Southern雜交

1、Southern雜交Southern雜交是分子生物學(xué)的經(jīng)典實驗方法。其基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。（Q往圣科技3452125268提供12萬種免費質(zhì)粒）通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。該項技術(shù)廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測、DNA指紋分析和PCR產(chǎn)物判斷等研究中。但由于該技術(shù)的操作比較煩瑣、費時，所以現(xiàn)在有一些其他的方法可以代替Southern雜交。但該技術(shù)也有它的獨特之處，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多態(tài)性（RFLP的檢測等

2、。一、基因組DNA的制備（前述）（Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免費送）二、基因組DNA的限制酶切（Q往圣科技3452125268提供12萬種CRISPR/cas9免費送）根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定酶切DNA的量。（Q往圣科技3452125268提供張峰Science的CRISPR/cas9免費送）一般Southern雜交每一個電泳通道需要10-30g的DNA。購買的限制性內(nèi)切酶都附有相對應(yīng)的10倍濃度緩沖液，并可從該的產(chǎn)品目錄上查到最佳消化溫度。為保證消化完全，一般用2-4U的酶消化1科g的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5g/l為好。由于內(nèi)切酶是保存

3、在50%甘油內(nèi)的，而酶只有在甘油濃度5%的條件下才能發(fā)揮正常作用，所以加入反應(yīng)體系的酶體積不能超過1/10。具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入DNA（1g/科l）20gg10X酶切buffer4.0“限制性內(nèi)切酶（10U/“）5.0“加ddhhO至500“在最適溫度下消化1-3hr。消化結(jié)束時可取5“電泳檢測消化效果。如果消化效果不好，可以延長消化時間，但超過6hr已沒有必要?；蛘叻糯蠓磻?yīng)體積，或者補充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質(zhì)，或酶的活力下降。消化后的DNA加入1/10體積的0.5MEDTA,以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提，2.5倍體

4、積乙醇沉淀，少量TE溶解（參見DNA提取方法，但離心轉(zhuǎn)速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丟失）。如果需要兩種酶消化DNA,而兩種酶的反應(yīng)條件可以一致，則兩種酶可同時進行消化；如果反應(yīng)條件不一致，則先用需要低離子強度的酶消化，然后補加鹽類等物質(zhì)調(diào)高反應(yīng)體系的離子強度，再加第二種酶進行消化。三、基因組DNA消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳（Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免費質(zhì)粒加慢病毒包裝）瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，制備簡單，分離范圍廣（200bp-50kb）,實驗成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA-片段范圍。表：不同

5、濃度瓊脂糖凝膠分離DNA-片段的范圍瓊脂糖凝膠濃度（%）分離DNA-片段范圍（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-21 .制備0.8%凝膠：一般用于Southern雜交的電泳膠取0.8%。（Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免費基因慢病毒包裝）2 .電泳：電泳樣品中加入6xLoading緩沖液，混勻后上樣，留一或兩泳道加DNAMarker。1-2V/cm,DNA從負極泳向正極。電泳至澳酚藍指示劑接近凝膠另一端時，停止電泳。取出凝膠，紫外燈下觀察電泳效果。在膠的一邊放置一把刻度尺，

6、拍攝照片。正常電泳圖譜呈現(xiàn)一連續(xù)的涂抹帶，照片攝入刻度尺是為了以后判斷信號帶的位置，以確定被雜交的DNA長度。四、DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物（Q往圣科技3452125268提供12萬種免費質(zhì)粒力口,慢病毒包裝）轉(zhuǎn)移就是將瓊脂糖凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜（NC膜）或尼龍膜上，形成固相DNA。轉(zhuǎn)移的目的是使固相DNA與液相的探針進行雜交。常用的轉(zhuǎn)移方法有鹽橋法、真空法和電轉(zhuǎn)移法。這里介紹經(jīng)典的鹽橋法（又稱為毛細管法）。（一）試劑準(zhǔn)備（Q往圣科技3452125268提供免費基因慢病毒包裝）1 .變性液：0.5MNaOH;1.5MNaCl。2 .中和液：1MTris-HCl（pH7.4）;

7、1.5MNaCl;3 .轉(zhuǎn)移液（20XSSQ:NaCl175.3g;檸檬酸三鈉82.2g,NaOH調(diào)pH至7.0,加ddHzO至1000ml。（二）操作步驟1 .堿變性：室溫下將凝膠浸入數(shù)倍體積的變性液中30min。2 .中和:將凝膠轉(zhuǎn)移到中和液15min。3 .轉(zhuǎn)移按凝膠的大小剪裁NC膜或尼龍膜并剪去一角作為標(biāo)記，水浸濕后，浸入轉(zhuǎn)移液中5min。剪一張比膜稍寬的長條Whatman3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。按下圖所示進行轉(zhuǎn)移。（轉(zhuǎn)移過程一般需要8-24hr,每隔數(shù)hr換掉已經(jīng)濕掉的紙巾。轉(zhuǎn)移液用20XSSC注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個操作過程中要防止

8、膜上沾染其他污物。）4 .轉(zhuǎn)移結(jié)束后取出NC膜，浸入6XSSC溶液數(shù)min,洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間，80七烘2hr,然后將NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。五、探針標(biāo)記（你提供質(zhì)粒，我給你免費包裝成慢病毒Q往圣科技3452125268）進彳fSouthern雜交的探針一般用放射性物質(zhì)標(biāo)記或用地高辛標(biāo)記。放射性標(biāo)記靈敏度高，效果好；地高辛標(biāo)記沒有半衰期，安全性好。這里介紹放射性標(biāo)記（快速畢業(yè)，你提供實驗材料，我免費給你做實驗，成果歸你享有Q往圣科技3452125268,）探針的標(biāo)記方法有隨機引物法、切口平移法和末端標(biāo)記法，有一些試劑盒可供選擇，操作也很簡單。（你提供實驗材料，

9、我免費給你做實驗，成果歸你享有Q往圣科技3452125268）以下為Promega隨機引物試劑盒提供的標(biāo)記步驟：1 .取25-50ng模板DNA于0.5ml離心管中，100c變性5min,立即置冰浴。2 .在另一個0.5ml離心管中加入：Labeling5xbuffer10l（含有隨機引物）dNTPmix2科l（含dCTRdGTRdTTP各0.5mM）BSA（小牛血清白蛋白）2。：-32PdATP36Klenow酶5U3 .將變性模板DNA加入到上管中，力口ddH2O至50口，混勻。室溫或37C1hr。4 .加50口終止緩沖液終止反應(yīng)。標(biāo)記后的探針可以直接使用或過柱純化后使用。由于a-32P的

10、半衰期只有14天，所以標(biāo)記好的探針應(yīng)盡快使用。探針的比活性最好大于109計數(shù)/分/pl。六、雜交Southern雜交一般采取的是液-固雜交方式，即探針為液相，被雜交DNA為固相。雜交發(fā)生于一定條件的溶液（雜交液）中并需要一定的溫度，可以用雜交瓶或雜交袋并使液體不斷的在膜上流動。雜交液可以自制或從購買，不同的雜交液配方相差較大，雜交溫度也不同。下面給出的為一雜交液配方：PEG600010%SDS0.5%6XSSC50%甲酰胺。該雜交液的雜交溫度為42C。1 .預(yù)雜交NC膜浸入2XSSC435min,在雜交瓶中加入雜交液（8cmX8cm的膜加5ml即可），將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放

11、入42c雜交爐中，使雜交體系升到42CO取經(jīng)超聲粉碎的鞋魚精DNA（已溶解在水或TE中）100C加熱變性5min,迅速加到雜交瓶中，使其濃度達到100g/ml。繼續(xù)雜交4hr。鞋魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉(zhuǎn)移的位點，降低雜交背景、提高雜交特異性。2,雜交倒出預(yù)雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42c的雜交液，同樣加入變性的鞋魚精DNA。將探針100c加熱5min,使其變性，迅速加到雜交瓶中。42c雜交過夜。七、洗膜與檢測取出NC膜，在2XSSO液中漂洗5min,然后按照下列條件洗膜：2XSSC/0.1%SDS42C,10min；1XSSC/0.1%SDS42C,10min；0.5

12、XSSC/0.1%SDS42C,10min;0.2XSSC/0.1%SDS56C,10min;0.1xSSC/0.1%SDS56C,10min。在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。實踐證明，當(dāng)放射強度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時，是洗膜的終止點。上述洗膜過程無論在哪一步達到終點，都必須停止洗膜。洗完的膜浸入2XSSC432min,取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，并用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與NC膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入暗盒中（加雙側(cè)增感屏），在暗室的紅光下，貼覆兩張X光片，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70C低溫冰箱中曝光。根據(jù)信號強弱決定曝光時間，一般在1-3天時間。洗片時，先洗一張X光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時間，再洗第二張片子。影響Southern雜交實驗的因素很多，主要有：DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉(zhuǎn)移效率、探針比活性和洗膜終止點等。七、注意事項（標(biāo)本檢測，你提供標(biāo)本，我免費給你做實驗，成果歸你享有Q往圣科技3452125268）1.要取得好的轉(zhuǎn)移和雜交效果，應(yīng)根據(jù)DNA分子的大小，適當(dāng)調(diào)整變性時間。對于分子量較大的DNA-片段（大于15kb）,可在變性前用0.2MHCl預(yù)處理10min