）；而來自新月彎孢霉生）；而來自新月彎孢霉生物體的酶則選擇性地氧化物體的酶則選擇性地氧化甾體化合物甾體化合物的的（10.6）的）的1

8、1-位非對映異構體氫，形成位非對映異構體氫，形成11-羥基化合物（羥基化合物（10.7）。）。 15（3）區(qū)域選擇性）區(qū)域選擇性 HOCOOH諾卡氏菌糞產(chǎn)堿桿菌16 應用糞產(chǎn)堿桿菌對乙基環(huán)己烷選擇性氧化應用糞產(chǎn)堿桿菌對乙基環(huán)己烷選擇性氧化時僅作用于時僅作用于4-位上的次甲基位上的次甲基，生成反式乙，生成反式乙基環(huán)己烷醇，側鏈不起氧化反應；而諾卡基環(huán)己烷醇，側鏈不起氧化反應；而諾卡氏菌對丁基環(huán)己烷選擇性氧化時，僅作用氏菌對丁基環(huán)己烷選擇性氧化時，僅作用于于環(huán)己烷的側鏈丁基環(huán)己烷的側鏈丁基，生成環(huán)己烷丁酸，生成環(huán)己烷丁酸，顯示了酶的區(qū)域選擇性氧化反應。顯示了酶的區(qū)域選擇性氧化反應。17（4）面選擇

9、性）面選擇性 無環(huán)無環(huán)-酮酯易被酵母還原為酮酯易被酵母還原為-羥酯，羥酯， -羥羥酯酯(這種產(chǎn)物這種產(chǎn)物)是是-內酰胺、昆蟲激素和類胡內酰胺、昆蟲激素和類胡蘿卜素等合成的手性源。蘿卜素等合成的手性源。OOR1O R2OR1O R2OR1O R2O HO H面 包 酵 母面 包 酵 母18OOR1O R2OR1O R2OR1O R2O HO H面 包 酵 母面 包 酵 母OOR1O R2OR1O R2OR1O R2O HO H面 包 酵 母面 包 酵 母R1小小 COOR2大大R1大大 COOR2小小H-H-酮酯酮酯-酮酮酯酯19 氫負離子按氫負離子按Prelog規(guī)則從空間位阻小的一規(guī)則從空間位

10、阻小的一面向羰基親核進攻，形成穩(wěn)定的優(yōu)勢中間面向羰基親核進攻，形成穩(wěn)定的優(yōu)勢中間體，還原醇的手性中心構型由體，還原醇的手性中心構型由底物結構決底物結構決定定，即與羰基兩側取代基的大小有關。，即與羰基兩側取代基的大小有關。 20（5）對映異構體選擇性）對映異構體選擇性 OHOOCCOOHHHHOHHOOCCOOHOHHHOHHOOCCOOHOHH糞產(chǎn)堿桿菌枯草桿菌(10.8)(10.9)(10.10)環(huán)氧馬來酸環(huán)氧馬來酸(S,S)-酒石酸(R,R)-酒石酸21 如 一 種 糞 產(chǎn) 堿 桿 菌如 一 種 糞 產(chǎn) 堿 桿 菌 ( A l c a l i g e n e s levotartaricu

11、s)微生物催化環(huán)氧馬來酸微生物催化環(huán)氧馬來酸(10.8)的水解反應，其產(chǎn)物為的水解反應，其產(chǎn)物為(S,S)-酒石酸酒石酸(10.9)；而以枯草桿菌微生物催化（；而以枯草桿菌微生物催化（10.8）的水解產(chǎn)物則為的水解產(chǎn)物則為(R,R)-酒石酸酒石酸（10.10）。）。22 這種嚴格的立體結構選擇性，對有機合成這種嚴格的立體結構選擇性，對有機合成特別是藥物合成來說是非常重要的。因為特別是藥物合成來說是非常重要的。因為藥物的異構體不僅無效或低效，并且往往藥物的異構體不僅無效或低效，并且往往還有副作用，甚至有相反的藥效和強力的還有副作用，甚至有相反的藥效和強力的毒性。毒性。23 特別像生理活性很高的激

12、素、抗生素以及特別像生理活性很高的激素、抗生素以及心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等藥物的藥效對立心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等藥物的藥效對立體結構的要求很高往往具有嚴格對映體體結構的要求很高往往具有嚴格對映體構型的要求，此為有機化學合成方法難以構型的要求，此為有機化學合成方法難以達到的。達到的。242 微生物轉化反應條件溫和、設備簡單、微生物轉化反應條件溫和、設備簡單、公害少并且反應速率快公害少并且反應速率快 微生物轉化反應一般都在常溫和微生物轉化反應一般都在常溫和pH為為7左左右進行催化合成，無需高壓、強熱等苛刻右進行催化合成，無需高壓、強熱等苛刻的條件，所以設備簡單，反應條件溫和，的條件，所以設備簡單，反應

13、條件溫和，生產(chǎn)安全；原料除底物和普通培養(yǎng)基外沒生產(chǎn)安全；原料除底物和普通培養(yǎng)基外沒有其他化學品，因此一般無公害。有其他化學品，因此一般無公害。25 微生物轉化反應是酶催化反應，在最適條微生物轉化反應是酶催化反應，在最適條件下，酶能在一秒鐘內使件下，酶能在一秒鐘內使102106個底物個底物分子轉變成產(chǎn)物。分子轉變成產(chǎn)物。 263 微生物轉化收率高、成本低微生物轉化收率高、成本低 微生物轉化反應是在全細胞內進行，保持微生物轉化反應是在全細胞內進行，保持原有整體酶系統(tǒng)比較符合生物催化所需環(huán)原有整體酶系統(tǒng)比較符合生物催化所需環(huán)境與條件，在境與條件，在氧化氧化-還原還原等催化反應時不需等催化反應時不需添

14、加輔酶（輔酶非常不穩(wěn)定，難以分離制添加輔酶（輔酶非常不穩(wěn)定，難以分離制取，這是酶法合成中很難補救的）。取，這是酶法合成中很難補救的）。27 微生物轉化反應可以持續(xù)進行，反應量大，微生物轉化反應可以持續(xù)進行，反應量大，收率高，可以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。加上設備收率高，可以大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。加上設備和原料簡單易得等優(yōu)點，生產(chǎn)成本不僅低和原料簡單易得等優(yōu)點，生產(chǎn)成本不僅低于酶法合成，并且也低于化學合成。于酶法合成，并且也低于化學合成。284 微生物轉化可以減少反應步驟微生物轉化可以減少反應步驟 通過酶合成基因構建得到的基因工程菌，通過酶合成基因構建得到的基因工程菌，可以將原需幾步催化中間體過程在一次發(fā)可以將

15、原需幾步催化中間體過程在一次發(fā)酵中轉化完成。酵中轉化完成。 將幾步中間體合成中轉化酶的合成基因，將幾步中間體合成中轉化酶的合成基因，通過基因構建于同一個工程菌中，在發(fā)酵通過基因構建于同一個工程菌中，在發(fā)酵法轉化時需幾步催化合成的中間體就能一法轉化時需幾步催化合成的中間體就能一步轉化成功。步轉化成功。29 例如維生素例如維生素C生物合成中基因重組生物合成中基因重組葡萄糖酸葡萄糖酸氧化桿菌氧化桿菌的代謝工程菌，將的代謝工程菌，將L- -山梨糖脫氫山梨糖脫氫酶基因酶基因和和L- -山梨酮脫氫酶山梨酮脫氫酶基因，通過基因基因，通過基因重組構建成一個代謝工程菌，發(fā)酵可以在重組構建成一個代謝工程菌，發(fā)酵可

16、以在同一次轉化發(fā)酵中將同一次轉化發(fā)酵中將D-山梨醇轉化成山梨醇轉化成-酮酮-L-古洛糖酸古洛糖酸。30第二節(jié)第二節(jié) 生物轉化實驗方法生物轉化實驗方法 1 生物催化劑的來源與制備方法生物催化劑的來源與制備方法 2 微生物轉化實驗過程微生物轉化實驗過程 3 微生物轉化方法微生物轉化方法 4 微生物轉化的影響因素微生物轉化的影響因素 5 產(chǎn)物的檢測與分離純化產(chǎn)物的檢測與分離純化 6 對映體過量對映體過量311 生物催化劑的來源與制備方法生物催化劑的來源與制備方法 離體酶主要來源于動物、植物、微生物等離體酶主要來源于動物、植物、微生物等的含酶細胞、組織或器官，通過提取法可的含酶細胞、組織或器官，通過提

17、取法可制得多種離體酶。制得多種離體酶。32 例如，從動物胃中提取分離例如，從動物胃中提取分離胃蛋白酶胃蛋白酶；從；從動物胰臟中提取動物胰臟中提取胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶脂肪酶，或這些酶的混合制劑胰酶；從動，或這些酶的混合制劑胰酶；從動物血液中提取物血液中提取超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（SOD）；）；從木瓜中提取從木瓜中提取木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶；從波蘿中提取；從波蘿中提取波蘿蛋白酶波蘿蛋白酶；從大腸桿菌中提??；從大腸桿菌中提取谷氨酰胺谷氨酰胺酶酶等。等。33 完整細胞主要來自于微生物，通過微生物完整細胞主要來自于微生物，通過微生物發(fā)酵法來制備各種含酶細胞。例如以釀酒發(fā)

18、酵法來制備各種含酶細胞。例如以釀酒酵母為菌種進行發(fā)酵，可得到含有酵母為菌種進行發(fā)酵，可得到含有丙酮酸丙酮酸脫羧酶脫羧酶和和乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶等多種酶和輔酶的酵等多種酶和輔酶的酵母細胞。母細胞。34 有機合成中所用的酶一般為粗品，其酶含有機合成中所用的酶一般為粗品，其酶含量僅有量僅有130，其余是無活性的蛋白質、，其余是無活性的蛋白質、穩(wěn)定劑、鹽或者含有提取過程中混雜進來穩(wěn)定劑、鹽或者含有提取過程中混雜進來的多糖。的多糖。酶的粗品比純品更為穩(wěn)定，但粗酶的粗品比純品更為穩(wěn)定，但粗酶催化反應的副產(chǎn)物多酶催化反應的副產(chǎn)物多。隨著蛋白質分離。隨著蛋白質分離純化技術的發(fā)展，生物催化反應中純酶的純化技術的

19、發(fā)展，生物催化反應中純酶的使用正在逐步增加。使用正在逐步增加。352 微生物轉化實驗過程微生物轉化實驗過程 微生物轉化實驗的簡要過程如下：微生物轉化實驗的簡要過程如下： 選擇菌種選擇菌種成熟菌絲或孢子的培養(yǎng)成熟菌絲或孢子的培養(yǎng)選擇選擇適當?shù)霓D化方式適當?shù)霓D化方式轉化培養(yǎng)轉化培養(yǎng)(即生物轉化即生物轉化)或或轉化菌絲及孢子懸浮液轉化轉化菌絲及孢子懸浮液轉化轉化液的分轉化液的分離提取離提取產(chǎn)品精制產(chǎn)品精制 36（1）選擇菌種）選擇菌種 選好菌種是進行轉化反應的關鍵步驟選好菌種是進行轉化反應的關鍵步驟；可；可以根據(jù)轉化反應類型，選擇能產(chǎn)生催化這以根據(jù)轉化反應類型，選擇能產(chǎn)生催化這類反應酶的微生物。一般

20、可向國家、地方類反應酶的微生物。一般可向國家、地方保管菌種委員會或學校、研究機關去函索保管菌種委員會或學校、研究機關去函索取、購買。取、購買。37（2）配制培養(yǎng)基）配制培養(yǎng)基 一般要求培養(yǎng)基的成分能使菌絲生長豐滿一般要求培養(yǎng)基的成分能使菌絲生長豐滿和富含需要的酶。按轉化菌種的培養(yǎng)特征和富含需要的酶。按轉化菌種的培養(yǎng)特征和轉化反應需要配制培養(yǎng)基。和轉化反應需要配制培養(yǎng)基。 為成熟菌絲或孢子的培養(yǎng)做準備。為成熟菌絲或孢子的培養(yǎng)做準備。38（3）投轉化底物）投轉化底物 選擇適當?shù)木晟L期加底物，并考慮選選擇適當?shù)木晟L期加底物，并考慮選擇加底物的方法擇加底物的方法(例如固體加料或液體加料例如固體

21、加料或液體加料)和方式和方式(例如連續(xù)或間歇加料例如連續(xù)或間歇加料)。39（4）添加刺激劑或抑制劑）添加刺激劑或抑制劑 添加刺激劑的目的是提高酶活力和增加酶添加刺激劑的目的是提高酶活力和增加酶生長量。添加抑制劑的目的是抑制酶副反生長量。添加抑制劑的目的是抑制酶副反應或抑制其他對反應不良酶的生長。應或抑制其他對反應不良酶的生長。 40(5) 轉化過程中各項影響因素的控制轉化過程中各項影響因素的控制 例如開始加底物時間，加入的底物和轉化例如開始加底物時間，加入的底物和轉化的產(chǎn)物在轉化環(huán)境中最大穩(wěn)定的滯留時間；的產(chǎn)物在轉化環(huán)境中最大穩(wěn)定的滯留時間；適宜的轉化溫度；適宜的轉化溫度；pH值和菌絲濃度等。

22、值和菌絲濃度等。 41（6）轉化反應終點的控制）轉化反應終點的控制 根據(jù)影響轉化反應的各種因素，控制好轉根據(jù)影響轉化反應的各種因素，控制好轉化反應培養(yǎng)終點，使底物轉化達最大反應化反應培養(yǎng)終點，使底物轉化達最大反應完全值。當取樣分析反映轉化培養(yǎng)液中轉完全值。當取樣分析反映轉化培養(yǎng)液中轉化產(chǎn)物積累量不再增加時，立刻采用物理化產(chǎn)物積累量不再增加時，立刻采用物理方法將菌絲體方法將菌絲體(包括轉化反應的胞外酶包括轉化反應的胞外酶)及培及培養(yǎng)物除去來停止轉化反應。養(yǎng)物除去來停止轉化反應。42（7）分離精制轉化產(chǎn)物）分離精制轉化產(chǎn)物 轉化產(chǎn)物已與生物轉化系統(tǒng)分開，可按化轉化產(chǎn)物已與生物轉化系統(tǒng)分開，可按化學

23、方法將產(chǎn)物分離精制。一般來說轉化過學方法將產(chǎn)物分離精制。一般來說轉化過濾液中雜質含量大，產(chǎn)物濃度低。濾液中雜質含量大，產(chǎn)物濃度低。 43微生物轉化實驗過程微生物轉化實驗過程 選擇菌種選擇菌種 成熟菌絲或孢子的培養(yǎng)成熟菌絲或孢子的培養(yǎng) 選擇適當?shù)霓D化方式？選擇適當?shù)霓D化方式？ 轉化培養(yǎng)轉化培養(yǎng)(即生物轉化即生物轉化)或轉化菌絲及孢子懸或轉化菌絲及孢子懸浮液轉化浮液轉化 轉化液的分離提取轉化液的分離提取 產(chǎn)品精制產(chǎn)品精制443 微生物轉化方法微生物轉化方法 生長細胞培養(yǎng)轉化法生長細胞培養(yǎng)轉化法 靜止細胞培養(yǎng)轉化法靜止細胞培養(yǎng)轉化法 固定化細胞轉化法固定化細胞轉化法45生長細胞培養(yǎng)轉化法生長細胞培養(yǎng)

24、轉化法 生長細胞培養(yǎng)生長細胞培養(yǎng)轉化法，是在微生物細胞培轉化法，是在微生物細胞培養(yǎng)前或培養(yǎng)一段時間后，直接將養(yǎng)前或培養(yǎng)一段時間后，直接將底物底物投入投入到微生物生長培養(yǎng)基中，利用微生物自身到微生物生長培養(yǎng)基中，利用微生物自身繁殖生長的同時對底物進行生物轉化。繁殖生長的同時對底物進行生物轉化。 這種轉化一般在這種轉化一般在搖瓶搖瓶或或發(fā)酵罐發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)中進行培養(yǎng)轉化。轉化。 46 搖瓶轉化搖瓶轉化實驗主要用于篩選菌種和發(fā)酵罐實驗主要用于篩選菌種和發(fā)酵罐放大轉化反應條件的選擇。放大轉化反應條件的選擇。 在通氣的條件下將微生物培養(yǎng)至生長旺盛在通氣的條件下將微生物培養(yǎng)至生長旺盛的的對數(shù)生長期的中期

25、對數(shù)生長期的中期，或在，或在后期后期所產(chǎn)生酶所產(chǎn)生酶的晚期時加入底物進行轉化；極個別也有的晚期時加入底物進行轉化；極個別也有在生長早期加底物，此根據(jù)轉化需要的酶在生長早期加底物，此根據(jù)轉化需要的酶生長情況。生長情況。47 加入的底物可以粉末狀的固體或底物的水加入的底物可以粉末狀的固體或底物的水溶液，必要時也可以應用有機溶劑；投料溶液，必要時也可以應用有機溶劑；投料方式可以一次或分批。方式可以一次或分批。48 生長細胞培養(yǎng)轉化法是最簡單和最常用的生長細胞培養(yǎng)轉化法是最簡單和最常用的一種方法，一種方法，優(yōu)點是微生物生物轉化容易、優(yōu)點是微生物生物轉化容易、效率高，缺點是產(chǎn)物的后處理及分離純化效率高，

26、缺點是產(chǎn)物的后處理及分離純化煩瑣。煩瑣。 一般適用于經(jīng)過誘變處理的微生物菌株，一般適用于經(jīng)過誘變處理的微生物菌株，它可以底物作為唯一碳源，也能適應連續(xù)它可以底物作為唯一碳源，也能適應連續(xù)化生產(chǎn)過程?；a(chǎn)過程。 49靜止細胞培養(yǎng)轉化法靜止細胞培養(yǎng)轉化法 靜止細胞培養(yǎng)靜止細胞培養(yǎng)轉化法，是把微生物細胞在轉化法，是把微生物細胞在一定的條件下培養(yǎng)一段時間后，經(jīng)離心收一定的條件下培養(yǎng)一段時間后，經(jīng)離心收集菌體，將菌體懸浮于水或緩沖溶液中，集菌體，將菌體懸浮于水或緩沖溶液中，然后加入底物，在適宜的溫度、然后加入底物，在適宜的溫度、pH和振蕩和振蕩條件下進行轉化的方法。條件下進行轉化的方法。50 靜止細胞

27、轉化法是靜止細胞轉化法是將一種生長影響減至最將一種生長影響減至最小情況下進行生物轉化小情況下進行生物轉化。 它通過提高菌絲體濃度可以達到加快轉化它通過提高菌絲體濃度可以達到加快轉化速率的目的。速率的目的。51 應用應用干細胞進行轉化干細胞進行轉化是另一種靜止細胞轉是另一種靜止細胞轉化法，便于貯備隨時使用。干細胞制備有化法，便于貯備隨時使用。干細胞制備有兩種方法，兩種方法，冷凍干燥法冷凍干燥法和和丙酮干粉制備法。丙酮干粉制備法。 靜止細胞培養(yǎng)轉化法的優(yōu)點是靜止細胞培養(yǎng)轉化法的優(yōu)點是產(chǎn)物后處理產(chǎn)物后處理簡單、沒有培養(yǎng)基成分的污染，缺點是增簡單、沒有培養(yǎng)基成分的污染，缺點是增加了額外的菌體收集與重懸

28、過程。加了額外的菌體收集與重懸過程。52固定化細胞轉化法固定化細胞轉化法 固定化細胞固定化細胞轉化法是指利用化學或物理手轉化法是指利用化學或物理手段將段將游離的細胞游離的細胞定位于限定的空間區(qū)域并定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性及可以反復使用的特性，然使其保持活性及可以反復使用的特性，然后用于催化有機化合物的生物轉化得到所后用于催化有機化合物的生物轉化得到所需產(chǎn)物的方法。需產(chǎn)物的方法。 53 制取固定化細胞的方法分為兩大類：制取固定化細胞的方法分為兩大類： 將細胞與固定材料通過化學反應相結合或將細胞與固定材料通過化學反應相結合或分子鍵的締合，稱分子鍵的締合，稱共價鍵合共價鍵合； 將整個細胞包

29、埋在膠質材料（如角叉菜膠、將整個細胞包埋在膠質材料（如角叉菜膠、卡拉膠和海藻膠等）內，稱卡拉膠和海藻膠等）內，稱包埋法包埋法。 54 目前獲得廣泛應用的固定化方法有聚丙烯目前獲得廣泛應用的固定化方法有聚丙烯酰胺聚合的固定化方法和角叉菜膠的包埋酰胺聚合的固定化方法和角叉菜膠的包埋法，其固定化細胞也可懸浮于培養(yǎng)基中發(fā)法，其固定化細胞也可懸浮于培養(yǎng)基中發(fā)酵生長同時進行生物轉化，以保證輔酶的酵生長同時進行生物轉化，以保證輔酶的再生以及新活細胞的生長。再生以及新活細胞的生長。55 固定化細胞轉化最大優(yōu)點固定化細胞轉化最大優(yōu)點可以長期反復使可以長期反復使用用，有的能維持有效催化達數(shù)月之久，還，有的能維持有

30、效催化達數(shù)月之久，還有有分離純化容易分離純化容易，因此便于自動化和大規(guī)，因此便于自動化和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)；模工業(yè)生產(chǎn)； 缺點缺點是固定化細胞的生物轉化活性比游離是固定化細胞的生物轉化活性比游離細胞的生物活性低。細胞的生物活性低。 564 微生物轉化的影響因素微生物轉化的影響因素 微生物生物轉化最重要的步驟是微生物生物轉化最重要的步驟是底物與催底物與催化反應的酶之間的相互接觸化反應的酶之間的相互接觸，而參與生物，而參與生物轉化反應的微生物酶一般是轉化反應的微生物酶一般是微生物胞內酶，微生物胞內酶，底物必須能透過細胞壁和細胞膜底物必須能透過細胞壁和細胞膜。57 因此底物添加方法對轉化率有很大影響，因

31、此底物添加方法對轉化率有很大影響，必須考慮底物的各種性質必須考慮底物的各種性質 如如滲透性滲透性、溶解性溶解性、穩(wěn)定性穩(wěn)定性及毒性等。及毒性等。58 如果添加能溶于水的底物到培養(yǎng)基中進行如果添加能溶于水的底物到培養(yǎng)基中進行轉化是比較容易的，主要注意的問題是轉化是比較容易的，主要注意的問題是加加底物量的多少，添加的速度和底物對轉化底物量的多少，添加的速度和底物對轉化的微生物是否有毒性的微生物是否有毒性。 應用含酶活力強和含酶量多的微生物進行應用含酶活力強和含酶量多的微生物進行轉化時，添加底物的速度可以快，添加底轉化時，添加底物的速度可以快，添加底物的量也可以多。物的量也可以多。59 對一般微生物

32、轉化來說，非離子化合物的對一般微生物轉化來說，非離子化合物的底物底物最大投料質量濃度約為最大投料質量濃度約為10；對離子；對離子化合物的底物最大的投料質量濃度約化合物的底物最大的投料質量濃度約5。 60 此外，不同的微生物對有毒的底物的忍受此外，不同的微生物對有毒的底物的忍受力是不一樣的，添加底物速度與添加量要力是不一樣的，添加底物速度與添加量要低于微生物的忍受量；低于微生物的忍受量；一般在微生物生長一般在微生物生長期耐受有毒底物的能力比較低。期耐受有毒底物的能力比較低。61 必須注意的是即使非毒性的底物，當轉化必須注意的是即使非毒性的底物，當轉化到積累至大量時，也能產(chǎn)生對轉化微生物到積累至大

33、量時，也能產(chǎn)生對轉化微生物的抑制作用。的抑制作用。最好隨時分離轉化產(chǎn)物。最好隨時分離轉化產(chǎn)物。 例如采用兩相例如采用兩相(水、有機溶劑水、有機溶劑)轉化法或固定轉化法或固定化細胞轉化法?；毎D化法。62 如果如果添加不能溶于水的底物添加不能溶于水的底物是比添加水溶是比添加水溶性的底物要困難得多?？梢圆捎枚喾N方法性的底物要困難得多?？梢圆捎枚喾N方法加以克服：加以克服：63 （1）用細粉末狀的固體投料。用細粉末狀的固體投料。這樣可使轉這樣可使轉化細胞和粉末底物之間有最佳的接觸面積?；毎头勰┑孜镏g有最佳的接觸面積。若要轉化氣體狀態(tài)的碳氫化合物若要轉化氣體狀態(tài)的碳氫化合物(如甲烷如甲烷)，以氣

34、泡形式從底部通氣，使泡慢慢通過轉以氣泡形式從底部通氣，使泡慢慢通過轉化培養(yǎng)基來增加相互接觸面積，獲得良好化培養(yǎng)基來增加相互接觸面積，獲得良好的轉化效果。的轉化效果。64 （2）利用非毒性表面活性劑利用非毒性表面活性劑 利用非毒性利用非毒性表面活性劑如表面活性劑如吐溫吐溫80類類也能分散不溶性底也能分散不溶性底物，增加轉化細胞和底物相間接觸。物，增加轉化細胞和底物相間接觸。 65 (3) 利用無毒性溶劑利用無毒性溶劑 如如95%乙醇、丙酮、乙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和二甲亞砜等來溶解底二甲基甲酰胺和二甲亞砜等來溶解底物，這是較理想的辦法；但是這類有機溶物，這是較理想的辦法；但是這類有機溶劑

35、在水中的溶解度很大，且底物濃度很高，劑在水中的溶解度很大，且底物濃度很高，因此每次添加的量應盡量的少，最好在添因此每次添加的量應盡量的少，最好在添加底物前測定該有機溶劑的忍耐度。加底物前測定該有機溶劑的忍耐度。66 另外，在培養(yǎng)菌絲體和轉化過程中的適當另外，在培養(yǎng)菌絲體和轉化過程中的適當階段，有時另加誘導物，促進劑或抑制劑階段，有時另加誘導物，促進劑或抑制劑來促進酶的生成，提高酶的轉化活力或抑來促進酶的生成，提高酶的轉化活力或抑制副反應產(chǎn)生。制副反應產(chǎn)生。675 產(chǎn)物的檢測與分離純化產(chǎn)物的檢測與分離純化 在生物轉化過程中底物的減少或產(chǎn)物的增在生物轉化過程中底物的減少或產(chǎn)物的增加可采用薄層色譜法

36、加可采用薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜、高效液相色譜法法(HPLC)或氣相色譜法或氣相色譜法(GC)等分析技術進等分析技術進行鑒定。行鑒定。68 根據(jù)分析結果可以隨時判斷生物轉化進行根據(jù)分析結果可以隨時判斷生物轉化進行的程度，確定底物的最高轉化率和產(chǎn)物的的程度，確定底物的最高轉化率和產(chǎn)物的收率等，得出生物轉化反應的最佳條件。收率等，得出生物轉化反應的最佳條件。69 產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)物的分離純化一般先將微生物細胞與轉一般先將微生物細胞與轉化液相分離化液相分離，常采用抽濾或離心法（固定，常采用抽濾或離心法（固定化細胞轉化法則可省去此步驟）。化細胞轉化法則可省去此步驟）。 然后用有機溶劑從濾液中

37、萃取轉化產(chǎn)物，然后用有機溶劑從濾液中萃取轉化產(chǎn)物，若為非中性產(chǎn)物則應調節(jié)溶液若為非中性產(chǎn)物則應調節(jié)溶液pH值，以提值，以提高萃取效率。高萃取效率。 70 雖然生物轉化產(chǎn)物絕大多數(shù)存在于轉化液雖然生物轉化產(chǎn)物絕大多數(shù)存在于轉化液中，但在菌絲體中也會殘留一些，因此很中，但在菌絲體中也會殘留一些，因此很有有必要用有機溶劑對菌絲體萃取必要用有機溶劑對菌絲體萃取12次次，以，以提高轉化產(chǎn)物的收率。提高轉化產(chǎn)物的收率。71 真菌類轉化產(chǎn)物的分離一般先采用真菌類轉化產(chǎn)物的分離一般先采用離心或離心或抽濾法抽濾法將菌絲體與轉化液相互分離；將菌絲體與轉化液相互分離； 但細菌類轉化產(chǎn)物的分離一般則不需要采但細菌類轉化產(chǎn)物的分離一般則不需要采用分離步驟，可直接用有機溶劑萃取產(chǎn)物。用分離步驟，可直接用有機溶劑萃取產(chǎn)物。直接用有機溶劑萃取可能會導致產(chǎn)物中含直接用有機溶劑萃取可能會導致產(chǎn)物中含有少量細胞組分。有少量細胞組分。72 萃取所得粗品需進一步的分離純化才能得萃取所得粗品需進一步的分離純化才能得到純品。到純品。 常用的精制方法有重結晶、柱層析法和色常用的精制方法有重結晶、柱層析法和色譜法等。譜法等。736 對映體過量對映體過量 有機合成中常用有機合成中常用化學產(chǎn)率化學產(chǎn)率(yield)來描述有來描述有機合成反應的實驗結果，產(chǎn)率是指實際產(chǎn)機合成反應