電離輻射的分子生物學效應

1、電離輻射的分子生物學效應尚增甫402樓2319房間Zengfu.S電泳及測序DNA是電離輻射的重要靶分子紡錘體監(jiān)測點（染色體結構監(jiān)測點）DNA復制細胞有絲分裂異常檢測DNA損傷修復機制DNA損傷類型DNA損傷檢測方法細胞有絲分裂細胞骨架結構與紡錘體DNA分子組成細胞周期監(jiān)測點第一節(jié)第一節(jié) DNA分子和染色質(zhì)的基本性分子和染色質(zhì)的基本性狀及分析手段狀及分析手段DNA是電離輻射的重要靶分子是電離輻射的重要靶分子原因：與其它細胞內(nèi)生物大分子相比，損傷的原因：與其它細胞內(nèi)生物大分子相比，損傷的DNA只能被修復不能被替換。只能被修復不能被替換。伴刀豆球蛋白（伴刀豆球蛋白（Con A）具有廣闊的適用性，是

2、一種重要的生化和免疫研究試劑。）具有廣闊的適用性，是一種重要的生化和免疫研究試劑。Con A能沉淀多種糖類，葡聚糖和果聚糖等很多其它多糖，以及免疫球蛋白和血型物質(zhì)等多種能沉淀多種糖類，葡聚糖和果聚糖等很多其它多糖，以及免疫球蛋白和血型物質(zhì)等多種糖蛋白，還沉淀肺炎球菌多糖，并能凝集多種紅細胞。糖蛋白，還沉淀肺炎球菌多糖，并能凝集多種紅細胞。如何證明如何證明DNA是細胞內(nèi)電離輻射的最為重要的靶分子？是細胞內(nèi)電離輻射的最為重要的靶分子？致50%中國倉鼠卵巢細胞死亡的劑量DNA雙螺旋結構雙螺旋結構Watson, Crick Wilkins1962 諾貝爾醫(yī)學獎得主諾貝爾醫(yī)學獎得主Rosalind Fr

3、anklin（19201958）DNA分子組成與分析分子組成與分析1、核酸的組成、核酸的組成堿基堿基脫氧核糖和核糖脫氧核糖和核糖核苷核苷核苷酸核苷酸多核苷酸多核苷酸 四種核苷酸（四種核苷酸（dAMP、dCMP、dGMP、dTMP）按照一定的排列順序，通按照一定的排列順序，通過磷酸二酯鍵連接形成的過磷酸二酯鍵連接形成的多聚核苷酸就是多聚核苷酸就是DNA，DNA是有方向性的分子，是有方向性的分子，即核苷酸的戊糖基的即核苷酸的戊糖基的5位不位不再與其它核苷酸相連是再與其它核苷酸相連是5末末端，核苷酸的戊糖基端，核苷酸的戊糖基3位不位不再連有其它核苷酸是再連有其它核苷酸是3末端，末端，兩個末端并不相同

4、，生物兩個末端并不相同，生物學特性也有差異。如未特學特性也有差異。如未特別注明別注明5和和3末端，一般約末端，一般約定，堿基序列的書寫是由定，堿基序列的書寫是由左向右書寫，左側(cè)是左向右書寫，左側(cè)是5末端，末端，右側(cè)為右側(cè)為3末端。末端。DNA電泳是基因工程中最基本的技術，電泳是基因工程中最基本的技術，DNA制備及濃度測定、制備及濃度測定、目的目的DNA片段的分離，重組子的酶切鑒定等都需要電泳完成。片段的分離，重組子的酶切鑒定等都需要電泳完成。根據(jù)分離根據(jù)分離DNA大小及類型的大小及類型的不同；不同；瓊脂糖凝膠電泳可分離的瓊脂糖凝膠電泳可分離的DNA片段大小因凝膠濃度不同而異，片段大小因凝膠濃度

5、不同而異，膠濃度為膠濃度為0.50.6%的凝膠可以分離的的凝膠可以分離的DNA片段范圍為片段范圍為20bp50kb。電泳結果用溴化乙錠（電泳結果用溴化乙錠（EB）染色后可直接在紫外下觀察。并且）染色后可直接在紫外下觀察。并且可觀察的可觀察的DNA條帶濃度為納克級；條帶濃度為納克級；原理：原理：DNA在泳動時的分子篩效應和電荷效應，可達到分離混在泳動時的分子篩效應和電荷效應，可達到分離混合物的目的。合物的目的。DNA在高于其等電點的溶液中帶負電，向陽極移在高于其等電點的溶液中帶負電，向陽極移動，其遷移速率與其相對分子量成反比動，其遷移速率與其相對分子量成反比。DNA的等電點為的等電點為44.5D

6、NA分析方法分析方法DNA凝膠電泳凝膠電泳分子篩效應和電荷效應分子篩效應和電荷效應質(zhì)粒（質(zhì)粒（Plasmid）是附加到細胞中的非細胞）是附加到細胞中的非細胞的染色體或的染色體或核核區(qū)區(qū)DNA原有原有的能夠自主復制的較小的的能夠自主復制的較小的DNA分子（即細胞附殖粒、分子（即細胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構形，它存在又胞附殖粒）。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構形，它存在于于許多細菌以及酵母菌等生物中許多細菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物，乃至于植物的線粒體等的線粒體等胞器中。胞器中。質(zhì)粒質(zhì)粒l 天然天然質(zhì)粒的質(zhì)粒的DNA長度從長度從數(shù)千堿基對至數(shù)十萬堿基對都數(shù)千堿基對至數(shù)十萬堿

7、基對都有。質(zhì)粒天然存在于有。質(zhì)粒天然存在于這些生物里面，有時候一個細胞里面可以同時有一種乃至于數(shù)種的質(zhì)粒同時存這些生物里面，有時候一個細胞里面可以同時有一種乃至于數(shù)種的質(zhì)粒同時存在。質(zhì)粒的套數(shù)（在。質(zhì)粒的套數(shù)（copy number）在細胞里從單一到數(shù)千都有可能。有時有）在細胞里從單一到數(shù)千都有可能。有時有些質(zhì)粒含有某種些質(zhì)粒含有某種抗藥基因（如大腸桿菌中抗藥基因（如大腸桿菌中就有含有就有含有抗四環(huán)素基因抗四環(huán)素基因的質(zhì)粒）。有的質(zhì)粒）。有一些質(zhì)粒攜帶一些質(zhì)粒攜帶的基因則的基因則可以賦予細胞額外的生理代謝能力，乃至于在一些細菌可以賦予細胞額外的生理代謝能力，乃至于在一些細菌中提高它的致病力。一

8、般來說，質(zhì)粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性的中提高它的致病力。一般來說，質(zhì)粒的存在與否對宿主細胞生存沒有決定性的作用。它作用。它是基因工程最是基因工程最常見常見的載體。的載體。質(zhì)粒提取原理質(zhì)粒提取原理溴化乙錠溴化乙錠 (Ethidium Bromide)Health HazardAcute toxicity DNA測序測序雙脫氧鏈末端終止法雙脫氧鏈末端終止法DNA測序測序雙脫氧鏈末端終止法雙脫氧鏈末端終止法DNA測序測序雙脫氧鏈末端終止法改進（毛細管電泳）雙脫氧鏈末端終止法改進（毛細管電泳）染色體結構染色體結構從從DNA到染色體到染色體2nm11nm30nm從從DNA到染色體到染色體300

9、nm700nm1400nm核小體結構核小體結構(Nucleosome) 第二節(jié)第二節(jié) DNA損傷類型、檢測手段和損傷類型、檢測手段和修復機制修復機制 間接作用：DNA周圍其他分子（主要是水分子）吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應活性的自由基，這些自由基可以擴散到足夠遠，到達并損傷DNA，引起DNA的結構功能破壞。直接作用：電離輻射的能量直接被射DNA吸收，靶原子本身的原子可以被電離或激發(fā)，從而啟動一系列的生物變化事件。電離輻射對電離輻射對DNA的直接作用和間接作用的直接作用和間接作用（一）堿基損傷（一）堿基損傷l 堿基的脫氨基作用堿基的脫氨基作用 l 脫嘌呤與脫嘧啶脫嘌呤與脫嘧啶l 堿基修飾堿基修飾

10、l 堿基修飾與鏈斷裂細胞呼吸的副產(chǎn)物或者射線的能量被堿基修飾與鏈斷裂細胞呼吸的副產(chǎn)物或者射線的能量被H2O吸收，將會造成吸收，將會造成DNA損傷，此外，體內(nèi)還可以發(fā)生損傷，此外，體內(nèi)還可以發(fā)生DNA的的甲基化，結構的其他變化等，這些損傷的積累可能導致老化；甲基化，結構的其他變化等，這些損傷的積累可能導致老化；這些損傷可引起這些損傷可引起DNA雙螺旋的局部結構改變，每個哺乳類細胞雙螺旋的局部結構改變，每個哺乳類細胞每天每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。萬次。l Dizdaroglu M等人的工作表明：羥自由基等人的工作表明：羥自由基“喜好喜好”攻擊嘧啶堿的攻擊嘧啶堿的

11、 5、6位，位，腺嘌呤的腺嘌呤的8位，位， 鳥嘌呤的鳥嘌呤的4、5、8位。鳥嘌呤位。鳥嘌呤C-8位易受到羥自由基及單線態(tài)位易受到羥自由基及單線態(tài)氧的攻擊而發(fā)生羥化，生成加合物氧的攻擊而發(fā)生羥化，生成加合物8-羥基脫氧鳥苷（羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）8-羥基脫氧鳥苷（羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）l 8-羥基脫氧鳥苷將會導致羥基脫氧鳥苷將會導致G 到到T 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換, 這種轉(zhuǎn)換是人類腫瘤細胞最為常見的這種轉(zhuǎn)換是人類腫瘤細胞最為常見的體細胞突變（體細胞突變（ somatic mutation）

12、8-羥基脫氧鳥苷檢測方法羥基脫氧鳥苷檢測方法l高效液相色譜電化學檢測器分析高效液相色譜電化學檢測器分析l酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法應用單克隆抗體的應用單克隆抗體的ELISA法具有很高的靈敏度和很好的重復性，往包被抗法具有很高的靈敏度和很好的重復性，往包被抗8-OHdG抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗8-OHdG抗體、抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。顯色。TMB在過氧化物酶的在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在

13、酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的中的8-OHdG.呈正相關。用酶標儀在呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（波長下測定吸光度（OD值）。值）。生物素生物素-親合素系統(tǒng)親合素系統(tǒng)親和素（親和素（avidin）亦稱抗生物素蛋白、卵白）亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同個相同亞基組成的堿性糖蛋白；耐熱并耐受多種蛋亞基組成的堿性糖蛋白；耐熱并耐受多種蛋白水解酶的作用尤其是與生物素結合后，白水解酶的作用尤其是與生物素結合后，穩(wěn)定性更好。生物素與親和素間的作用是穩(wěn)定性更好。生物素與親和素間的作用是目目前已知強度最高的非共價作

14、用前已知強度最高的非共價作用，親和常數(shù)，親和常數(shù)（K）為）為1015mol/L，比抗原與抗體間的親比抗原與抗體間的親和力（和力（K=10.511L/mol）至少高）至少高1萬倍萬倍。并且，二者的結合穩(wěn)定性好專一性強，不受并且，二者的結合穩(wěn)定性好專一性強，不受試劑濃度，試劑濃度，PH環(huán)境，抑或蛋白變性劑等有環(huán)境，抑或蛋白變性劑等有機溶劑影響。由于每個親和素能結合機溶劑影響。由于每個親和素能結合4個分個分子的生物素，這一特點可以用于構建一個多子的生物素，這一特點可以用于構建一個多層次信號放大系統(tǒng)。因此，層次信號放大系統(tǒng)。因此，BAS即可用于微即可用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定量抗原、

15、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各位觀察研究，亦可制成親和介質(zhì)用于上述各類反應體系中反應物的分離、純化。類反應體系中反應物的分離、純化。堿基切除修復堿基切除修復(BER) l BER用來清除并修復異常的、不該出現(xiàn)的堿基。這些非用來清除并修復異常的、不該出現(xiàn)的堿基。這些非A、T、G、C堿堿基的出現(xiàn)若無適時修復，則基的出現(xiàn)若無適時修復，則DNA聚合酶在復制的過程就很容易在碰到這些聚合酶在復制的過程就很容易在碰到這些堿基時置入錯誤的配對，即點突變發(fā)生；堿基時置入錯誤的配對，即點突變發(fā)生；。l BER優(yōu)先去除基因組上的一些小的、非螺旋扭曲的堿基損傷；優(yōu)先去除基因組上的

16、一些小的、非螺旋扭曲的堿基損傷；l 所有細胞中都帶有不同類型、能識別受損核酸位點的糖苷水解酶，它能所有細胞中都帶有不同類型、能識別受損核酸位點的糖苷水解酶，它能夠特異性切除受損核苷酸上的夠特異性切除受損核苷酸上的N-糖苷鍵，在糖苷鍵，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點，統(tǒng)稱為無嘌呤無嘧啶啶位點，統(tǒng)稱為無嘌呤無嘧啶(AP)位點；位點；。l DNA分子中一旦產(chǎn)生了分子中一旦產(chǎn)生了AP位點，位點，AP核酸內(nèi)切酶就會把受損核苷酸的糖核酸內(nèi)切酶就會把受損核苷酸的糖苷苷-磷酸鍵切開，并移去包括磷酸鍵切開，并移去包括AP位點核苷酸在內(nèi)的小片段位點核苷酸在內(nèi)的小片段DNA，由，由DNA聚聚

17、合酶合酶合成新的片斷，最終由合成新的片斷，最終由DNA連接酶把兩者連成新的被修復的連接酶把兩者連成新的被修復的DNA鏈，鏈，這一過程即為堿基切除修復這一過程即為堿基切除修復。糖苷水解酶切割N-beta-糖苷鍵形成無堿基位點（Abase sites）,糖苷水解酶具有特異性，一種酶對應一種損傷類型；AP核酸內(nèi)切酶切割，形成5 脫氧核糖磷酸，哺乳動物中最為主要的AP核酸內(nèi)切酶是APE1人類中5 脫氧核糖磷酸裂解酶主要為DNA polymerase (Pol)BERDNA損傷定量試劑盒損傷定量試劑盒-AP位點計數(shù)位點計數(shù)l 由于醛反應性探針（由于醛反應性探針（ARP；N-氨氧甲基羰肼基氨氧甲基羰肼基-

18、D-生物素）特異性地與生物素）特異性地與APS的的開環(huán)上的醛基反應，通過這個反應可以檢測到導致醛基形成的開環(huán)上的醛基反應，通過這個反應可以檢測到導致醛基形成的 DNA修飾修飾AP位點檢測位點檢測Ecl 顯色原理：顯色原理：可用作過氧化物酶的底物。在可用作過氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有底物中，含有H2O2和魯米諾，在和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來.（二）（二）DNA鏈斷裂鏈斷裂l 射線的直接和間接作用都可能使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開而射線的直接和間接作用都可能使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開而致致DNA鏈斷裂；鏈斷裂；l

19、脫氧核糖上的每個碳原子和羥基上的氫都能與脫氧核糖上的每個碳原子和羥基上的氫都能與OH反應，導致脫反應，導致脫氧核糖分解，最后會引起氧核糖分解，最后會引起DNA鏈斷裂；鏈斷裂；。l 糖基上糖基上C(1) ,C(2)和和C(4)在受到羥自由基攻擊后均可形成堿不穩(wěn)在受到羥自由基攻擊后均可形成堿不穩(wěn)定性位點定性位點(alkali labile sites, ALS)，這些位點在堿處理后都能導致，這些位點在堿處理后都能導致DNA鏈斷裂；鏈斷裂； l OH從脫氧核糖上抽氫主要作用于從脫氧核糖上抽氫主要作用于C(3，5 ) ， C(3) 上磷酸二酯上磷酸二酯鍵斷裂多于鍵斷裂多于C(5) ；l DNA雙鏈中一

20、條鏈斷裂稱單鏈斷裂雙鏈中一條鏈斷裂稱單鏈斷裂(single strand broken，SSB)，DNA雙鏈在同一處或相近處斷裂稱為雙鏈斷裂雙鏈在同一處或相近處斷裂稱為雙鏈斷裂(double strand broken，DSB)。1. DNA單鏈斷裂損傷單鏈斷裂損傷 （DNA single strand breaks SSBs）l SSBs是細胞是細胞DNA損傷的主要類型之一，是損傷的主要類型之一，是DNA經(jīng)氧化應激或者堿經(jīng)氧化應激或者堿基切除修復機制產(chǎn)生的一種常見基切除修復機制產(chǎn)生的一種常見DNA損傷；損傷；DNA單鏈斷裂修復（與堿基切除修復共用一套系統(tǒng)）單鏈斷裂修復（與堿基切除修復共用一套

21、系統(tǒng)）2. DNA雙鏈斷裂損傷雙鏈斷裂損傷 （DNA double strand breaks DSBs）l DNA雙鏈斷裂對細胞來說是雙鏈斷裂對細胞來說是最嚴重也是最致命最嚴重也是最致命的的DNA損害類型。損害類型。DNA雙鏈雙鏈斷裂的結果使得斷裂的結果使得DNA的末端直接裸露，在這種情況的發(fā)生若沒有及時的處理，的末端直接裸露，在這種情況的發(fā)生若沒有及時的處理，細胞內(nèi)細胞內(nèi)DNA損害反應（損害反應（DNA damage response）機制就會活化，其后果之一）機制就會活化，其后果之一是停止細胞的生長與分裂，或者是啟動細胞凋亡；是停止細胞的生長與分裂，或者是啟動細胞凋亡；細胞內(nèi)單一的細胞內(nèi)

22、單一的DNA DSBs即即足以誘發(fā)細胞死亡足以誘發(fā)細胞死亡。非同源末端連接非同源末端連接 (NHEJ) 是否有同源序列是否有同源序列同源重組同源重組 (HR)xx 無錯無錯vs 有錯有錯Ku70/80DNA-PKcsG1SG2MSG2DNA雙鏈斷裂損傷的兩條修復途徑雙鏈斷裂損傷的兩條修復途徑Ku70/80DNA-PKcsDNA-PKcs磷酸化磷酸化末端修飾酶復合物末端修飾酶復合物Lig4/XRCC4/XLF DNA 末端連接末端連接,復合物解離復合物解離非同源末端連接非同源末端連接 (NHEJ)pT2609pT2647pS2056ATMDNA-PKcs(10 Gy) - IR - IRshGF

23、P shATMS2612S2624T2638T2647T2620Caspase 3 cleavagePI3KFATLZS2056T2609Chen et al. 2007. J. Biol. Chem. 282: 6582-7.ATM/ATR 介導介導DNA-PKcs 自磷酸化自磷酸化DNA-PKcs磷酸化調(diào)控磷酸化調(diào)控Chk2Chk2 pT68ActinpS2056DNA-PKcs -Ku N/KIR-NuShang et al. 2014. Oncogenesis同源重組修復同源重組修復(HR)l 同源重組修復是利用細胞內(nèi)已復同源重組修復是利用細胞內(nèi)已復制的制的DNA作為模板，若其中一條作

24、為模板，若其中一條DNA發(fā)生雙鏈斷裂，則另一條對應發(fā)生雙鏈斷裂，則另一條對應的的DNA序列即可當修復的模板來回序列即可當修復的模板來回復斷裂前的序列，因此某些條件下復斷裂前的序列，因此某些條件下被稱為基因轉(zhuǎn)換。被稱為基因轉(zhuǎn)換。DNA雙鏈斷裂損兩條修復途徑相互競爭雙鏈斷裂損兩條修復途徑相互競爭Angelina JolieBRCA1 (breast cancer 1)Women with an abnormal BRCA1 or BRCA2 gene have up to an 80% risk of developing breast cancer by age 90; increased ri

25、sk of developing ovarian cancer is about 55% for women with BRCA1 mutations and about 25% for women with BRCA2 mutationsDNA斷裂的檢測方法：斷裂的檢測方法：l 免疫熒光檢測免疫熒光檢測H2AX聚焦點聚焦點 (foci)l單細胞凝膠電泳單細胞凝膠電泳l脈沖凝膠電泳脈沖凝膠電泳組蛋白組蛋白變體變體 (Histone Variant)l 組蛋白變體與常規(guī)組蛋白變體與常規(guī)組蛋白具有高度序列組蛋白具有高度序列同源性，核心結構相同源性，核心結構相似性。似性。H2AX聚焦點聚焦點 (fo

26、ci)l 當外源性因素（電離輻射、類輻射藥物）和內(nèi)源性因素（如復制叉應激）造當外源性因素（電離輻射、類輻射藥物）和內(nèi)源性因素（如復制叉應激）造成細胞內(nèi)染色質(zhì)成細胞內(nèi)染色質(zhì)DNA發(fā)生斷裂時，損傷應答因子發(fā)生斷裂時，損傷應答因子ATM、ATR和和DNA-PKcs快速快速磷酸化磷酸化H2AX的第的第139位點，形成位點，形成H2AX；l 磷酸化的磷酸化的H2AX(H2AX)通過介導蛋白蛋白之間相互作用，轉(zhuǎn)導通過介導蛋白蛋白之間相互作用，轉(zhuǎn)導DNA損傷損傷信號到下游分子，引發(fā)一系列的生物級聯(lián)反應和細胞學反應，在信號到下游分子，引發(fā)一系列的生物級聯(lián)反應和細胞學反應，在DNA損傷信號損傷信號轉(zhuǎn)導過程中，起

27、它的蛋白后修飾同樣發(fā)揮重要作用，如泛素化、乙酰化和轉(zhuǎn)導過程中，起它的蛋白后修飾同樣發(fā)揮重要作用，如泛素化、乙酰化和SUMO化等；化等；l H2AX是迄今為止所研究的最重要的是迄今為止所研究的最重要的DNA損傷標志分子之一，在一定時間損傷標志分子之一，在一定時間內(nèi)，內(nèi)， H2AX水平與水平與DNA損傷水平呈現(xiàn)一定相關性。損傷水平呈現(xiàn)一定相關性。Nat Rev Mol Cell Biol. 2013H2AX磷酸化磷酸化MRN-ATM-H2AX-MDC1反饋環(huán)路放大反饋環(huán)路放大DNA損傷信號損傷信號H2AX可作為生物劑量計可作為生物劑量計單細胞凝膠電泳分析單細胞凝膠電泳分析l 如果細胞未受損傷，電泳

28、時，核如果細胞未受損傷，電泳時，核DNA因其分子量大停留在核基質(zhì)中，熒因其分子量大停留在核基質(zhì)中，熒光染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團，無脫尾現(xiàn)象；光染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團，無脫尾現(xiàn)象；l 若細胞受損，在中性電泳液（若細胞受損，在中性電泳液（pH=8）中，核）中，核DNA 仍保持雙螺旋結構，仍保持雙螺旋結構，雖偶有單鏈斷裂，但并不影響雖偶有單鏈斷裂，但并不影響DNA雙螺旋大分子的連續(xù)性。只有當雙螺旋大分子的連續(xù)性。只有當DNA雙雙鏈斷裂時，其斷片進入凝膠中，電泳時斷片向陽極遷移，形成熒光拖尾現(xiàn)象，鏈斷裂時，其斷片進入凝膠中，電泳時斷片向陽極遷移，形成熒光拖尾現(xiàn)象，形似彗星；（中性電泳）形似彗星；（中性電

29、泳）l 如果在堿性電泳液（如果在堿性電泳液（pH13）中，先是）中，先是DNA雙鏈解螺旋且堿變性為單鏈，雙鏈解螺旋且堿變性為單鏈，單鏈斷裂的碎片分子量小可進入凝膠中，電泳時斷鏈或碎片離開核單鏈斷裂的碎片分子量小可進入凝膠中，電泳時斷鏈或碎片離開核DNA向向陽性遷移，形成拖尾；（堿性電泳）陽性遷移，形成拖尾；（堿性電泳）l 細胞細胞DNA受損愈重，在電場作用下遷移的受損愈重，在電場作用下遷移的DNA量多，遷移的距離長，表量多，遷移的距離長，表現(xiàn)為尾長增加和尾部熒光強度增強，因此，通過測定現(xiàn)為尾長增加和尾部熒光強度增強，因此，通過測定DNA遷移部分的光密遷移部分的光密度或遷移長度可定量地測定單個細

30、胞度或遷移長度可定量地測定單個細胞DNA損傷的程度；因其細胞電泳形態(tài)損傷的程度；因其細胞電泳形態(tài)頗似彗星，又稱彗星實驗。頗似彗星，又稱彗星實驗。單細胞凝膠電泳分析應用單細胞凝膠電泳分析應用原理 脈沖場凝膠電泳(PFGE)是一種分離大分子 DNA 的方法。PFGE是采用兩個交變電場，即兩個電場交替地開啟和關閉，使DNA分子的電泳方向隨著電場的變化而改變。相對較小的分子在電場轉(zhuǎn)換后可以較快轉(zhuǎn)變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較為困難。因此小分子向前移動的速度比大分子快。正是因為電場方向的交替改變，才使大分子DNA得以分離。 脈沖凝膠電泳實驗脈沖凝膠電泳實驗示意圖示意圖 當當A電場開啟時，電場開啟

31、時，B電場關電場關閉，閉，DNA分子從分子從A電場的電場的負極負極(A-)向正極向正極(A+ )移動；移動；當當B電場開啟時，電場開啟時，DNA分分子改變原來的運行方向，子改變原來的運行方向，隨隨B電場由負極向正極移電場由負極向正極移動。這樣，隨著電場方向動。這樣，隨著電場方向的交替變化的交替變化DNA分子即呈分子即呈“Z” 字形向前移動。字形向前移動。方框代表瓊脂糖凝膠；方框代表瓊脂糖凝膠；一排小方框代表一排小方框代表DNADNA加樣孔；加樣孔；A A、B B代表兩個交替開啟和關閉代表兩個交替開啟和關閉的電場。的電場。 具體步驟：具體步驟：1、傳代細胞于35 mm培養(yǎng)皿中，至第二天約80%

32、匯合，細胞數(shù)約5 105個；2、20 Gy照射細胞，0 h點細胞需在照射后立即放置冰上，其余細胞繼續(xù)培養(yǎng)；3、加入等量的50的2%低熔點瓊脂糖凝膠，混勻后加于以膠布臨時封閉一端的制膠孔中，避免產(chǎn)生氣泡，凝膠略高于制膠孔；4、加入等量的50的2%低熔點瓊脂糖凝膠，混勻后加于以膠布臨時封閉一端的制膠孔中，避免產(chǎn)生氣泡，凝膠略高于制膠孔； 具體步驟：具體步驟：5、以刀片削去突出的凝膠，揭下膠布，將膠條推出于蛋白酶K反應液中，暫存于4；6、制好的膠塊50水浴消化24 h，避免攪動；7、裝配好制膠板。熔化配制好的凝膠，冷卻至55-60（不涼也不燙手），小心倒膠于制膠板上約110 ml，凝膠將沒過膠塊；8

33、、等待凝膠凝固，小心拔除梳子，樣品膠塊將留在凝膠中；9、設定電泳條件：初始、終止脈沖時間皆為420 s，電泳時間72 h，角度120，場強1.5 V/cm；10、電泳完成后于凝膠成像儀上觀察并拍照，注意防止過度曝光；使用Quantity One軟件分析膠孔中及電泳入凝膠的DNA含量，DNA斷裂比率計算公式為：凝膠中DNA含量/(凝膠中DNA含量+膠孔中DNA含量) X 100%。（三）（三）DNA交聯(lián)交聯(lián)包括包括DNA鏈交聯(lián)和鏈交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)蛋白質(zhì)交聯(lián)1. DNA-DNA鏈交聯(lián)鏈交聯(lián)（1）鏈內(nèi)交聯(lián)：）鏈內(nèi)交聯(lián)：DNA分子同一條鏈上的兩個堿基相互以共價分子同一條鏈上的兩個堿基相互以共價

34、鍵結合；紫外線照射能引起較多的鍵結合；紫外線照射能引起較多的DNA鏈內(nèi)交聯(lián)，而電離輻射鏈內(nèi)交聯(lián)，而電離輻射的效應較?。坏男^?。唬?）鏈間交聯(lián)：）鏈間交聯(lián)：DNA雙螺旋結構中，一條鏈上的堿基與其互雙螺旋結構中，一條鏈上的堿基與其互補鏈上的堿基以共價鍵結合；補鏈上的堿基以共價鍵結合；DNA 鏈間交聯(lián)多見于化學損傷，鏈間交聯(lián)多見于化學損傷，如氮芥、硫芥等；放射損傷時較少見到。如氮芥、硫芥等；放射損傷時較少見到。（1）鏈內(nèi)交聯(lián)）鏈內(nèi)交聯(lián)環(huán)丁烷嘧啶二聚體環(huán)丁烷嘧啶二聚體64嘧啶嘧啶嘧啶酮光化產(chǎn)物嘧啶酮光化產(chǎn)物l NER主要修復那些影響染色質(zhì)結構的主要修復那些影響染色質(zhì)結構的DNA損傷，包括由紫外線所

35、導致的損傷，包括由紫外線所導致的雙嘧啶鍵結（雙嘧啶鍵結（purimidine dimer），化學分子如），化學分子如cisplatin導致的導致的DNA-DNA鏈間交聯(lián)等；鏈間交聯(lián)等；核苷酸切除修復核苷酸切除修復(Nucleotide excision repair, NER)l 這些損害的形式若沒有適時的排除，這些損害的形式若沒有適時的排除，DNA聚合酶將無法辨識而滯留在損聚合酶將無法辨識而滯留在損害的位置，這時細胞就會活化細胞周期檢查點（害的位置，這時細胞就會活化細胞周期檢查點（cell cycle checkpoint）以全面停止細胞周期的進行；以全面停止細胞周期的進行；l NER分為兩

36、種途徑：全基因組修復（分為兩種途徑：全基因組修復（GCR），能將損傷從整個基因組），能將損傷從整個基因組除去；轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復（除去；轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復（TCR），能優(yōu)先從表達基因的轉(zhuǎn)錄鏈將損傷除去。），能優(yōu)先從表達基因的轉(zhuǎn)錄鏈將損傷除去。l DNA損傷的感應器為損傷的感應器為XPC蛋白，蛋白，XPC蛋蛋白可以結合到白可以結合到DNA雙螺旋不穩(wěn)定區(qū)域（無雙螺旋不穩(wěn)定區(qū)域（無法形成雙鏈），但不與錯配堿基結合；法形成雙鏈），但不與錯配堿基結合；全基因組修復（全基因組修復（GCR）l XPC與與 RAD23B和和centrin 2 (CETN2)形形成復合物；成復合物；l XP基因缺陷導致著色性干皮病基因缺陷

37、導致著色性干皮病( xroderma pigmentosa XP)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復（轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復（TCR）l TC-NER是由是由RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄過程遇到核苷酸損害無法辨識而停滯時聚合酶在轉(zhuǎn)錄過程遇到核苷酸損害無法辨識而停滯時所活化的修復機制，借由所活化的修復機制，借由RNA聚合酶停滯的動作可以立即招來聚合酶停滯的動作可以立即招來NER相關的相關的修復蛋白前來，這樣就能加速修復蛋白前來，這樣就能加速DNA損害的復原，而無須漫長地等待損害的復原，而無須漫長地等待GG-NER的反應；的反應；l TC-NER只能修復轉(zhuǎn)錄只能修復轉(zhuǎn)錄RNA的的DNA鏈；鏈；lTC-NER 中起核心作用的是中起核心作用的

38、是Cockayne 綜合征蛋白，綜合征蛋白， CSB松散的與松散的與RNA Pol II 結合，當結合，當RNA Pol II 停留在在損傷位點時，停留在在損傷位點時， CSB與與RNA Pol II結合能結合能力增強力增強 ，并且，并且Cockayne 綜合征蛋白通過綜合征蛋白通過WD 重復區(qū)段介導重復區(qū)段介導CSACSB復復合物形成。合物形成。色性干皮病色性干皮病( xroderma pigmentosa XP)患者患者Cockayne 綜合征患者綜合征患者lDNA交聯(lián)損傷的檢測和修復主要由一組交聯(lián)損傷的檢測和修復主要由一組FA (Fanconi anemia)蛋白來完成。蛋白來完成。FA

39、蛋白得名于一種罕有的常染色體遺傳??；蛋白得名于一種罕有的常染色體遺傳?。籰范可尼貧血癥，在范可尼貧血癥的病人中范可尼貧血癥，在范可尼貧血癥的病人中FA蛋白以各種突變體形式存在，蛋白以各種突變體形式存在，因而導致因而導致DNA交聯(lián)損傷無法得到修復；交聯(lián)損傷無法得到修復；l患有范可尼貧血癥的病人會在年幼時發(fā)病，出現(xiàn)嚴重的再生障礙性貧血患有范可尼貧血癥的病人會在年幼時發(fā)病，出現(xiàn)嚴重的再生障礙性貧血癥狀，癌癥，以及多發(fā)性先天畸形；癥狀，癌癥，以及多發(fā)性先天畸形；lFA蛋白包括分別由蛋白包括分別由FANC-A，B，C，E，F(xiàn)，G，L和和M組成的組成的FA核心復核心復合體以及合體以及FANCI和和FANC

40、D2組成的組成的ID復合體。在復合體。在DNA交聯(lián)損傷產(chǎn)生后，交聯(lián)損傷產(chǎn)生后，F(xiàn)A核核心復合體被上游的蛋白激酶心復合體被上游的蛋白激酶ATR所激活，從而單泛素化底物所激活，從而單泛素化底物FANCI和和FANCD2。（2）鏈間交聯(lián)）鏈間交聯(lián)l范可尼貧血癥范可尼貧血癥(Fanconi anemia）是一種罕見的常染色體隱性遺傳性是一種罕見的常染色體隱性遺傳性血液系統(tǒng)疾病，貧血的一般表現(xiàn)，出血傾向及易感染。多見皮膚性著色，血液系統(tǒng)疾病，貧血的一般表現(xiàn)，出血傾向及易感染。多見皮膚性著色，或片狀棕色斑，體格、智力可發(fā)育落后?；蚱瑺钭厣?，體格、智力可發(fā)育落后。范可尼貧血癥范可尼貧血癥(Fanconi

41、anemia）FA信號通路修復鏈間交聯(lián)的模型信號通路修復鏈間交聯(lián)的模型范可尼貧血癥范可尼貧血癥(Fanconi anemia）病人造血干細胞池病人造血干細胞池（hematopoietic stem cellpool，HSCpool ）缺陷）缺陷DNA-PKcs調(diào)控調(diào)控FANC信號通路信號通路. DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)蛋白質(zhì)交聯(lián)l DNA與蛋白質(zhì)之間也會以共價與蛋白質(zhì)之間也會以共價鍵相連，組蛋白、染色質(zhì)中的非鍵相連，組蛋白、染色質(zhì)中的非組蛋白、調(diào)控蛋白、與復制和轉(zhuǎn)組蛋白、調(diào)控蛋白、與復制和轉(zhuǎn)錄有關的酶都會與錄有關的酶都會與DNA共價鍵連共價鍵連接。接。l 染色質(zhì)免疫沉淀法（染色質(zhì)免疫沉淀法（Chro

42、matin immunoprecitation，ChIP）是研究體內(nèi)）是研究體內(nèi)DNA與與蛋白質(zhì)相互作用的重要工具，它可以靈敏地檢測目標蛋白與特異蛋白質(zhì)相互作用的重要工具，它可以靈敏地檢測目標蛋白與特異DNA片段的結合情片段的結合情況，還可以用來研究組蛋白與基因表達的關系。況，還可以用來研究組蛋白與基因表達的關系。染色質(zhì)免疫沉淀法（染色質(zhì)免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation，ChIP）（四）錯誤配對修復（四）錯誤配對修復(Mismatch matchrepair, MMR)l 堿基的異構互變堿基的異構互變DNA中的中的4種堿基各自的異構體間都可以種堿基各自的異構體

43、間都可以自發(fā)地相互變化自發(fā)地相互變化(例如烯醇式與酮式堿基間的互變例如烯醇式與酮式堿基間的互變l Dam甲基化酶，能使位于甲基化酶，能使位于5GATC3序列中腺苷酸的序列中腺苷酸的N6位甲基化，一旦復位甲基化，一旦復制叉通過復制起始位點，母鏈就會在開始制叉通過復制起始位點，母鏈就會在開始DNA合成前的幾妙之幾分鐘內(nèi)被甲合成前的幾妙之幾分鐘內(nèi)被甲基化；基化；l 此后，只要兩條鏈此后，只要兩條鏈DNA鏈上堿基配對出現(xiàn)錯誤，錯配修復系統(tǒng)就會根據(jù)鏈上堿基配對出現(xiàn)錯誤，錯配修復系統(tǒng)就會根據(jù)“保存母鏈，修正子鏈保存母鏈，修正子鏈”的原則，找出錯誤堿基所在的的原則，找出錯誤堿基所在的DNA鏈，并在對應于鏈，

44、并在對應于母鏈甲基化腺苷酸上游鳥苷酸的母鏈甲基化腺苷酸上游鳥苷酸的5位置切開子鏈，然后重新合成新的子鏈。位置切開子鏈，然后重新合成新的子鏈。l核心問題：如何區(qū)分哪條鏈為正確，那條鏈為錯誤！核心問題：如何區(qū)分哪條鏈為正確，那條鏈為錯誤！Dam甲基化酶與甲基化酶與DNA錯配修復錯配修復1、直接修復直接修復/回復修復回復修復：a、甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（、甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）具有甲基）具有甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，因此可以直接將轉(zhuǎn)移酶的活性，因此可以直接將6-烷基鳥嘌呤烷基鳥嘌呤6號位置的甲基直接移除；號位置的甲基直接移除；b、細菌中有一種光分解酶，修復、細菌中有一種光分解酶，修復UV造成的雙嘧啶二聚體；造成的雙嘧啶二聚體；2、堿基切除修復堿基切除修復BER：針對氧化還原（：針對氧化還原（8羥基脫氧鳥苷）或烷基化引起羥基脫氧鳥苷）或烷基化引起的堿基損傷，優(yōu)先去除基因組上的一些小的、非螺旋扭曲的堿基損傷；的堿基損傷，優(yōu)先去除基因組上的一些小的、非螺旋扭曲的堿基損傷；3、核苷酸切除修復核苷酸切除修復NER：修復紫外線、化學物質(zhì)引起的：修復紫外線、化學物質(zhì)引起的DNA-DNA交聯(lián)交聯(lián)和和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，主要修復那些影響染色質(zhì)結構的蛋白質(zhì)交聯(lián)，主要修復那些影響染色質(zhì)結構的DNA損傷；分為全損傷；分為全基因組核苷酸切除修復和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)切除修復；基因組核苷酸切除修復和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)切除修復；