微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基配制相關(guān)器皿的包扎及

1、 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二培養(yǎng)基配制、相關(guān)器皿培養(yǎng)基配制、相關(guān)器皿的包扎及消毒滅菌的包扎及消毒滅菌本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求明確培養(yǎng)基制備原理通過對培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟了解消毒、滅菌的原理及方法，掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌學(xué)習(xí)并練習(xí)相關(guān)器皿的包扎方法內(nèi) 容 一培養(yǎng)基及無菌水的制備一、培養(yǎng)基的相關(guān)知識介紹1 1、培養(yǎng)基的定義和組成培養(yǎng)基：指由人工配制的、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合營養(yǎng)基質(zhì)（反映培養(yǎng)基的2個作用？）。包括六大營養(yǎng)要素：碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子、能源、水。2、培養(yǎng)基制備原則和方法四個原則：目的明確；營養(yǎng)協(xié)調(diào)；物理化學(xué)條件適宜；經(jīng)濟(jì)節(jié)約。C/N：指在微生物培養(yǎng)基

2、中所含的碳源中碳原子摩爾數(shù)與氮源中的氮原子摩爾數(shù)之比。四種方法：生態(tài)模擬；參閱文獻(xiàn)；精心設(shè)計；試驗(yàn)比較。3、物理化學(xué)條件適宜的說明pH值：滲透壓和水活度（aw）： 在同溫同壓下，某溶液的蒸氣壓（P）與純水蒸氣壓（P0）之比。氧化還原電位： 針對厭氧菌分離特別需要注意（半胱氨酸、巰基乙醇酸鈉等）4、培養(yǎng)基的分類 （1 1）按成分分對成分種類、量是否清楚 天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基（組合培養(yǎng)基） 半合成培養(yǎng)基（也稱半組合培養(yǎng)基） （2 2）按物理狀態(tài)分 固體培養(yǎng)基（凝固劑的使用1.5%-2.5%)；固體基質(zhì)的使用） 半固體培養(yǎng)基（凝固劑使用量較低0.2-0.7%） 液體培養(yǎng)基（工業(yè)生產(chǎn)中的重要性） 脫

3、水培養(yǎng)基（也稱預(yù)制干燥培養(yǎng)基）（3 3）按培養(yǎng)基對微生物的功能分 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般微生物生長繁殖需要的基本營養(yǎng)物質(zhì)。 選擇性培養(yǎng)基：根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基，具有使混合菌樣中的劣勢菌變成優(yōu)勢菌的功能，廣泛用于菌種篩選等領(lǐng)域?！巴镀渌?、取其所抗”。高通量篩選的建立。 鑒別性培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入有能與目的菌的無色代產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，從而達(dá)到只須用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌菌落的培養(yǎng)基。直觀、專一性（伊紅美蘭培養(yǎng)基，EMB）大腸桿菌在EMB培養(yǎng)基上的形態(tài)二、培養(yǎng)基的配方 一個實(shí)驗(yàn)班共配置3種固體培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

4、高氏1號培養(yǎng)基馬丁氏培養(yǎng)基 按照老師的劃分進(jìn)行，每個實(shí)驗(yàn)小組都要準(zhǔn)備，幾個實(shí)驗(yàn)小組配1種培養(yǎng)基，供全班使用1 1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 （分離、培養(yǎng)細(xì)菌用）500ml/500ml/組牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000ml瓊脂 1520gpH 7.47.6 可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO3 1.0g K2HPO43H2O 0.5g MgSO47H2O 0.5g FeSO47H2O 0.01g 瓊脂 1525g 水 1000ml pH 7.47.6 臨用時無菌操作在800ml培養(yǎng)基中加入3%的K2Cr2O7溶液1ml2 2、高氏1 1號培養(yǎng)基 （分離、培

5、養(yǎng)放線菌用）500ml/500ml/組 KH2PO4 1 g MgSO47H2O 0.5 g 蛋白胨 5 g 葡萄糖 10 g 瓊脂 20 g 水 1000ml pH 6.0 配好后在此培養(yǎng)基中，按1000ml加入1%孟加拉紅水溶液3.3 ml。 臨用時以無菌操作在100ml培養(yǎng)基中加入1%的鏈霉素0.3ml，使其終濃度為30ug/ml。 3 3、馬丁氏培養(yǎng)基 （分離、培養(yǎng)真菌用）500ml/500ml/組三、培養(yǎng)基配制的步驟1、計算 按照配方要求（一般為1000ml的量）和實(shí)際配制培養(yǎng)基的量，計算出不同組分需要的量。2、稱量、溶解 按培養(yǎng)基配方在三角瓶中先加水（如無加入后大幅度改變原體積的物

6、質(zhì)，可以把水加足），然后依次準(zhǔn)確稱取各藥品并分別逐一溶解于其中（瓊脂需加熱溶解），最后補(bǔ)充水到所需體積。（注意：各成分之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生不溶的沉淀；培養(yǎng)基成分中有影響pH試紙的顯色的物質(zhì)，調(diào)pH值后再加入）3、調(diào)pH 用510%NaOH、15%HCl溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)到所需范圍，根據(jù)需要用精密pH試紙或pH計來確定。4、包扎（有一定規(guī)范要求） 5、滅菌（高壓蒸汽滅菌：121.3,1530min） 四、培養(yǎng)基配制過程中需注意的事項(xiàng)先加水易產(chǎn)生沉淀逐一溶解易產(chǎn)生沉淀調(diào)節(jié)pH容易忘記加塞滅菌（或過濾除菌）即時滅菌煮過或加熱過培養(yǎng)基，注意水的蒸發(fā)補(bǔ)足五、培養(yǎng)基配制中的2點(diǎn)說明 1、量微的藥品（天平

7、無法稱量），以溶液形式加入（先配制成一定濃度的溶液）； 2、粘稠的藥品和物品，稱好后與稱量紙一起放入溶液中，待藥品溶解后取出稱量紙；或利用減稱量法完成（從總藥品量中以減量稱出所需要的量）。六、無菌水的準(zhǔn)備經(jīng)滅菌處理后的蒸餾水或自來水。1、量取90mL蒸餾水在250mL三角瓶，內(nèi)加玻珠 1瓶2、吸取9mL蒸餾水在18*180試管中 6支包扎后滅菌。注意！標(biāo)記（記號筆）寫在器皿壁或外包裝紙上（如還需要高壓蒸汽滅菌，只能寫在外包裝紙上）；不要直接寫在瓶（管）塞或包裝棉布上。內(nèi) 容 二消 毒 與 滅 菌一、消毒、滅菌的定義和常見方法 消毒：指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體。 滅菌：指殺滅一切微生物的營

8、養(yǎng)體、芽孢和孢子。 常見方法： 加熱法：包括干熱滅菌和濕熱滅菌 過濾除菌 輻射滅菌 化學(xué)藥品滅菌高溫滅菌或消毒的方法 過濾除菌技術(shù)（正壓和負(fù)壓之分） 濾膜過濾器微孔濾膜（醋酸纖維、硝酸纖維、火棉膠、有機(jī)大分子物質(zhì)），孔徑0.22和0.45um。 玻璃濾器玻璃粉燒結(jié)板（G1G6） 蔡氏（Seitz）濾器多層石棉纖維板（整體為金屬制成） 其它（不常見）陶瓷、硅藻土制濾燭形： 張伯倫（Chamberland）濾器 伯克菲爾德（Berkefeld）濾器 曼德勒爾（Mandler）濾器膜過濾裝置不耐熱的液體培養(yǎng)基的除（滅）菌膜過濾裝置細(xì)菌截留于膜過濾器濾膜表面二、加熱滅菌的方法1、干熱滅菌法： 火焰灼燒

9、法 烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法2、濕熱滅菌（消毒）法： 常壓下：巴氏消毒法；煮沸消毒法；間 歇滅菌法。 加壓下：常規(guī)加壓滅法；連續(xù)加壓滅菌 法。三、干熱滅菌火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌兩種方法。通常所說的干熱滅菌是在電熱干燥箱內(nèi)利用高溫干燥空氣（160170）進(jìn)行滅菌，此法適用于玻璃器皿（吸管、培養(yǎng)皿等）的滅菌。干熱滅菌需要注意的事項(xiàng)不能對塑料器皿和培養(yǎng)基滅菌；控制好溫度和時間（160180，2小時），防止包扎的報紙焦糊；滅菌過程（未完全冷下來，60 以下 ）不要打開烘箱門，防止報紙著火或玻璃器皿遇冷爆裂。四、高壓蒸汽滅菌鍋的結(jié)構(gòu)及使用高壓蒸汽滅菌的原理 高壓蒸汽滅菌器是利用加壓的飽和蒸汽（潛熱）對物品、

10、器械、藥液等滅菌的設(shè)備，適用于科學(xué)研究、醫(yī)療衛(wèi)生、食品等實(shí)驗(yàn)室或工廠使用造成蛋白質(zhì)等變性失活。 潛熱是指當(dāng)1g100的水蒸汽變成1g100水時，釋放出2255.2J（1卡=4.184焦耳）的熱量。 各種高壓蒸汽滅菌器之間的區(qū)別只在于自動化程度的高低（水位控制、溫度恒定控制、時間控制、自動排放冷空氣、程序化顯示） 飽和蒸汽壓壓力指示溫度 直接利用溫度探測器指示溫度典型的高壓蒸汽滅菌鍋縱剖面結(jié)構(gòu)壓力調(diào)節(jié)器安全閥排氣口控制柄記錄儀門墊圈放電器蒸汽閥蒸汽夾層阻板蒸汽供給蒸汽供應(yīng)閥溫度感應(yīng)器蒸汽凝汽瓣廢汽冷凝器蒸汽通入夾層蒸汽由夾層到滅菌室夾層冷凝水收集口蒸汽由夾層進(jìn)入滅菌室和蒸汽排出口臥式滅菌鍋示意圖

11、（簡圖）蒸汽進(jìn)口滅菌過程出氣口（冷空氣和蒸汽）滅菌時間到排汽口壓力表蒸汽排氣閥溫度計閥蒸汽供應(yīng)閥門消毒室夾套（層） 立式壓力滅菌器手提式滅菌鍋臥式矩型和圓型壓力蒸汽消毒器高壓蒸汽滅菌過程：1、取出內(nèi)筒，檢查水位；2、加水至淹過電發(fā)熱管和內(nèi)筒支架；3、放入內(nèi)筒，并在其中放入需滅菌物品（要求松散）；4、加蓋（對稱旋緊），打開放汽閥；5、加熱（有內(nèi)外兩種），升溫；6、排除冷空氣由放汽閥冒汽35分鐘；7、關(guān)閉放汽閥（有些滅菌鍋滅菌過程中一直保持較小排氣或到一定溫度自動關(guān)閉） ，加壓升溫至所需溫度或壓力；8、保溫定時至所需時間；9、不再加熱，降溫至壓力表為“0”，打開放汽閥；10、開蓋取物（注意蒸汽燙傷

12、）?？諝馀懦葘缇鷾囟鹊挠绊懸恍┘?xì)菌芽孢濕熱滅菌所需時間消毒、滅菌的生物指示菌 嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus） 結(jié)核分枝桿菌致病菌指示菌（Mycobacterium tuberculosis 沙門氏菌致病菌指示菌（通用檢測）（Salmonella spp） 高壓蒸汽滅菌效果的監(jiān)測方法（3種） 1、工藝（程序）監(jiān)測壓力表、溫度計等，最常見，每次都使用； 2、化學(xué)指示監(jiān)測 特定化合物熔點(diǎn)（熔化前后晶體形態(tài)不同，硫磺熔點(diǎn)115、乙酰替苯胺116、脫水琥珀酸120、苯甲酸122.4等結(jié)晶 ）、滅菌指示膠帶（變色反應(yīng)）； 3、生物指示劑監(jiān)測 特定微生物（需經(jīng)

13、培養(yǎng)）。五、實(shí)驗(yàn)室常用滅菌方法 1、高壓蒸汽滅菌常用121.3，20min和115，10min兩種條件進(jìn)行；適用于耐熱性溶液、培養(yǎng)基和水的滅菌； 2、熱空氣干熱滅菌160170，2hr；適用于玻璃器皿和金屬工具的滅菌； 3、灼燒滅菌酒精燈和電加熱，適用于接種工具的滅菌； 4、過濾除菌現(xiàn)在一般使用微孔濾膜（0.22m或0.45m），適用于非耐熱性溶液和培養(yǎng)基的過濾除菌。內(nèi) 容 三相關(guān)器皿的包扎方法一、器皿包扎的作用 1、濕熱滅菌時防止冷凝水的污染； 2、滅菌后可以長期放置，保持器皿等的無菌狀態(tài)和防止灰塵的污染。二、相關(guān)器皿的包扎要求 利用報紙、牛皮紙或?qū)Ｓ闷餍蛋?，重點(diǎn)練習(xí)報紙包扎。 1、培養(yǎng)皿的包扎 雙層大報紙、12套包扎成1包 2、吸管的的包扎 吸管先塞棉花（松緊適度），利用寬5cm左右的長條形報紙裹扎 3、試管和三角瓶的包扎 4、涂布器 （刮子）的包扎三、包扎中的幾點(diǎn)說明 包扎紙大小適中，器皿或器材不外露，塞子、紗（棉）布、瓶口、管口等不外露。 包扎試管和三角瓶時，包扎線向下一點(diǎn)，不要扎在塞子上。 裝有培養(yǎng)基等液體的容器，包扎過程或包扎好后不要倒置（包括水平放置），以免造成污染（塞子）和內(nèi)裝液體不準(zhǔn)。四、利用吸管筒（銅制或不銹鋼制）包扎吸管滅菌不銹鋼吸管筒、培養(yǎng)皿筒本次實(shí)驗(yàn)完成的內(nèi)容1、90mL無菌水1瓶（250mL三角瓶，內(nèi)