生物質(zhì)譜：液相串聯(lián)質(zhì)譜法在生物樣品分析中的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題

1、2022年5月4日LC/MS/MS在生物樣品分析時(shí)的關(guān)鍵問(wèn)題吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年5月4日 簡(jiǎn)介 LC/ESI-MS/MSLC/ESI-MS/MS是近是近1010年來(lái)發(fā)展成熟的分析技術(shù)，年來(lái)發(fā)展成熟的分析技術(shù)，它集高效液相色譜的高分離性能與質(zhì)譜的高靈敏度、它集高效液相色譜的高分離性能與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性的優(yōu)點(diǎn)于一體，已成為定量測(cè)定生物樣品高選擇性的優(yōu)點(diǎn)于一體，已成為定量測(cè)定生物樣品中藥物及其代謝產(chǎn)物的最強(qiáng)有力分析手段。中藥物及其代謝產(chǎn)物的最強(qiáng)有力分析手段。 然而，它在分析生物樣品過(guò)程中也碰到了具有然而，它在分析生物樣品過(guò)程中也碰到了具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題挑戰(zhàn)性的問(wèn)題基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)于以

2、人參皂苷為代表基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)于以人參皂苷為代表的中性、熱不穩(wěn)定、難于離子化的皂苷類(lèi)化合物來(lái)的中性、熱不穩(wěn)定、難于離子化的皂苷類(lèi)化合物來(lái)說(shuō)，基質(zhì)效應(yīng)的影響更為嚴(yán)重。說(shuō)，基質(zhì)效應(yīng)的影響更為嚴(yán)重。 離子抑制效應(yīng)不僅影響檢測(cè)的靈敏度，也影響離子抑制效應(yīng)不僅影響檢測(cè)的靈敏度，也影響定量的準(zhǔn)確性，因?yàn)檫@種抑制效應(yīng)在不同個(gè)體的相定量的準(zhǔn)確性，因?yàn)檫@種抑制效應(yīng)在不同個(gè)體的相同生物基質(zhì)間、甚至同一個(gè)生物樣品在不同的色譜同生物基質(zhì)間、甚至同一個(gè)生物樣品在不同的色譜保留時(shí)間可能均不一樣，這樣就會(huì)使測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)保留時(shí)間可能均不一樣，這樣就會(huì)使測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性受到嚴(yán)重影響。確性受到嚴(yán)重影響。 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心20

3、22年5月4日基線基線 1234567891011Time, min20%40%60%80%100%Intensity, cps吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年5月4日血漿樣品經(jīng)液液萃取處理得到的譜圖血漿樣品經(jīng)液液萃取處理得到的譜圖 Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年5月4日Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%血漿樣品經(jīng)血漿樣品經(jīng)SPE處理得到的譜圖處理得到的譜圖 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2

4、022年5月4日尿樣經(jīng)液液萃取處理得到的譜圖尿樣經(jīng)液液萃取處理得到的譜圖 Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年5月4日Intensity, cps1.02.03.04.05.06.07.0Time, min20%40%60%80%100%尿樣經(jīng)尿樣經(jīng)2次水洗后的液液萃取處理得到的譜圖次水洗后的液液萃取處理得到的譜圖 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年5月4日吉林大學(xué)藥物代謝研究中心考察基質(zhì)效應(yīng)方法考察基質(zhì)效應(yīng)方法v柱后補(bǔ)償技術(shù)（柱后補(bǔ)償技術(shù)（Post-column Post-c

5、olumn addition/infusion, PCA/PCIaddition/infusion, PCA/PCI）補(bǔ)償標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以空白基質(zhì)提補(bǔ)償標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以空白基質(zhì)提取物進(jìn)樣測(cè)定取物進(jìn)樣測(cè)定-位置、強(qiáng)度位置、強(qiáng)度v標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣；標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣； 等量的標(biāo)準(zhǔn)溶等量的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白基質(zhì)提取物中進(jìn)樣；二者液加入空白基質(zhì)提取物中進(jìn)樣；二者峰面積比較峰面積比較 液相系統(tǒng)液相系統(tǒng) 色譜柱色譜柱 質(zhì)譜質(zhì)譜 三通閥三通閥 注射泵注射泵 2022年5月4日基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生原因吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年5月4日吉林大學(xué)藥物代謝研究中心影響檢測(cè)的靈敏度1影響定量的準(zhǔn)確性2基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果2022年5月4日

6、Key Point 2選擇合適的內(nèi)標(biāo)提高待測(cè)物的離子化效率、降低基質(zhì)效應(yīng)Key Point 1關(guān)鍵問(wèn)題提高LC/MS/MS的工作效率Key Point 3吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年5月4日提高離子化效率 1、改進(jìn)霧化效果 產(chǎn)生更多更小的液滴，提高離子/分子轉(zhuǎn)化比。 2 、模式選擇及優(yōu)化措施 酸性化合物流動(dòng)相中加鹽,如甲酸銨、乙酸銨，或堿（氨水）來(lái)增強(qiáng)化合物的離子化，一般采用負(fù)離子檢測(cè)模式。 堿性化合物流動(dòng)相中加酸以增強(qiáng)化合物的離子化,加甲酸的效果可能要好于醋酸和三氟乙酸。酸根負(fù)離子會(huì)與樣品正離子結(jié)合降低離子化效率，且三氟乙酸會(huì)明顯的抑制質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)，一般用正離子方式檢測(cè)。 3、慎重選擇

7、添加劑 商品化的LC-MS級(jí)醋酸銨、甲酸銨含有表面活性劑，抑制電離。實(shí)驗(yàn)中若需要，可以用氨水加酸調(diào)節(jié)而成。 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心2022年5月4日 4、優(yōu)化儀器參數(shù)（DP、CE、IS等） 5、鹽類(lèi)對(duì)離子信號(hào)的影響 一般小分子鹽的摩爾濃度比較高時(shí)，在電噴霧系統(tǒng)中有強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)性離子化作用，導(dǎo)致較強(qiáng)的離子抑制效應(yīng)，使得待測(cè)物的靈敏度明顯降低。 其次，鹽類(lèi)的存在將產(chǎn)生一系列的離子加合峰，使得譜圖的解析變復(fù)雜。此外，太多的鹽類(lèi)會(huì)腐蝕和污染質(zhì)譜系統(tǒng)硬件，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致硬件損壞，需要及時(shí)清洗。 高濃度的鹽對(duì)電噴霧有明顯負(fù)作用，微量鹽可能有助于某些物質(zhì)的靈敏度提高。一些不揮發(fā)鹽，如磷酸鹽、氯化鈉等，對(duì)質(zhì)譜造成

8、不可逆損傷。高鹽類(lèi)樣品，進(jìn)樣前一般要進(jìn)行脫鹽處理。6、控制進(jìn)樣濃度及上樣量 色譜柱、質(zhì)譜超載 吉林大學(xué)藥物代謝研究中心進(jìn)樣濃度大上樣量大2022年5月4日吉林大學(xué)藥物代謝研究中心Mass Spectrometry Reviews, 2001, 20, 362 3872022年5月4日消除/減小基質(zhì)的途徑吉林大學(xué)藥物代謝研究中心樣品處理液相條件選擇質(zhì)譜條件選擇2022年5月4日吉林大學(xué)藥物代謝研究中心樣品前處理方法樣品前處理方法 選擇合適的樣品前處理方法是消除基質(zhì)效應(yīng)影響最有效的的方式，對(duì)于不同的樣品處理方法，基質(zhì)對(duì)每種組分的影響也不同，要通過(guò)實(shí)驗(yàn)綜合其他參數(shù)（提取回收率，提取穩(wěn)定性，定量限等）

9、來(lái)確定樣品前處理方法。2022年5月4日柱子的選擇 填料的性質(zhì)、大小、柱長(zhǎng)、柱子口徑流動(dòng)相的選擇 組成、比例、流速、緩沖鹽、信號(hào)增強(qiáng)劑、pH值；洗脫方式的選擇（等梯度、梯度）；柱后補(bǔ)償 堿性藥物丙酸、異丙醇；酸性藥物2-（2-methoxyethoxy)ethanol。吉林大學(xué)藥物代謝研究中心優(yōu)化液相色譜條件優(yōu)化液相色譜條件 適當(dāng)?shù)卦黾哟郎y(cè)組分的保留時(shí)間；減少進(jìn)樣體積2022年5月4日離子源（ESI、APCI）選擇：總的趨勢(shì) ESI較APCI更易受基質(zhì)效應(yīng)的影響。檢測(cè)方式（負(fù)離子、正離子掃描方式）吉林大學(xué)藥物代謝研究中心優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)條件優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)條件2022年5月4日吉林大學(xué)藥物代謝研究中心雙內(nèi)標(biāo)法提高雙內(nèi)標(biāo)法提高LC/MS/MS