第四章蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

1、第第 4 章章化學(xué)修飾的原理化學(xué)修飾的原理化學(xué)修飾的方法學(xué)化學(xué)修飾的方法學(xué)蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)蛋白質(zhì)肽鏈的交聯(lián)親和標(biāo)記親和標(biāo)記蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的應(yīng)用內(nèi)內(nèi) 容容 提提 要要化學(xué)修飾：凡通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，而使蛋白質(zhì)化學(xué)修飾：凡通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，而使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的現(xiàn)象。共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的現(xiàn)象。選擇性化學(xué)修飾：肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾。選擇性化學(xué)修飾：肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾。第一節(jié)第一節(jié) 化學(xué)修飾的原理化學(xué)修飾的原理影響因素影響因素蛋白質(zhì)功能蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性基的反應(yīng)性修飾劑的修飾劑的反應(yīng)性反應(yīng)性一、影響蛋

2、白質(zhì)功能基反應(yīng)性的各因素一、影響蛋白質(zhì)功能基反應(yīng)性的各因素因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)分子是（親水的表面，疏水的核），所以因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)分子是（親水的表面，疏水的核），所以pk值值和影響和影響pk值的因素應(yīng)特別關(guān)注。值的因素應(yīng)特別關(guān)注。（一）微區(qū)的極性（一）微區(qū)的極性微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解微區(qū)的極性是決定基團(tuán)解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。醋酸的醋酸的pk值值在水中為在水中為4.76在在80%乙醇中為乙醇中為6.87在在100%乙醇中為乙醇中為10.32微區(qū)的極性與介質(zhì)的介電常數(shù)有關(guān)。微區(qū)的極性與介質(zhì)的介電常數(shù)有關(guān)。（二）氫鍵效應(yīng)（二）氫鍵效應(yīng)天然蛋白質(zhì)或它的離子通過(guò)氫鍵來(lái)維持其穩(wěn)定性，也

3、天然蛋白質(zhì)或它的離子通過(guò)氫鍵來(lái)維持其穩(wěn)定性，也是使是使pk值發(fā)生改變的一個(gè)因素值發(fā)生改變的一個(gè)因素（三）靜電效應(yīng)（三）靜電效應(yīng)研究表明，不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的研究表明，不同蛋白質(zhì)中的組氨酸殘基的pk值是不同值是不同的，原因是由于帶電基團(tuán)相互影響所致。的，原因是由于帶電基團(tuán)相互影響所致。局部極性局部極性的變化的變化對(duì)色、甲硫、胱氨酸反應(yīng)性影響最小對(duì)色、甲硫、胱氨酸反應(yīng)性影響最小對(duì)酪、半胱氨酸、羧基反應(yīng)性影響最大對(duì)酪、半胱氨酸、羧基反應(yīng)性影響最大對(duì)氨基和組氨酸反應(yīng)性影響較大對(duì)氨基和組氨酸反應(yīng)性影響較大例如：例如：2-氟酚的氟酚的pk值比值比2-溴酚的溴酚的pk值高值高0.7pH單位，原因是氟單

4、位，原因是氟與酚形成氫鍵的能力比溴強(qiáng)。與酚形成氫鍵的能力比溴強(qiáng)。OHCOHOOHFOHBr水楊酸水楊酸碳酸酐酶：碳酸酐酶： 5.91； 6.04； 7.00； 7.23葡萄球菌核酸酶：葡萄球菌核酸酶： 5.37； 5.71； 5.74； 6.50（四）位阻效應(yīng)（四）位阻效應(yīng)如果烷基在空間上緊靠功能基，修飾劑不易與功能基反如果烷基在空間上緊靠功能基，修飾劑不易與功能基反應(yīng)，出現(xiàn)位阻效應(yīng)。應(yīng)，出現(xiàn)位阻效應(yīng)。影響蛋白質(zhì)中可電離氨基酸側(cè)鏈的影響蛋白質(zhì)中可電離氨基酸側(cè)鏈的pkpk值的因素，也是影響側(cè)鏈基值的因素，也是影響側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)性的重要因素。蛋白質(zhì)中個(gè)別功能基所處的微區(qū)不同，反團(tuán)反應(yīng)性的重要因素。蛋

5、白質(zhì)中個(gè)別功能基所處的微區(qū)不同，反應(yīng)性也不同，個(gè)別功能基的反應(yīng)性可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記法來(lái)測(cè)定。應(yīng)性也不同，個(gè)別功能基的反應(yīng)性可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記法來(lái)測(cè)定。二、蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性二、蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性例如：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有例如：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個(gè)組氨酸殘基，其個(gè)組氨酸殘基，其pk值是：值是：影響功能基影響功能基pk值值基團(tuán)之間的功能障礙基團(tuán)之間的功能障礙影響功能基反影響功能基反應(yīng)性的因素應(yīng)性的因素多數(shù)蛋白質(zhì)的功能基與簡(jiǎn)單氨基酸中的同樣基團(tuán)相比，反應(yīng)性多數(shù)蛋白質(zhì)的功能基與簡(jiǎn)單氨基酸中的同樣基團(tuán)相比，反應(yīng)性要差。但是，每個(gè)蛋白質(zhì)分子中至少有一個(gè)基團(tuán)對(duì)一定的試劑要差。但是，每個(gè)蛋

6、白質(zhì)分子中至少有一個(gè)基團(tuán)對(duì)一定的試劑顯示出超反應(yīng)性。顯示出超反應(yīng)性。影響超反應(yīng)性的因素：影響超反應(yīng)性的因素：1.1.改變蛋白質(zhì)功能基的改變蛋白質(zhì)功能基的pk值；值；2.2.蛋白質(zhì)功能基具有較大的親核性；蛋白質(zhì)功能基具有較大的親核性；3.3.通過(guò)靜電相互作用吸引試劑，并使其有適當(dāng)取向；通過(guò)靜電相互作用吸引試劑，并使其有適當(dāng)取向；4.4.試劑與靠近修飾部位的蛋白質(zhì)區(qū)域之間的立體化學(xué)適應(yīng)性；試劑與靠近修飾部位的蛋白質(zhì)區(qū)域之間的立體化學(xué)適應(yīng)性；5.5.試劑的結(jié)合。試劑的結(jié)合。超反應(yīng)性可由上述一個(gè)或幾個(gè)因素的綜合作用而產(chǎn)生。超反應(yīng)性可由上述一個(gè)或幾個(gè)因素的綜合作用而產(chǎn)生。超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與

7、個(gè)別試劑能發(fā)生非常超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)與個(gè)別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)。迅速的反應(yīng)。三、修飾劑反應(yīng)性的決定因素三、修飾劑反應(yīng)性的決定因素蛋白質(zhì)的構(gòu)象和表面特性對(duì)氨基酸側(cè)鏈的反應(yīng)性有影響，同樣，蛋白質(zhì)的構(gòu)象和表面特性對(duì)氨基酸側(cè)鏈的反應(yīng)性有影響，同樣，它們也可能對(duì)接近功能基的修飾劑產(chǎn)生有利或不利的影響。它們也可能對(duì)接近功能基的修飾劑產(chǎn)生有利或不利的影響。木瓜蛋白酶中的木瓜蛋白酶中的19個(gè)酪氨酸殘基，個(gè)酪氨酸殘基，只有一個(gè)能與修飾劑反應(yīng)，修飾只有一個(gè)能與修飾劑反應(yīng)，修飾后酶活性并不改變，說(shuō)明什麼？后酶活性并不改變，說(shuō)明什麼？（一）選擇吸附（一）選擇吸附化學(xué)修飾前，修飾劑根據(jù)各自的特點(diǎn)，選擇性

8、地吸附在低或高極化學(xué)修飾前，修飾劑根據(jù)各自的特點(diǎn)，選擇性地吸附在低或高極性區(qū)，根據(jù)對(duì)速度的飽和效應(yīng)，可檢測(cè)出蛋白質(zhì)性區(qū)，根據(jù)對(duì)速度的飽和效應(yīng)，可檢測(cè)出蛋白質(zhì)-修飾劑復(fù)合物修飾劑復(fù)合物的形成。的形成。（二）靜電相互作用（二）靜電相互作用帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。位。靜電排斥力能抑制修飾作用。靜電排斥力能抑制修飾作用。（三）位阻因素（三）位阻因素蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或者底物、輔助因子、抑制劑所產(chǎn)生蛋白質(zhì)表面的位阻因素，或者底物、輔助因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。的位阻因素都可能

9、阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。D-氨基酸氧化酶的巰基與氨基酸氧化酶的巰基與N-烷基馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)，巰基的辛烷基馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)，巰基的辛基化速度比乙基化速度快基化速度比乙基化速度快15倍。倍。核糖核酸酶第核糖核酸酶第12號(hào)組氨酸烷化號(hào)組氨酸烷化-溴代丁酸反應(yīng)很快；溴代丁酸反應(yīng)很快；-溴代戊酸反應(yīng)很慢；溴代戊酸反應(yīng)很慢；-溴代己酸不能反應(yīng)。溴代己酸不能反應(yīng)。（四）催化因素（四）催化因素修飾部位附近的其它功能基，如果起一般的酸堿催化作用，也修飾部位附近的其它功能基，如果起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯能影響修飾反應(yīng)。不同的修飾劑，反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有

10、明顯差異。差異。（五）局部環(huán)境的極性（五）局部環(huán)境的極性溶劑效應(yīng)是復(fù)雜的。有些有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，有溶劑效應(yīng)是復(fù)雜的。有些有機(jī)反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)，有些反應(yīng)則與極性無(wú)關(guān)。些反應(yīng)則與極性無(wú)關(guān)。反反 應(yīng)應(yīng) 類類 型型降低極性對(duì)速度的影響降低極性對(duì)速度的影響RSR+ICH2CONH2R2S+CH2CONH2I-溶劑極性對(duì)反應(yīng)速度的影響溶劑極性對(duì)反應(yīng)速度的影響適當(dāng)降低或大大降低適當(dāng)降低或大大降低沒(méi)有影響沒(méi)有影響沒(méi)有影響沒(méi)有影響適當(dāng)增加或大大增加適當(dāng)增加或大大增加RSR+H2O2R2SO+H2ORS-+ICH2CONH2RSCH2CONH2+I-RNH3+OCN- RNHCONH2胰凝

11、乳蛋白酶活性中胰凝乳蛋白酶活性中心絲氨酸的乙?；慕z氨酸的乙酰化硝基苯乙酸鹽反應(yīng)強(qiáng)硝基苯乙酸鹽反應(yīng)強(qiáng)苯乙酸鹽反應(yīng)弱苯乙酸鹽反應(yīng)弱疏水環(huán)境疏水環(huán)境阻止產(chǎn)物中電荷分離的反應(yīng)阻止產(chǎn)物中電荷分離的反應(yīng)加速電荷中和的反應(yīng)加速電荷中和的反應(yīng)第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)修飾的方法學(xué)化學(xué)修飾的方法學(xué)一、修飾反應(yīng)專一性的控制一、修飾反應(yīng)專一性的控制（一）試劑的選擇（一）試劑的選擇選擇試劑在很大程度上要依據(jù)修飾目的。選擇試劑在很大程度上要依據(jù)修飾目的。反應(yīng)類型反應(yīng)類型反應(yīng)類型反應(yīng)類型對(duì)于沒(méi)有電荷分離和電荷只是從一個(gè)離子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離子的反對(duì)于沒(méi)有電荷分離和電荷只是從一個(gè)離子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離子的反應(yīng)，則介質(zhì)的極性不重要。應(yīng)，則

12、介質(zhì)的極性不重要。對(duì)氨基對(duì)氨基的修飾的修飾修飾所有氨基，而不修飾其它基團(tuán)修飾所有氨基，而不修飾其它基團(tuán);僅修飾僅修飾-氨基；氨基；修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基，以及修飾暴露的或反應(yīng)性高的氨基，以及修飾有催化活性的氨基等。修飾有催化活性的氨基等。修飾的部位和程度一般可用選擇適當(dāng)?shù)脑噭┖头磻?yīng)條件修飾的部位和程度一般可用選擇適當(dāng)?shù)脑噭┖头磻?yīng)條件來(lái)控制。來(lái)控制。選擇蛋白質(zhì)修選擇蛋白質(zhì)修飾劑要考慮：飾劑要考慮：修飾反應(yīng)要完成到什么程度；修飾反應(yīng)要完成到什么程度；對(duì)個(gè)別氨基酸殘基是否專一；對(duì)個(gè)別氨基酸殘基是否專一；在反應(yīng)條件下，修飾反應(yīng)有沒(méi)有限度；在反應(yīng)條件下，修飾反應(yīng)有沒(méi)有限度；修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本

13、保持不變；修飾后蛋白質(zhì)的構(gòu)象是否基本保持不變；是否需要分離修飾后的衍生物；是否需要分離修飾后的衍生物；反應(yīng)是否需要可逆；反應(yīng)是否需要可逆；是否適合于建立快速、方便的分析方法。是否適合于建立快速、方便的分析方法。如果修飾的目的是改變蛋白質(zhì)的帶電狀況或溶解性，如果修飾的目的是改變蛋白質(zhì)的帶電狀況或溶解性，必須選擇能引入最大電荷量的試劑。必須選擇能引入最大電荷量的試劑。如果要修飾的蛋白質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑不穩(wěn)定，必須在水介質(zhì)如果要修飾的蛋白質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑不穩(wěn)定，必須在水介質(zhì)中反應(yīng)，則應(yīng)選擇在水中有一定溶解性的試劑。中反應(yīng)，則應(yīng)選擇在水中有一定溶解性的試劑。還必須考慮，反應(yīng)生成物容易進(jìn)行定量測(cè)定；試劑的還必須考

14、慮，反應(yīng)生成物容易進(jìn)行定量測(cè)定；試劑的體積小一些為宜。體積小一些為宜。用于修飾酶活性部位的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備的特用于修飾酶活性部位的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備的特征：征：選擇性地與一個(gè)氨基酸殘基反應(yīng)；選擇性地與一個(gè)氨基酸殘基反應(yīng)；反應(yīng)在酶蛋白不變性的條件下進(jìn)行；反應(yīng)在酶蛋白不變性的條件下進(jìn)行；標(biāo)記的殘基在肽中穩(wěn)定，很易通過(guò)降解分離出來(lái)進(jìn)行鑒定；標(biāo)記的殘基在肽中穩(wěn)定，很易通過(guò)降解分離出來(lái)進(jìn)行鑒定；反應(yīng)的程度能用簡(jiǎn)單的方法測(cè)定。反應(yīng)的程度能用簡(jiǎn)單的方法測(cè)定。（二）反應(yīng)條件的選擇（二）反應(yīng)條件的選擇條件條件不造成蛋白質(zhì)不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性的不可逆變性有利于專一性有利于專一性修飾蛋白質(zhì)修飾蛋白質(zhì)（

15、三）反應(yīng)的專一性（三）反應(yīng)的專一性若修飾劑專一性較差，除控制反應(yīng)條件外，可利用其它途徑實(shí)若修飾劑專一性較差，除控制反應(yīng)條件外，可利用其它途徑實(shí)現(xiàn)修飾的專一性?，F(xiàn)修飾的專一性。1.利用蛋白質(zhì)分子中，某些基團(tuán)的特殊活性蛋白質(zhì)，特利用蛋白質(zhì)分子中，某些基團(tuán)的特殊活性蛋白質(zhì)，特殊的空間結(jié)構(gòu)，能影響某些基團(tuán)的活性殊的空間結(jié)構(gòu)，能影響某些基團(tuán)的活性位置專一性：在蛋白質(zhì)分子中特別活潑的基團(tuán)，在適當(dāng)條件下位置專一性：在蛋白質(zhì)分子中特別活潑的基團(tuán)，在適當(dāng)條件下只是其本身發(fā)生作用，而其它基團(tuán)皆不作用。只是其本身發(fā)生作用，而其它基團(tuán)皆不作用。2.選擇不同的反應(yīng)選擇不同的反應(yīng)pH蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)是不同的

16、，所以控制不同的蛋白質(zhì)分子中各功能基的解離常數(shù)是不同的，所以控制不同的反應(yīng)反應(yīng)pH，也就控制了各功能基的解離程度，從而有利于修飾的，也就控制了各功能基的解離程度，從而有利于修飾的專一性。專一性。碘乙酸對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，試劑可與半胱氨酸、甲硫氨酸、組碘乙酸對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，試劑可與半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸的側(cè)鏈及氨酸的側(cè)鏈及-氨基、氨基、-氨基發(fā)生作用。氨基發(fā)生作用。當(dāng)反應(yīng)當(dāng)反應(yīng)pH=6時(shí)，只專一地與組氨酸的咪唑基作用。時(shí)，只專一地與組氨酸的咪唑基作用。當(dāng)反應(yīng)當(dāng)反應(yīng)pH=3時(shí)，只專一地與時(shí)，只專一地與甲硫甲硫氨酸的氨酸的側(cè)鏈側(cè)鏈作用。作用。在酸性在酸性pH下，比較活潑的巰基和氨基，以帶質(zhì)子形式

17、存在，下，比較活潑的巰基和氨基，以帶質(zhì)子形式存在，變成不活潑狀態(tài)。變成不活潑狀態(tài)。ICH2COO-+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)SHpH7蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)S CH2COO-+H+I-ICH2COO-+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)SCH3pH2蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)S CH2COO-+I-CH3ICH2COO-+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)NH2pH8.5蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)NHCH2COO-+H+I-ICH2COO-NHN+蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)pH5.5NCH2COO-N蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)+H+I-3.利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性在高在高pH下，氰酸、二硫化碳等可把氨基轉(zhuǎn)變成脲和脲的衍生下，氰酸、二硫化碳等可把氨基轉(zhuǎn)變成脲和脲的衍生物。但因物。但因pH高，巰基

18、與試劑反應(yīng)的產(chǎn)物迅速被分解。高，巰基與試劑反應(yīng)的產(chǎn)物迅速被分解。4.親和標(biāo)記親和標(biāo)記親和標(biāo)記試劑除了能與蛋白質(zhì)作用外，還要求試劑的結(jié)構(gòu)和與蛋親和標(biāo)記試劑除了能與蛋白質(zhì)作用外，還要求試劑的結(jié)構(gòu)和與蛋白質(zhì)作用的底物或抑制劑相似。白質(zhì)作用的底物或抑制劑相似。5.差別標(biāo)記差別標(biāo)記在底物或抑制劑存在下進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)，由于它們保護(hù)著蛋白在底物或抑制劑存在下進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)，由于它們保護(hù)著蛋白質(zhì)的活性部位基團(tuán)，使這些基團(tuán)不能與試劑作用。然后將過(guò)量質(zhì)的活性部位基團(tuán)，使這些基團(tuán)不能與試劑作用。然后將過(guò)量的底物或抑制劑除去，所得到的部分修飾的蛋白質(zhì)再與含同位的底物或抑制劑除去，所得到的部分修飾的蛋白質(zhì)再與含同位素標(biāo)

19、記的同樣試劑作用，結(jié)果只有原來(lái)被底物或抑制劑保護(hù)的素標(biāo)記的同樣試劑作用，結(jié)果只有原來(lái)被底物或抑制劑保護(hù)的基團(tuán)是帶放射性同位素標(biāo)記的。基團(tuán)是帶放射性同位素標(biāo)記的。6.利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異在結(jié)晶狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)，可以提高修飾的專一性。在結(jié)晶狀態(tài)下進(jìn)行反應(yīng)，可以提高修飾的專一性。二、修飾程度和修飾部位的測(cè)定二、修飾程度和修飾部位的測(cè)定最常使用的是間接法。最常使用的是間接法。三、化學(xué)修飾結(jié)果的解釋三、化學(xué)修飾結(jié)果的解釋（一）蛋白質(zhì)功能改變的解釋（一）蛋白質(zhì)功能改變的解釋在確證試劑已經(jīng)作用于蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，除驗(yàn)證修飾蛋白質(zhì)在在確證試劑已經(jīng)作用于蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，除驗(yàn)證修飾蛋白質(zhì)在溶液中的

20、構(gòu)象是否發(fā)生變化外，還要證明修飾作用是否發(fā)生在溶液中的構(gòu)象是否發(fā)生變化外，還要證明修飾作用是否發(fā)生在活性部位上?；钚圆课簧?。常用方法：常用方法：1.如果修飾發(fā)生在活性部位或必需基團(tuán)上，則蛋白質(zhì)活性的如果修飾發(fā)生在活性部位或必需基團(tuán)上，則蛋白質(zhì)活性的喪失于修飾程度一定成某種化學(xué)計(jì)量關(guān)系，而且底物必然能喪失于修飾程度一定成某種化學(xué)計(jì)量關(guān)系，而且底物必然能降低修飾蛋白質(zhì)的失活程度，而與活性部位不能結(jié)合的分子降低修飾蛋白質(zhì)的失活程度，而與活性部位不能結(jié)合的分子則沒(méi)有這種影響。則沒(méi)有這種影響。2.當(dāng)采用可逆保護(hù)試劑時(shí)，修飾失活的蛋白質(zhì)隨保護(hù)基的去除當(dāng)采用可逆保護(hù)試劑時(shí)，修飾失活的蛋白質(zhì)隨保護(hù)基的去除可重

21、新恢復(fù)活力，而且恢復(fù)程度應(yīng)與保護(hù)基去除量成一定比例可重新恢復(fù)活力，而且恢復(fù)程度應(yīng)與保護(hù)基去除量成一定比例關(guān)系。關(guān)系。修飾劑也可修飾遠(yuǎn)離活性部位的氨基酸，使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改修飾劑也可修飾遠(yuǎn)離活性部位的氨基酸，使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，造成蛋白質(zhì)活力喪失。引入帶電或龐大基團(tuán)時(shí)易出現(xiàn)這種變，造成蛋白質(zhì)活力喪失。引入帶電或龐大基團(tuán)時(shí)易出現(xiàn)這種情況。情況。(二）修飾殘基的不穩(wěn)定性二）修飾殘基的不穩(wěn)定性原始修飾以后，還可能發(fā)生共價(jià)改變。原始修飾以后，還可能發(fā)生共價(jià)改變。如?；D(zhuǎn)移、巰基轉(zhuǎn)移、鹵素轉(zhuǎn)移及二硫交換過(guò)程可能自發(fā)地如?；D(zhuǎn)移、巰基轉(zhuǎn)移、鹵素轉(zhuǎn)移及二硫交換過(guò)程可能自發(fā)地或在純化、降解過(guò)程中發(fā)生。或在純化

22、、降解過(guò)程中發(fā)生。（三）沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)的修飾（三）沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)的修飾咪唑基、巰基、羧基等在反應(yīng)條件下不穩(wěn)定或在以后的純化咪唑基、巰基、羧基等在反應(yīng)條件下不穩(wěn)定或在以后的純化中被水解，因而檢測(cè)不出。中被水解，因而檢測(cè)不出。有些修飾反應(yīng)不能檢測(cè)出來(lái)，是由于它們?cè)诘鞍踪|(zhì)化學(xué)中不有些修飾反應(yīng)不能檢測(cè)出來(lái)，是由于它們?cè)诘鞍踪|(zhì)化學(xué)中不占優(yōu)勢(shì)。占優(yōu)勢(shì)。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈的修飾一、氨基的修飾一、氨基的修飾氨基氨基修飾修飾引入正電荷的修飾引入正電荷的修飾引入負(fù)電荷的修飾引入負(fù)電荷的修飾電荷消失的修飾電荷消失的修飾（一）引入正電荷的修飾（一）引入正電荷的修飾下列試劑修飾賴氨酸后，可在賴氨酸側(cè)鏈上留

23、下可電離的帶正下列試劑修飾賴氨酸后，可在賴氨酸側(cè)鏈上留下可電離的帶正電基團(tuán)。電基團(tuán)。1.還原烷基化還原烷基化ENZNH2 + RHCO-H2O+H2OENZN=CHRENZNHCH2RH希夫堿希夫堿所用的醛有不同所用的醛有不同R基基醛醛2.用甲基乙亞酰胺脒化用甲基乙亞酰胺脒化H2NROC RENZNH2 CRNH2 ENZNH R OH+pH8.5（二）消除電荷的修飾（二）消除電荷的修飾這類試劑可抑制賴氨酸的這類試劑可抑制賴氨酸的-NH2的質(zhì)子化，使形成的衍生物不帶的質(zhì)子化，使形成的衍生物不帶電。電。ENZNH2 1.乙?；阴；疧CCCH3CH3OOpH7+C CH3OENZNHCH3COO

24、-+H+2.甲氨?；饔眉装滨；饔肊NZNH2 + HNCOpH=7COENZNHNH2+ HNCO+ H2OENZS-副反應(yīng)：副反應(yīng)：CONH2ENZS+ OH-pH68甲基乙亞酰胺甲基乙亞酰胺醋酸酐醋酸酐氰酸鹽氰酸鹽巰基巰基優(yōu)點(diǎn)是氰酸鹽優(yōu)點(diǎn)是氰酸鹽離子體積小離子體積小ENZO-+ HNCO+ H2OpH5COOENZNH2+ OH-COENZO-+ HNCO+ H2OpH=5CCOOENZNH2+ OH-OENZ+ HNCONHNpH=8CENZNH2ONHN3.芳基化芳基化三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）與氨基作用，產(chǎn)生三硝基苯衍生物，反）與氨基作用，產(chǎn)生三硝基苯衍生物，反應(yīng)產(chǎn)物為黃色。應(yīng)產(chǎn)物為黃色。 TNBS也能與巰基作用。也能與巰基作用。SO3HNO2NO2NO2NH2R+pH7+H+NHR + SO3HNO2NO2NO2酚基酚基羧基羧基咪唑基咪唑基TNBS（黃色）（黃色）