金黃色葡萄球菌致病性及檢測(cè)技術(shù)

1、金黃色葡萄球菌的致病性及檢測(cè)技術(shù)2016/6/16簡(jiǎn)介 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人類(lèi)的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），有“嗜肉菌的別稱，是革蘭氏陽(yáng)性菌，可引起許多嚴(yán)重感染。 金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度37C，最適生長(zhǎng)pH7.4，干燥環(huán)境下可存活數(shù)周。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑0.51.0mm。 金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)磺胺類(lèi)藥物、青霉素、紅霉素、土霉素、新霉素等抗生素敏感，但易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)堿性染料敏感。流行病學(xué) 美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色

2、葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。 金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生難題，在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則占到45%。中國(guó)金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也時(shí)有發(fā)生。 2002年，澳大利亞一次公眾活動(dòng)因前一天準(zhǔn)備的食物貯存不當(dāng)導(dǎo)致250人出現(xiàn)惡心、嘔吐、胃痙攣的癥狀，其中100多人因?yàn)槊撍枰M(jìn)醫(yī)院治療。 2001年4月12日，無(wú)錫市錫山區(qū)所轄小學(xué)、幼兒園因課間加餐飲用袋裝牛奶飲料導(dǎo)致食物中毒事件。 2000年6月底到7月中，日本有14555人被感染，感染源來(lái)自日本當(dāng)時(shí)最大的牛奶生產(chǎn)商雪印乳業(yè)。1997年，美國(guó)佛羅里達(dá)31人食用被污

3、染的火腿片被感染，癥狀持續(xù)了大約24小時(shí)。 金黃色葡萄球菌流行病一般多見(jiàn)于春夏季。 中毒食品種類(lèi)多，如奶、肉、蛋、魚(yú)及其制品，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位，常成為污染源。 金黃色葡萄球菌可引起局部化膿感染、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。 金黃色葡萄球菌為侵襲性細(xì)菌，能產(chǎn)生毒素，對(duì)腸道破壞性大，金黃色葡萄球菌腸炎起病急，中毒癥狀嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為嘔吐、發(fā)熱、腹瀉。 金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶： a.溶血毒素：外毒素，分、四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體

4、局部缺血和壞死 b.殺死白細(xì)胞素：可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān) d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來(lái)作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌 e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C1、C2、C3、D、E及F八種血清型。腸毒素可耐受100C煮沸30分鐘而不被破壞。它引起的食物中毒癥狀是嘔吐和腹瀉。 此外，金黃色葡萄球菌還產(chǎn)生溶表皮素、明膠酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。檢測(cè)與診斷 標(biāo)

5、本采集標(biāo)本采集 采自不同感染部位的各種標(biāo)本，包括血液、腦脊液、穿刺液；痰液、膿液、創(chuàng)傷分泌物、尿液、糞便和嘔吐物等。 直接涂片鏡檢直接涂片鏡檢 直接涂片檢查在正常情況下呈無(wú)菌狀態(tài)的體液標(biāo)本如血液、腦脊液、穿刺液等，若有檢出革蘭氏陽(yáng)性，顯微鏡下呈葡萄狀排列、無(wú)芽胞、莢膜，直徑0.5-1m的球菌。即具有重要的臨床價(jià)值。 分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 可以選用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血平板和高鹽甘露醇平板，血平板用葡萄糖肉湯增菌培養(yǎng)基。該菌在普通肉湯中呈均勻迅速混濁生長(zhǎng)；若接種于瓊脂平板上35過(guò)夜后可形成直徑約23mm的厚菌落、濕潤(rùn)有光澤、呈金黃色不透明圓形凸起。若接種于血平板，菌落周?chē)尚纬擅黠@的透明的溶血環(huán)。在高

6、甘露醇平板上金黃色葡萄球菌生成淡橙黃色菌落，以此可與其他凝固酶陰性的葡萄球菌相鑒別。 鑒別實(shí)驗(yàn)鑒別實(shí)驗(yàn) 一、血漿凝固酶試驗(yàn) 血漿凝固酶是金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的，與其致病力有關(guān)的一種侵襲性酶，其作用是使血漿中的纖維蛋白在菌體表面沉積和凝固以阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬。 血漿凝固酶分為結(jié)合型和游離型。前者結(jié)合在細(xì)菌的細(xì)胞壁上，能直接作用于血漿中的纖維蛋白原，使之轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，環(huán)繞菌體而形成凝塊。而游離型血漿凝固酶則在產(chǎn)生后被分泌到菌體外，不能直接作用于纖維蛋白原，但可以激活血漿凝血酶原，使之轉(zhuǎn)化成凝血酶，后者再作用于纖維蛋白原使其轉(zhuǎn)化為纖維蛋白。 具體的測(cè)量方法也因此分為玻片法和試管法兩種。1、玻片法：

7、將待試菌落乳化于玻片上的鹽水中，經(jīng)1020S證實(shí)無(wú)自凝后，用接種環(huán)取人或兔血漿一環(huán)，與乳化菌液混合，出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性，另設(shè)生理鹽水為陰性對(duì)照。2、試管法：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時(shí)培養(yǎng)物充分混勻，置37培養(yǎng)，每隔半小時(shí)觀察一次，連續(xù)觀察6小時(shí)，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時(shí)，內(nèi)容物不流動(dòng)，判為陽(yáng)性。二、耐熱核酸酶試驗(yàn)將24小時(shí)肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種于甲苯胺蘭-DNA平板，35培養(yǎng)24小時(shí)，在刺種線周?chē)霈F(xiàn)淡粉色者為陽(yáng)性。本試驗(yàn)金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性。三、甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)金黃色葡萄球菌可發(fā)酵甘露醇。四、Staphaurex 膠乳凝集實(shí)

8、驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌的一種快速、簡(jiǎn)便的商品化直接凝集試驗(yàn)。其基本原理是在紙片上滴加包被有纖維蛋白原和IgG抗體的聚苯乙烯膠乳，然后用接種環(huán)挑取待鑒定菌株的新鮮培養(yǎng)物加入混勻，若出現(xiàn)凝集塊現(xiàn)象即為陽(yáng)性。 生化鑒定生化鑒定 如上述，注意與其他凝固酶陽(yáng)性的葡萄球菌的鑒別要點(diǎn)：PYR（吡咯烷酮-萘基酰胺試驗(yàn)陰性；VP試驗(yàn)陽(yáng)性；鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)陰性。 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和對(duì)流免疫電泳方法可檢測(cè)金葡菌的磷壁酸抗體。 分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法 包括PFGE脈沖場(chǎng)凝膠電泳以及酶切圖譜分析等。定量檢測(cè)方法 目前關(guān)于食品中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)方法主要有Baird-Parker平板計(jì)

9、數(shù)法、顯色培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法、Petrifilm TM 測(cè)試片計(jì)數(shù)法、MPN計(jì)數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附法、反相被動(dòng)乳膠凝集法、放射免疫測(cè)量法、反相血凝實(shí)驗(yàn)、纖維玻片凝膠雙擴(kuò)散法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)等。 顯色培養(yǎng)基A計(jì)數(shù)法：稀釋好的菌液0.2 mL涂布接種培養(yǎng)基平板上，361培養(yǎng)24 h，按說(shuō)明書(shū)判讀，可疑菌落做補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)（血漿凝固酶試驗(yàn)，目標(biāo)菌落血漿凝固酶試驗(yàn)為陽(yáng)性）。 顯色培養(yǎng)基B計(jì)數(shù)法：稀釋好的菌液0.2 mL涂布接種培養(yǎng)基平板上，361培養(yǎng)24 h，按說(shuō)明書(shū)判讀，可疑菌落做補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)（滴加1 mol/L鹽酸，目標(biāo)菌落有透明圈）。 Petrifilm TM 測(cè)試片計(jì)數(shù)法：稀釋好的菌液1 mL接入測(cè)試片，靜置測(cè)試片1 min，361培養(yǎng)24 h，按說(shuō)明書(shū)判讀，必要時(shí)對(duì)可疑菌落用確認(rèn)反應(yīng)片