線蟲RNA干擾的基因沉默

1、- -線蟲RNA干擾的基因沉默一、實驗背景及目的1、 RNA干擾RNAi是一種使基因使失活的有效方法，在線蟲中，RNA干擾因為簡單快速成為研究基因功能的有效手段。2、 秀麗線蟲是一種生活在土壤中的線蟲，長約1mm，直徑70um，由959個細胞組成。它具有生活周期短、易培養(yǎng)和保存等優(yōu)點。秀麗線蟲具有雌雄同體和雄性個體兩種性別。雌雄同體的線蟲有兩條X染色體和5對常染色體。其基因組大小為80Mb，包含13000個基因。秀麗線蟲在20時生活周期為3.5天，25時約為3天，15時約為6天。受精卵經(jīng)過胚胎發(fā)生孵化出L1、L2、 L3 、L4，最后成為成熟的幼蟲。當食物缺乏或群體密度過大等環(huán)境不良的條件時，

2、L2會不進入L3而成為dauer幼蟲來抵御不良環(huán)境，當環(huán)境恢復(fù)后dauer幼蟲不經(jīng)過L3直接進入L4。因此可以利用該特性保存線蟲品系。3、 RNAi是一種基因knock down 技術(shù)，將體外合成的含有目的基因的dsRNA通過某種方式引入到線蟲體內(nèi)，導(dǎo)致其體內(nèi)相應(yīng)的目的基因mRNA降解，從而到達基因沉默的目的。通過顯微注射dsRNA或者把線蟲浸入到含有dsRNA的溶液中，或者用能夠表達dsRNA的大腸桿菌喂食線蟲，可以將dsRNA導(dǎo)入大腸桿菌中。在大腸桿菌HT115中，含有目的基因發(fā)夾構(gòu)造的質(zhì)粒，在IPTG的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出正義和反義的RNA,兩條RNA鏈通過退火形成dsRNA。當線蟲以此大腸桿菌

3、為食時，他們就攝取了大腸桿菌合成的dsRNA，并觸發(fā)了線蟲體內(nèi)RNA干擾的發(fā)生。4、 本實驗將利用表達tag-214dsRNA大腸桿菌喂食線蟲來介導(dǎo)RNAi，以到達鑒定tag-214基因功能以及觀察實驗效果的目的。2、 實驗材料及試劑1、材料： 1 秀麗線蟲C.elegansrrf-3突變體RNAi敏感型 2 大腸桿菌E.coli野生型菌株OP50 3 帶有tag-214發(fā)夾構(gòu)造質(zhì)粒的HT115菌株。2、試劑： 1 NGM普通固體培養(yǎng)基 2含有Amp+和IPTG的NGM固體培養(yǎng)基用于RNAi 3LB培養(yǎng)基 4M9緩沖液3、 實驗操作由于此次試驗培養(yǎng)基配制以及大腸桿菌培養(yǎng)等的前期過程是由兩個大組

4、分別進展的，我詢問了第二大組的實驗相關(guān)步驟，但還是會有紕漏，所以有些實驗過程和實際的操作會有過失，有些細節(jié)也會省略。1、配制NGM固體平板，M9緩沖液，LB培養(yǎng)基具體配制所需要的成分和用量在實驗書上均有，需要在比例和一些操作上多加注意。1） NGM普通固體平板每組需要配制500ml實際上配少了，其中的細菌蛋白胨為peptone。膽固醇以及磷酸鉀緩沖液要在其他組分混合并且高溫滅菌之后參加，統(tǒng)一倒平板，放置20h左右至外表枯燥。2） LB培養(yǎng)基中的胰蛋白酶凍是typtone，我們每組配制了500ml，121高壓蒸汽滅菌。3） Amp+為200mg/l tet+為100mg/l IPTG為1Mm ,

5、均需要抽濾之后放入離心管中。4第二大組配制LB培養(yǎng)基Amp+ tet+NGM固體平板Amp+IPTG濃度為4mM。2、 大腸桿菌的培養(yǎng)1） 在NGM普通固體平板上劃線培養(yǎng)大腸桿菌OP502） 在NGM固體平板Amp+ tet+上劃線培養(yǎng)大腸桿菌HT115(對照組和實驗組)3、 大腸桿菌的活化1） 大腸桿菌OP50的活化：挑取少量的大腸桿菌OP50到LB普通液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)20h。之后鋪到NGM普通固體平板。2） 大腸桿菌HT115的活化：挑取少量的大腸桿菌HT115(對照組和實驗組)到LB培養(yǎng)基Amp+ tet+中，37振蕩培養(yǎng)20h。3） 大腸桿菌HT115的再活化：吸取1mL的大

6、腸桿菌HT115(對照組和實驗組)到LB培養(yǎng)基Amp+ tet-中，37振蕩培養(yǎng)20h。之后鋪到NGM固體平板Amp+ tet+上。4、 rrf-3突變體的培養(yǎng)：將線蟲rrf-3突變體接種到含有大腸桿菌OP50的NGM普通固體平板上，20培養(yǎng)。5、 線蟲擴繁用到chunck選擇線蟲rrf-3突變體培養(yǎng)基中未受到污染而且線蟲長勢較好的局部切下一小塊(手術(shù)刀蘸酒精，酒精燈燒，重復(fù)三次)，接到大腸桿菌OP50的NGM普通固體平板上。20培養(yǎng)由于線蟲長勢問題，培養(yǎng)了接近三天6、 線蟲生長周期的同步化1） 取3mL的M9緩沖液參加到線蟲rrf-3突變體的NGM普通固體平板，反復(fù)輕輕地晃動平板，將平板上的

7、線蟲沖洗下來，然后將含有線蟲的M9緩沖液轉(zhuǎn)移到15mL的離心管中。2） 向離心管參加2mL的Naclo溶液和1mLNaOH(5mol/L)溶液，之后馬上蓋緊蓋子劇烈晃動離心管。當發(fā)現(xiàn)溶液中的線蟲身體呈現(xiàn)彎曲狀，并且還沒有出現(xiàn)絮狀物時，參加M9緩沖液至15mL以終止反響。3000r/min離心1min。3） 棄上清，加M9緩沖液至15mL，3000r/min離心1min，重復(fù)。4） 棄上清，小心吹打沉淀，并將沉淀滴入未鋪菌的NGM普通固體培養(yǎng)皿中央，20培養(yǎng)16-20小時。7、 收獲L1幼蟲及chunck1) 培養(yǎng)16-20h后，NGM平板上的線蟲發(fā)育成L1幼蟲。取500uL的M9緩沖液沖洗平板

8、中的線蟲，并將沖洗下的L1幼蟲放到1.5mL的離心管中。將L1幼蟲平均分為兩份，分別接到大腸桿菌HT115(對照組和實驗組)的平板中。20培養(yǎng)。2) 將培養(yǎng)線蟲的培養(yǎng)基選擇無污染且線蟲長勢較好的局部切下來一小塊，接到OP50平板上，對照組和實驗組分別接1個大板，普通的小板兩個培養(yǎng)線蟲留著做后續(xù)的實驗的。8、 Single worm挑單個蟲睫毛依次蘸取Naclo 、70%乙醇、無菌水/M9緩沖液，在顯微鏡下分別挑取實驗組和對照組的線蟲，分別放在兩個含有OP50的NGM固體培養(yǎng)板上，每個平板里兩只線蟲我們有的平板里會多挑取一只。9、 觀察RNAi的表型和效率第二天在顯微鏡下觀察并且對實驗組和對照組

9、平板內(nèi)的卵進展計數(shù)。4、 實驗結(jié)果這是我們計數(shù)得到的結(jié)果對照組 實驗組1212蟲卵數(shù)358131 接蟲數(shù)2322蟲卵數(shù)/接蟲數(shù)17.5271.50.5我將對照組和實驗組的蟲卵數(shù)/接蟲數(shù)取了平均值，并運用EXCEL做成了柱狀圖進展明顯的比較。5、 結(jié)果分析從數(shù)據(jù)以及圖標結(jié)果看來，對照組平均產(chǎn)卵比例遠高于實驗組的產(chǎn)卵比例，說明tag-214基因有控制線蟲產(chǎn)卵的功能，當這種基因被沉默掉后，線蟲的產(chǎn)卵率明顯下降，另一方面也說明此次的RNA干擾實驗做的比較成功，得到了與理論相一致的結(jié)果。但是在實驗過程中，我們也出現(xiàn)了一些問題，包括有平板的雜菌污染，最后得到的去做RT-PCR的菌也較少，所以，在下面，主要

10、對這些細節(jié)錯誤以及過程中的本卷須知進展分析：1、 在實驗過程過需要配制的試劑以及其它溶液要根據(jù)配方和用量，按照一定比例配，在秉著不浪費的前提下可以多配制一些，以備不時之需。2、 在對大腸桿菌或者線蟲進展培養(yǎng)或者操作的時候，一定要在超凈臺，而且不要通過其他方式造成污染。在后面chunck的時候，由于好多平板上都被污染，干凈的平板已經(jīng)不夠了，所以我們最后缺少的平板只能挑選污染最小用，這也給我們后來的實驗造成了很大的干擾，因為污染并沒有排除，而是越來越重，導(dǎo)致培養(yǎng)的線蟲不能用。3、 沖洗L1幼蟲并分板培養(yǎng)的時候，盡量把幼蟲的量平分，否那么有的板長出來的蟲多，有的少，而我們蟲多的平板被污染了，所以后面

11、RT-PCR的線蟲是使用教師提供的線蟲進展的實驗。4、 在挑取線蟲的時候，睫毛要按照順序依次蘸取Naclo 、70%乙醇、無菌水/M9緩沖液，順序不要錯也不要落下，最后在計數(shù)的時候可以選擇在平板外表進展十字劃線計數(shù)法，這樣計數(shù)可以簡單方便一些。 RNA的提取、鑒定以及RT-PCR1、 實驗背景1、 RNA的制備是通過cDNA途徑克隆目的基因，了解基因在不同的組織或細胞中的表達水平，以及研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等必不可少的實驗技術(shù)。RT-PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈擴增相結(jié)合的技術(shù)。2、 本次試驗利用Trizol法提取RNA ，Trizol的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可以

12、裂解細胞，促進核蛋白體的解離，并將RNA釋放到溶液中；苯酚會使蛋白質(zhì)變性，參加氯仿后可抽提苯酚，促使RNA進入水相。3、 RNA是一類極易被降解的分子，因此要得到完整的RNA必須要最大限度的抑制提取過程中內(nèi)源或者外源的RNA酶活性。提純得到的RNA可以使用非變性和變性凝膠電泳進展檢測。非變性RNA凝膠電泳可防止使用有毒的物品，但是由于RNA分子相互作用形成大量的雙鏈構(gòu)造，故無法判斷RNA的相對分子質(zhì)量。在完全變性的條件下，RNA分子完全伸展，其電泳遷移率與相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測定RNA分子相對分子質(zhì)量時，一定要用變性凝膠。4、 在總RNA分子中以rRNA最多，占80%-85%，

13、完整為降解的RNA分子的電泳圖譜可以清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三條帶。如果28s和18s條帶明亮，條帶邊緣清晰，且28s條帶的亮度是18s條帶的兩倍以上，那么認為RNA沒有被降解。經(jīng)過鑒定未降解的RNA分子可通過RT-PCR反響對某一特定的基因進展擴增。RT-PCR反響由兩局部組成，首先是以RNA為模板合成cDNA，然后以cDNA為模板通過PCR擴增目的片段。用于逆轉(zhuǎn)錄的引物有隨機引物、Oligo dT以及基因特異性引物。Oligo dT適合具有polyA尾巴的RNA，不能用于原核生物的RNA，真核生物的rRNA 和 tRNA等。5、 本實驗的目的是以線蟲為實驗材

14、料，通過提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴增線蟲的acting 基因的片段，學(xué)習(xí)并掌握RNA提取和鑒定，以及RT-PCR反響的根本原理和實驗技術(shù)。2、 實驗材料與試劑1、 實驗材料：秀麗隱桿線蟲野生型N22、 實驗試劑：Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇、瓊脂糖、DNA上樣緩沖液、RT試劑盒，Premix Tap酶。3、 實驗操作1） RNA分子的提取1、2 mL M9溶液 1500 r/min，離心1 min收集線蟲；將蟲體轉(zhuǎn)移到無RNA酶的研缽中，參加液氮研磨。其間不斷參加液氮，直至研磨成粉末狀。2. 收集研磨的粉末，按50100 mg組織/mL Trizol 參加Trizol，室溫

15、靜置5 min。3. 12,000 r/min 4 離心10 min。4. 小心吸取上清液，移入新的離心管中切勿吸取沉淀)。5. 參加氯仿200 µl氯仿/mL Trizol，蓋緊管蓋，用力震蕩15秒，再室溫靜置3 min。6. 12,000 r/min 4離心10 min。7. 從離心機中小心取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中。8. 向上清中參加異丙醇500 µL異丙醇/mL Trizol)，上下顛倒充分混勻后，室溫靜置10 min。9. 12,000 r/min 4離心10 min。10. 小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁參加75的乙醇l mL，輕輕上下顛倒離心

16、管，12,000 r/min 4離心5 min后，小心棄去乙醇。11. 室溫枯燥沉淀25 min后，參加適量的RNase-free水溶解沉淀。12. 待RNA沉淀完全溶解后進展RT-PCR反響。2） 通過甲醛變性凝膠電泳鑒定提取的RNA這一局部是教師為我們完成的，具體的操作步驟就是按照ppt上的來看的。1.將電泳槽和制膠用具在0.3% H2O2中浸泡30 min，取出后用DEPC水沖洗并晾干。然后用75%乙醇沖冼一遍，晾干備用。2配制瓊脂糖凝膠：1稱取0.5 g瓊脂糖，置干凈的100 mL錐形瓶中，參加36 mL DEPC水，微波爐內(nèi)加熱使瓊脂糖徹底溶化均勻。2膠冷卻至6070 后，依次向其中

17、參加9 mL甲醛、5 mL 10MOPS緩沖液和3 L溴化乙錠1g/L，混合均勻。（3） 倒入已放置好梳齒的膠板內(nèi)，于室溫放置30 min以上使凝膠凝固。凝膠凝固后，小心取出梳齒，將膠放入電泳槽中，參加1×MOPS 緩沖液使凝膠剛好浸沒。3樣品準備：1 取DEPC處理過的500 L小離心管，依次參加10×MOPS緩沖液2 L、甲醛3.5 L、甲酰胺去離子10 L、RNA 樣品4.5 L，混勻。2將離心管置于60 水浴中保溫10 min，再置冰上2 min。3向管中參加3 L上樣緩沖液，混勻。4上樣：將上述處理好的樣品依次參加凝膠的各加樣孔中。5電泳：將樣品參加加樣孔后，以3

18、4 V/cm電壓降電泳，當溴酚蘭移動到膠的3/4處停頓電泳。 6檢測和分析：電泳完畢后，在紫外燈下檢查結(jié)果。3） RT-PCR反響1. 逆轉(zhuǎn)錄RT反響1取3 µg RNA ，2µgOligo dT至eppendorf 管中，70 10 min，高速離心5 sec 后置于冰上，目的是翻開RNA的二級構(gòu)造；2按以下順序在一新管中參加以下試劑20 µL體系： MgCl225mmol/L 2.4 µL 5× Reverse Transcription buffer 4 .0µL dNTP mixture10 mmmol/L 1.0µ

19、L Rebinant RNasin RibonuClease inhibitor 1.0µL AMV Reverse Transcriptase 25 U/µL 0.6 µL15 U RNA 1 µg 用RNase-free ddH2O補足至20 µL（3） 反響過程：25 5min ,42 1h ,70 15min ,4放置繼續(xù)或者20保存。2. PCR反響反響體系為25uL Premix Ex Taq 12.5 µL Sense引物 (10 µM) 1 µL Antisense 引物(10 µM) 1

20、 µL cDNA 5uL(稀釋5倍)用ddH2O補足體積至25 µL PCR反響條件為： 94 1 min 94 30 sec 55 1 min 72 30 sec從94 30 sec至此步驟重復(fù)30次 72 5min3. DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR實驗結(jié)果。4、 實驗結(jié)果及分析本次實驗結(jié)果主要是根據(jù)RNA和DNA電泳結(jié)果來判斷成功與否的。所以在接下來附上電泳結(jié)果。電泳結(jié)果圖：1、 RNA甲醛變性凝膠電泳鑒定圖2、 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖5、 實驗結(jié)果分析1） RNA甲醛變性凝膠電泳鑒定圖 在電泳圖中與MAKER條帶比照可以發(fā)現(xiàn)三條條帶，由遠及近分別為18sr

21、RNA、18srRNA、5srRNA。其中，5srRNA含量少，所以條帶較暗，很不清楚；18srRNA、28srRNA條帶均很亮，條帶邊緣比較清晰，而且28srRNA條帶的亮度可以到達18srRNA條帶亮度的2倍，說明我們組提取的RNA沒有被降解。但是在上樣孔處有一條暗暗的條帶，查閱資料說，上樣孔處如果有條帶，說明有DNA污染。整個組根本上都存在或明或暗的條帶，但是從后面的結(jié)果來看，其他大多數(shù)組都沒什么影響，只有我們組出現(xiàn)了一條雜帶，所以，我認為，少量的DNA污染對實驗結(jié)果的影響較小。不過，不能排除影響的存在，所以在RNA沉淀以及沉淀別離的過程中一定要多加注意，要把上清棄的干凈些，否那么稍有的

22、才能留可能會造成很大的影響。2） DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖 我們是第一大組第四小組，從最后的實驗結(jié)果來看，我們組確實獲取到了RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到了cDNA,因此也在PCR之后擴增得到了Acting 的基因片段。但是，唯一的缺憾是，我們的電泳條帶中竟然多出了一條較清晰明亮的雜帶，第3小組也有，但是亮度很暗，我也看了第二大組的結(jié)果，未出現(xiàn)一樣的狀況。通過在網(wǎng)上查閱資料，分析在該過程中出現(xiàn)雜帶的原因：1、內(nèi)參引物的特異性不好，可能是非特異性擴增導(dǎo)致。2、反轉(zhuǎn)的cDNA里面含有較多的基因組DNA，可能是RNA提取質(zhì)量不到位導(dǎo)致，碰巧這對內(nèi)參引物橫跨了內(nèi)含子，從而導(dǎo)致PCR出現(xiàn)2條帶。加上之前RNA 點用的結(jié)果，整體分析，我覺得出現(xiàn)雜帶的原因是之前RNA提取的不到位，含有少量的DNA ，在整個過程中，大家所添加的引物都是一樣的，所以