DNA重組的操作

1、第六章第六章 DNA重組的操作重組的操作生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院外源外源DNA載體載體DNA重組分子重組分子擴(kuò)增或表達(dá)擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)表達(dá)連接連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射電穿孔或顯微注射原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞受體細(xì)胞受體細(xì)胞？1.基因文庫基因文庫2.PCR3.基因差異表達(dá)基因差異表達(dá)1.克隆載體克隆載體2.表達(dá)載體表達(dá)載體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組限制酶限制酶分子剪刀分子剪刀限制酶限制酶分子剪刀分子剪刀連接酶連接酶分子膠水分子膠水重組重組DNADNA分子分子粘性末端連接粘性末端連接效率最高！效率最高！生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 1 1、粘

2、性末端的連接、粘性末端的連接 第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接 什么情況下可以產(chǎn)生粘性末端？什么情況下可以產(chǎn)生粘性末端？同種酶同種酶同尾酶同尾酶生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組（1）兩端具有相同粘末端的）兩端具有相同粘末端的DNA分子之間的連接分子之間的連接 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組堿性磷酸酶堿性磷酸酶：去：去掉其掉其

3、5末端的磷酸末端的磷酸基，以防質(zhì)?；?，以防質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化的自身環(huán)化 。注意：注意：目的基因正反向插目的基因正反向插入；入；載體與多個目的基載體與多個目的基因片段重組。因片段重組。1 12 23 31 12 23 34 44 43 34 4生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組（2）兩端具有不同粘性末端的）兩端具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接分子之間的連接兩種不同的限制性內(nèi)切酶兩種不同的限制性內(nèi)切酶 兩端會產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端兩端會產(chǎn)生非互補(bǔ)的突出端 定向重組體定向重組體生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組HindIIIEcoRIH

4、indIIIEcoRI對載體對載體酶切酶切HindIIIEcoRI對基因酶切對基因酶切質(zhì)粒載體的定向重組質(zhì)粒載體的定向重組堿性磷酸酶？堿性磷酸酶？避免了目的基因正反向插入避免了目的基因正反向插入生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組2. 平頭末端連接平頭末端連接（1） 直接連接直接連接 T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的粘性末端的1%。 5端與端與3端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。5 5 5 5 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5

5、 3 -OH-PP-HO-5 3 3 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組（2） 人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” a）同聚加尾）同聚加尾 法法 DNA末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶 DNA末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給能在沒有模板的情況下給DNA的的3-OH端加上脫氧核苷酸端加上脫氧核苷酸, 利用利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶分別給末端轉(zhuǎn)移酶分別給載體載體和和插入片斷插入片斷加上互補(bǔ)加上互補(bǔ)的核苷酸。的核苷酸。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組非酶切位點(diǎn)非酶切位點(diǎn) a a）同聚加尾法）同聚加尾法 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：不能把插入片段再切下

6、來。不能把插入片段再切下來。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院還有哪些方法能夠創(chuàng)造粘性末端？還有哪些方法能夠創(chuàng)造粘性末端？生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組b）銜接物）銜接物(linker)連接連接Linker:用化學(xué)合成法合成的一段用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制的特定限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列的平端雙鏈平端雙鏈。G GGAATTCGAATTCC C C CCTTAAGCTTAAGG GEcoRIEcoRI linker linker：生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) D

7、NA的體外重組的體外重組銜接物銜接物(linker)(linker)連連接接生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組銜接物銜接物(linker)連接連接優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1 1）可以用內(nèi)切酶把）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。插入片段切下來。 2 2）能給載體連接上）能給載體連接上PolylinkerPolylinker 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：如果插入片段內(nèi)部如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入能切下完整的插入片段片段生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組c) DNA接頭接頭 (adapter)連接法連接法 adapter:一頭平末端

8、、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。序列）。 adapter的作用的作用:用用T4DNA連接酶連到連接酶連到DNA分子的兩端，分子的兩端，直接成為人工粘性末端。直接成為人工粘性末端。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：接頭與接頭會彼接頭與接頭會彼此以粘性末端接在一起，此以粘性末端接在一起，影響與影響與DNA片段的連接。片段的連接。防止自我連接：防止自我連接：先用先用堿性磷酸酶堿性磷酸酶（CIP）處理接頭處理接頭以后再用以后再用T4多核苷酸激

9、多核苷酸激酶酶加上磷酸。加上磷酸。DNADNA接頭接頭 (adapter)(adapter)連接法連接法生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院平頭末端連接平頭末端連接（1） 直接連接直接連接（2） 人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” a)同聚加尾法同聚加尾法 b)銜接物連接銜接物連接 c) DNA接頭連接法接頭連接法小結(jié)PCR?生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié) 重組DNA分子的構(gòu)建3.PCR產(chǎn)物的連接產(chǎn)物的連接（1）在引物的）在引物的5端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)GCAGAATTC 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列3端端1520bp與模板互補(bǔ)；與模板互補(bǔ)； 5端端610bp是某個內(nèi)切酶的識別序列是某個內(nèi)切酶的識別

10、序列（5端多余的端多余的35bp屬屬保護(hù)堿基保護(hù)堿基）引物引物生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組引物引物1GCAGAATTC 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列模板模板EcoRI位點(diǎn)位點(diǎn)5-3 GCAGAATTC 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列5-3 3 模板模板GCAGAATTC 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列 PCR產(chǎn)物產(chǎn)物5-3 3 復(fù)性復(fù)性延伸延伸模板模板模板模板3 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組GCTAGCCGG 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列模板模板BamH I 位點(diǎn)位點(diǎn)-5 3- 復(fù)性復(fù)性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GCTAGCCGG 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列3-模板模板GCTA

11、GCCGG PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列引物引物23 3 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組BamH IEcoRIBamH IEcoRI對載體對載體酶切酶切BamH IEcoRI質(zhì)粒載體的定向重組質(zhì)粒載體的定向重組PCR生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組（2）與與T載體直接連接載體直接連接 Taq DNA聚合酶聚合酶的特性：在的特性：在DNA雙鏈的雙鏈的3端再加上端再加上一個多余的核苷酸（優(yōu)先加一個多余的核苷酸（優(yōu)先加A）,因此因此PCR產(chǎn)物兩個產(chǎn)物兩個3端端一般都有一個一般都有一個AT載體的兩個載體的兩個3端人為地各加一個端人為

12、地各加一個T：利用：利用Taq DNA聚合酶，當(dāng)原料中只有聚合酶，當(dāng)原料中只有dTTP時(shí)，被迫在時(shí)，被迫在平端載體上添平端載體上添加加T！Taq DNA聚合酶聚合酶生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組T載體圖載體圖生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶載體載體PCR產(chǎn)物產(chǎn)物T AT A3. PCR產(chǎn)物的連接產(chǎn)物的連接（2）與與T載體直接連接載體直接連接生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接（1）兩端具有相同粘末端的）兩端具

13、有相同粘末端的DNA分子之間的連接分子之間的連接（2）兩端具有不同粘性末端的）兩端具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接分子之間的連接2. 平頭末端連接平頭末端連接（1）直接連接）直接連接（2）人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” a)同聚加尾法同聚加尾法 b)銜接物連接銜接物連接 c) DNA接頭連接法接頭連接法3. PCR產(chǎn)物的連接產(chǎn)物的連接（1）在引物的）在引物的5端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)（2）與）與T載體直接連接載體直接連接第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院思考：思考： DNA體外連接應(yīng)注意哪些事項(xiàng)呢？體外連接應(yīng)注意哪些事項(xiàng)呢？生命科學(xué)學(xué)院生

14、命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組二、二、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)1.插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。盡量避免平端連接。BamHIBamHISau3AI（2）用同尾酶切）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都都產(chǎn)生產(chǎn)生GATC4個堿基的粘性末端。個堿基的粘性末端。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組2. 插入基因的開放閱讀框（插入基因的開放閱讀框（ORF）正確）正確 （1）DNA定向插入定向插入由

15、于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。雙酶切雙酶切EcoRIEcoRIBamHIBamHIEcoRIEcoRIBamHIBamHIEcoRIEcoRIBamHIBamHI生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)第一節(jié) DNA的體外重組的體外重組（2）起始密碼）起始密碼尤其當(dāng)尤其當(dāng)載體上有載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATG G ATG G AA TTCAA TTC載體載體ATG CGG ATG CGG AAT TCAAT TCT T插入片斷插入片斷EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIATG G ATG G AAT TCAAT TCT T重組重組但移碼突變！但移碼突變！生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院3. 防止載體自身環(huán)化連接防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的載體切口的5磷酸被除去，不能自我連接。磷酸被除去，不能自我連接。生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院三、載體和外源三、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果插入片段的連接結(jié)果2. 載體自身環(huán)化連接（能