常見色譜柱問題解析

1、1、網(wǎng)上對柱子是否可以反沖一直有爭論，那什么樣的柱子可以反沖，什么不可以。反沖后是正者用，還是反著用。具體到各型號柱子不僅是OD舟，其他如正向柱、氨基柱、離子交換柱等最好都有解釋。答:一般的正相反相柱應該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對稱的柱子不能反沖，不過目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好，以免柱子的兩頭都被污染。我們一直提倡的是：正向使用，反向沖洗。2、色譜柱的技術都有哪些？比如封尾等，這些技術在應用時都體現(xiàn)在哪里？答：色譜柱技術包括填料技術和裝柱技術，填料技術自不待言，填料的好壞對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術也沒有想象中的這

2、么簡單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，更多是一門藝術，需要經(jīng)驗積累。國內(nèi)和國外想比，我認為色譜柱的差距在于：國內(nèi)公司以前都不會自己開發(fā)填料，一般買國外現(xiàn)成填料裝柱，買到的填料質量控制權不在自己手里。另外因為裝柱歷史短，經(jīng)驗積累少，裝柱工藝也沒有完全達到國外水平o另外，對色譜柱性能很關鍵的基礎材料一裸硅膠，國產(chǎn)的還不過關，在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國外產(chǎn)品相比，差距很大。3、柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢？原來也討論過這個問題，我也拆下來清洗過，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的篩板安裝上去。問題解

3、決了，但使用壽命會不會減少呢？答：柱頭污染了，就取出污染的，再裝一些填料。因為加入你刮了些填料，那么微觀的塔板數(shù)就少了。假入你刮得不多，僅表面，可能就是一些臟物，所以，問題解決。但是今后還會有同樣問題，再掛，那么不小心刮，影響柱效。建議還是裝一個預柱4、色譜柱的填裝一般有3種情況：1.國外生產(chǎn)填料并填裝完成成品賣到國內(nèi)；2.國外生產(chǎn)填料，國內(nèi)填裝銷售；3.國內(nèi)生產(chǎn)填料，國內(nèi)填裝銷售。5、預柱或保護柱用還是不用的問題！我就想問：安裝保護柱后會影響樣品分析嗎？我們做的大多是頭抱類的抗生素。答：應該這樣說，加上保護柱，肯定有利于保護色譜柱不受一些顆粒物質的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因為保護柱中間

4、有著死體積的存在但是如果保護柱接得好，并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應該影響并不大。頭抱類的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍，有些原料藥，可以根據(jù)色譜柱的損耗選擇添加預柱（中間是個篩板），制劑的話，如果有輔料嚴重干擾或者流動相鹽分比較大，那還是最好配個保護柱。6、用的是四元梯度泵A50%P醇和B50%C,經(jīng)常出現(xiàn)?；蜻M氣泡這是什么原因？答：水/甲醇比例在55:45時，黏度和柱壓有個極大值。50:50接近了這個極值，柱壓是比較高的，但影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑，你這個實例中不知用的什么規(guī)格的色譜柱？系統(tǒng)壓力高，可能會因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導致氣泡進入系統(tǒng)，

5、停機也應該是因為氣泡進入壓力下降的原因，可考慮更換液體通量更大的過濾頭。7、填料方法的前三種都是濕法嗎，能不能對四種填充方法做一個簡短的說明？資料顯示：在正常條件下，填料粒度20出丸干法填充制備柱較為合適；顆粒20小時，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；徑向加壓法，Waters專利；軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；干法。柱填充的技術性很強，大多數(shù)實驗室使用已填充好的商品柱。8、在做多肽藥物時遇到下列問題：基線不穩(wěn)定波動大，流動相A:1%TFA水溶液，B:1%TFA乙月青溶液，流動相中不加TFA見不到主峰，基線良好。TFA有什么作用？藥典上介紹測

6、定分子量大于2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為30nm30nm與10nm對結果有什么區(qū)別？答：流動相加入TFA,應該是起“離子對”的作用吧，在反相色譜分離多肽和蛋白質的實驗中，使用三氟乙酸（TFA）作為離子對試劑是常見的手段，流動相中的三氟乙酸通過與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，來改善峰形、克服峰展寬和拖尾問題。三氟乙酸優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā)，可以方便地從制備樣品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm，對多肽在低波長處的檢測干擾很小。做多肽樣品的時候，300A孔徑的填料相對100A孔徑肯定要選擇性好點，也就是分離度相對比較好點。9、反相離子對色

7、譜法中，離子對是如何起作用的？答：首先離子對試劑的解離端和目標離子形成離子締合物，降低其極性，這樣就能較好的在柱子上保留。再者，根據(jù)疏水效應理論，離子對試劑的疏水端是很容易和C18鏈相互作用的，這樣更容易在柱子上保留，所以我認為離子對試劑作用是混合保留機制，即純粹的反相保留和離子對保留機制共同作用。10、苯基柱，氟基柱該什么時候考慮用？答：苯基柱用于含苯環(huán)的芳香族化合物的測定時，具有較高的選擇性。CN柱可作為一個保留能力最弱的反相柱使用，也可作為一個活性降低的正相柱使用（保留時間比硅膠柱和氨基柱低很多）。11、還有所謂的死體積怎么測定呢？答：所謂死體積就是完全不保留的物質出峰時從進樣到流過色譜

8、柱的總體積，一般用極性非常強的尿喀噬的出峰來測定。死體積包括柱體積（色譜柱內(nèi)溶劑能占據(jù)的空腔體積）和柱外體積兩部分。12、四烷基季錢鹽(如四丁基硫酸氫錢、四丁基澳化錢、四丁基氫氧化錢等)在水中電離后，也形成了類似N+H(CH2CH3)3的結構N+(CH2CH2CH2CH3)鉆種結構也能有效的與Si展產(chǎn)生較強的靜電作用，此類離子對用的比較少，但它的作用僅是掩藏Si量嗎，它對物質的保留性能有何影響，實驗中發(fā)現(xiàn)檢測胺化物時，流動相中加入磷酸緩沖鹽有增加物質保留的趨勢，而加入三乙胺則會降低物質的保留能力？答：前面提到的四丁基氫氧化錢等離子對試劑確實不如辛磺酸鈉等極性基是陰離子的離子對試劑用得普遍，原因

9、是酸類極性物質很容易通過降低pH值的方法提高在反相色譜中的保留能力，降低pH可抑制酸的電離，使酸處于中性狀態(tài)而與疏水碳鏈的作用力增強。而堿類分析物則受硅膠基質pH上限的嚴重影響(以前上限是8,后來抬到10,直到最近雜化硅膠才將pH上限提到12左右)。錢鹽類離子對試劑確實有辛磺酸鈉等所不具有的屏蔽硅醇基作用，但其主要作用還是疏水端和疏水固定相結合，外露的陽離子親水端和酸陰離子作用，從而提高其保留能力。當然還有第二種解釋機理，離子對試劑先和分析物結合，掩藏極性基，從而提高極性分析物在反相色譜中的保留能力。而且丁基比辛基疏水性差，這種情況下，認為后面的結合機理占上風的可能性更大。檢測胺類化合物，加入

10、三乙胺預先和硅醇基結合，胺和硅醇基作用被三乙胺取代，保留下降是肯定的。13、濾膜的材質分這么幾種：再生纖維素、聚四氟乙烯、硝酸纖維和醋酸纖維等，之前只知道有有機系和水系之分，各種不同材質的濾膜適合于什么樣的樣品？聚四氟乙烯：適用于所有有機溶劑，酸和鹽；醋酸纖維：不適用有機溶劑，特別適用水基溶液。再生纖維素膜：具有蛋白質吸收低，適用于水溶性樣品和有機溶劑；尼龍66:適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸，70%的乙醇，二氯甲烷，不適用與二甲基甲酰胺;14、普通的C18柱能作為正相色譜柱使用嗎？正相色譜體系中最常用也最普通的是那種色譜柱。正相柱在使用過程中與反向柱相比有什么需要注意的地方？答：

11、普通C18柱作為正相柱使用，我還沒聽說過。正相色譜分離模式是指固定相的極性比流動相的極性大，反過來，流動相極性大就是反相。C18固定相屬于疏水性相對比較強的，疏水性強就是極性很弱，應該找不出極性比它更弱的流動相了。正相體系常見的柱子有：硅膠柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱，最普通的應該就是硅膠柱。正相柱和反相柱比，最需要注意的是水分，正相柱對水分非常敏感，流動相中水分含量的些微變化對保留時間影響很大，因此正相柱測定前平衡時間需要幾個小時甚至更長。15、我們在用的氨基柱時，有時候峰型突然變寬，有拖尾，用一段時間就又好了，不明白是什么原因造成的，如果要再生氨基柱的時候應該怎么做呢？氨基柱可以

12、直接用純水沖洗嗎？如果可以沖的話，一般沖多久？答：氨基柱的硅膠孔內(nèi)的氨基濃度非常高（大約有1mol/L）,在有水存在的時候，在孔內(nèi)形成一個pH10左右甚至超過10的很強的堿性小環(huán)境，并會導致硅膠基體慢慢溶解。不過硅膠基體的溶解會生成酸性的硅醇基，又會降低孔內(nèi)的pH值，延緩硅膠基體的溶解進程。一段時間后，兩個相反的過程會達成一個動態(tài)平衡，從而穩(wěn)定下來。對你問題提到的這個現(xiàn)象，我想到的是這個原因。氨基柱，要看氨基柱的應用模式，是正相還是HILIC?這兩種模式的情況是大不相同的。正相使用，一般很怕有水。但HILIC模式應用，一般流動相是乙月青/水，是不怕水的。不過鍵合氨內(nèi)基基團非常容易水解，所以一般

13、氨基柱不適宜保存有水的溶劑中。作為正相應用時，流動相中要求一點都不能含水，但清洗柱子上的污染物質，是可以含水的，因為水有強極性，在正相色譜上洗脫能力極強，當然不必用100%純水。氨基柱具體沖洗方法，正相條件按照正相硅膠柱的清洗方法，HILIC模式按C18柱的清洗方法。PH16、“磷酸鹽緩沖鹽滲透力強，有加快硅膠溶解的副作用，它的存在會降低使用范圍。，既然這樣，經(jīng)常使用，柱子壽命是否也下降的快呀？答：經(jīng)常用磷酸鹽，在其它條件差不多一樣的情況下，柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對短一些。但磷酸鹽也有不可取代的優(yōu)點，否則不可能大部分人還在用。17、通常我們在分析天然藥物成分的時候結構復雜，無法考察組分

14、的PKa值，哪我們?nèi)绾稳ミx擇最合適的流動相或者是拖尾該怎么改善呢？答：如果天然產(chǎn)物中沒有易電離的極卜t基團，就不需要用緩沖鹽調節(jié)pHo如果天然產(chǎn)物中既有酸性基團，也有堿性基團，譬如有pKa=6.2的竣基和pKa=9.0的氨基的兩性物質，建議將pH用磷酸鹽緩沖鹽控制在2.4（如果是諸如月旭的UltimateLP-C18這樣的耐酸色譜柱，還可以調得更低）。如果pH控制在6.2-9.0之間，兩個基團都處于離子態(tài)，保留能力最差，是最不可取的。如果不清楚復雜物質中含有什么基團，也請將pH調到2.4或更低。因為pH調低，起碼抑制了酸性基團的電離而處于中性分子狀態(tài)，而增加酸性基團這個部分在反相色譜中的保留能

15、力；另外低pH還抑制了硅醇基的活性，有利于獲取對稱的峰形。情況不明時候，為彳f么不建議調高pH呢？一方面一般色譜柱都不能承受pH9以上的條件；即使是像月旭的Xtimate系列一樣能耐12.5的柱子，調高pH和調低pH相比，還有一個硅醇基活性大的劣勢。18、新出廠液相色譜柱，保護溶劑一般是什么？怎樣進行平衡清洗比較好，一般要平衡多長時間比較好？答：柱子類型不同，保存溶劑也會不一樣吧，具體要看說明書的說明。對于反相柱，一般用甲醇（乙月青）保存，也有用80%左右甲醇濃度的甲醇/水保存的。一般用流動相平衡沖洗10-20個柱體積即可（注意：柱體積不等于空柱管體積，4.6x250mm的色譜柱空柱管體積是4

16、.15ml,而柱體積只有約2.5ml）。19、峰形后拖尾是什么原因造成的?柱物理損壞色譜柱有物理損壞是造成峰形拖尾的根源。唯一的解決方法就是更換新柱。柱內(nèi)填料污染流動相和樣品中的雜質是色譜柱主要污染源。復雜樣品可選用0.45um溶劑微孔過濾（器）或樣品預處理柱對樣品進行預處理，確保樣品中不含微粒雜質。若樣品不便處理，要使用保護柱。柱內(nèi)填料污染時，可將柱頭螺絲卸下，用專用工具挖出柱內(nèi)前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復?；蛞阅苋芙馕廴疚锏牧鲃酉喟瓷V柱使用的相反方向，沖洗色譜柱（約20至30倍柱體積，或視具體情況而定；另外，此時不能接檢測器），將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標明的使用方向

17、使用。柱進口處有異物當斷定是柱進口處有異物時，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內(nèi)即可。樣品濃度過高致使柱超載樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾（或伸舌）。適當減小進樣量或樣品濃度直至峰形和保留時間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150x4.6mm柱中進樣量保持在350ug范圍內(nèi)，不會引起明顯超載。樣品溶劑不對選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾。最好選用流動相溶解樣品。柱外效應柱外效應（即進樣閥、色譜柱及檢測器間的管路過長、直徑過粗、管

18、路接頭不匹配、有死體積）是影響色譜柱柱效的主要因素之一。所以在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內(nèi)徑盡可能細小，切口務必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴散造成不能反映色譜柱真實柱效等情況發(fā)生。緩沖不足或不合適在緩沖不好或離子強度過低的分離中，也會出現(xiàn)保留時間重現(xiàn)性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度（與樣品大小相匹配）能改善此情況。硅醇基團作用仔細分析色譜柱內(nèi)填料表面性質可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團或金屬雜質之間相互作用而引起雙重保

19、留機理，因此，發(fā)生了峰形拖尾。為了減小峰形拖尾，通?？稍诹鲃酉嗉尤?5mM三乙胺（抑制劑）。三乙胺能與硅醇基團發(fā)生強烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團的作用，以保證保留機理正常進行，并大大緩解了峰形拖尾。柱內(nèi)金屬污染柱內(nèi)金屬污染（Fe,Ni等）可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進，也可由腐蝕性流動相緩慢溶解柱進口的金屬濾片，隨流動相沉積到柱填料中。例如C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對稱的20、柱子的柱效影響大嗎？一般柱子的柱效規(guī)定是多少的呀！理論塔板數(shù)一般要達到多少呢？主要有那些因素影響它。答：柱效是柱子

20、性能好壞的一個重要體現(xiàn)指標。柱效會影響分離度，當然是峰形越尖銳，柱效越高，和其它峰越容易分開。另外柱效高峰形尖銳，對峰面積的積分誤差就小，甚至可以用峰高來定量。一般C18柱，在測定甲苯等不易拖尾的小分子中性不電離物質時，5um的填料，每米的柱效能達到80000以上的塔板數(shù)，就算合格吧。一般藥典有規(guī)定最低柱效是2000-3000。但柱子在使用后，由于固定相流失等原因，柱效會逐步下降，當下降到不符合藥典最低柱效要求，或者導致分離度不夠時，色譜柱就算壽命到了。單從柱效逐步下降這個角度看，柱效高的色譜柱相對使用壽命更長。影響柱效的因素有粒徑、粒徑和孔徑分布、固定相鍵合密度、柱外體積和溫度等，柱子裝填緊

21、密、柱床均勻一致也對提高柱效有好處。這些影響因素中，很多是和生產(chǎn)廠商有關，你這邊能做的是盡量減少柱外連接體積。21、流動相中加入四氫味喃對柱子有損害嗎？我現(xiàn)在分析一樣品流動相中用到20%的四氫味喃才能把峰分到基線.但柱子只能用一個星期分離效果就不好了.請問是四氫味喃損壞了柱子嗎？答：四氫味喃（THF）是反相色譜中洗脫能力極強的溶劑，比甲醇和乙月青都強很多。在流動相中加入THF能改善某些難分離的物質對的分離度。但THF不穩(wěn)定，容易降解生成具有很強反應活性的過氧化物，能與分析物反應生成新化合物，導致拖尾、峰分裂和鬼峰產(chǎn)生。高反應活性的過氧化物還可以和填料固定相發(fā)生化學作用，THF對柱子有損傷這點是

22、無疑的，而且這種損傷是隨時間累積的。THF保質期一般規(guī)定是6個月，放得越久，里面產(chǎn)生的過氧化物含量越大，你應該避免使用生產(chǎn)日期已很久的THF溶劑，而且最好將THF冷藏、干燥和避光保存，使用前最好能檢測一下過氧化物的含量。22、C18分析時染了，我用高流速，和反向沖洗都解決不了，有沒有其他的辦法?答：高流速反向沖洗是對的，關鍵你用了什么溶劑沖洗呢？用原來的流動相沖洗肯定不管用，要不然就不會累積在柱子上了。你應該用流動相中的強溶劑B沖洗，如果不行，就需要啟用再生的程序，當然再生時用的溶劑更強。100%甲醇-100%乙晴-75%乙晴/25%異丙醇-100%異丙醇-100%二氯甲烷-100%正己烷用每

23、種溶劑沖洗至少10個柱體積，對于250mmx4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是12ml/min。最后用10柱體積的異丙醇過渡，然后回到原來的流動相體系。再生還不解決問題，最后一招就是挖補柱頭填料，把柱頭污染的填料挖掉，用干凈填料填補進去。挖補填料，破壞原有柱床結構，挖補后柱效也不可能有新柱水平，或許能再維持一段時間，但不會長久。23、反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護：流動相中不含緩沖鹽：甲醇（或乙月青）：水=90:10反向沖洗色譜柱45min流動相中含緩沖鹽：甲醇（或乙月青）：水=10:90反向沖洗45min;然后甲醇（或乙月青）：水=90:10反向沖洗色譜柱45min。（注意：甲醇（或乙月青）：水=10:90容易長菌，使