第二章基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)

1、Enzymes一、限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別是一類能夠識(shí)別雙鏈雙鏈DNA分子中的某種分子中的某種特定核苷酸序列特定核苷酸序列（48bp），并由此處），并由此處切割切割DNA雙鏈雙鏈的核酸的核酸內(nèi)切酶內(nèi)切酶。（Restriction endonuclease）2. 性質(zhì)性質(zhì)內(nèi)切酶。內(nèi)切酶。原核生物。原核生物。即在核酸分子鏈的即在核酸分子鏈的內(nèi)部內(nèi)部制造切口的酶。制造切口的酶。自我保護(hù)作用。自我保護(hù)作用。限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外外源源DNA切成小片斷。切成小片斷。細(xì)菌自身的細(xì)菌自身的DNA堿基被堿基被甲基化酶甲基化酶甲基化甲基化修飾所保護(hù)，

2、不能被自身的限制性內(nèi)切修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。酶識(shí)別切割。 Dam甲基化酶甲基化酶GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm甲基化酶甲基化酶CCAGG或或CCTGG序列在第二個(gè)序列在第二個(gè)C上上C5位置上引入甲基位置上引入甲基I 型限制性內(nèi)切酶型限制性內(nèi)切酶 目前鑒定出目前鑒定出三種不同類型三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。的限制性內(nèi)切酶。首先由首先由M. Meselson和和R. Yuan在在1968年從年從大腸桿菌大腸桿菌 B株株和和 K株株分離的。分離的。（1）識(shí)別位點(diǎn)序列）識(shí)別位點(diǎn)序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC如

3、如 EcoB和和 EcoK。未甲基化修飾的特異序列。未甲基化修飾的特異序列。需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。（3）作用機(jī)理）作用機(jī)理在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約10001500 bp處處隨機(jī)隨機(jī)切開一條切開一條單鏈單鏈。Recognize sitecut1-1.5kb首先由首先由H.O. Smith和和K.W. Wilcox在在1970年從流感嗜血菌中分離出來。年從流感嗜血菌中分離出來。 （1）識(shí)別位點(diǎn)序列）識(shí)別位點(diǎn)序列未甲基化修飾未甲基化修飾的的雙鏈雙鏈DNA上的特殊靶序上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。列（多數(shù)是回文序列）。 與與DNA的來源

4、無關(guān)。的來源無關(guān)。分離的第一個(gè)酶是分離的第一個(gè)酶是Hind 切開切開雙鏈雙鏈DNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky end）或）或平齊末端平齊末端（blunt end）。如：）。如：識(shí)別位點(diǎn)處。識(shí)別位點(diǎn)處。含有幾個(gè)核苷酸含有幾個(gè)核苷酸單鏈單鏈的末端。的末端。分兩種類型：分兩種類型： 5端凸出（如端凸出（如EcoR I切點(diǎn)）切點(diǎn)）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCAG GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 連接便利連接便利 i）不同的）不同的DNA雙鏈：雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可

5、以連接。只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個(gè)）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：分子內(nèi)連接：通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接通過兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成成環(huán)形分子環(huán)形分子。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。 補(bǔ)平成平齊末端補(bǔ)平成平齊末端凸出的凸出的3端端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或或TTT等）等）造成人工粘性末端。造成人工粘性末端。凸出的凸出的5末端末端可用可用DNA多核苷酸激多核苷酸激酶進(jìn)行酶進(jìn)行32P標(biāo)記。標(biāo)記。粘性末端可以用粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。末端。識(shí)別

6、位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。 完全同裂酶：完全同裂酶： 識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。 如如Hind 和和Hsu I。識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。 如如Xma I 和和 Sma I。識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等等 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)位點(diǎn)一般不能一般不能再被原來的酶識(shí)別。再被原來的酶識(shí)別。？Sau 3A限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和酶切活性一般在限制性內(nèi)切酶的識(shí)別

7、和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、一定的溫度、離子強(qiáng)度、pH等條件下才等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。表現(xiàn)最佳切割能力和位點(diǎn)的專一性。 如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性如果改變反應(yīng)條件就會(huì)影響酶的專一性和切割效率，稱為星號(hào)（和切割效率，稱為星號(hào)（*）活性。）活性。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。 星號(hào)（星號(hào)（*）活性）活性EcoR I和和BamH I等都有等都有*活性?；钚?。在低鹽、高在低鹽、高pH（8）時(shí)可識(shí)別和切割）時(shí)可識(shí)別和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的時(shí)候要特別注意！使用的時(shí)候要特別注意！7在

8、離它的在離它的不對稱識(shí)別位點(diǎn)不對稱識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的一側(cè)的特特定距離定距離處切割處切割DNA雙鏈。雙鏈。移動(dòng)切割（移動(dòng)切割（shifted cleavage):5 3 在完全肯定的位點(diǎn)切割在完全肯定的位點(diǎn)切割DNA，但反應(yīng)，但反應(yīng)需要需要ATP、 Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨腺苷蛋氨酸）。酸）。在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。1973年年H.O Smith和和D. Nathans提議的命提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：名系統(tǒng)，命名原則如下： 用用屬名屬名的第一個(gè)字母和的第一個(gè)字母和種名種名的頭兩個(gè)字母的頭兩個(gè)字母組成組成3個(gè)字母的略語表示個(gè)字母的略語表示寄主菌寄主菌的物種名。

9、的物種名。大腸桿菌（大腸桿菌（Escherichia coli）用）用Eco表示；表示； 流感嗜血菌（流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用）用Hin表示。表示。4. 限制酶前面要帶上限制酶前面要帶上R（Restriction)， 修飾酶前面要帶上修飾酶前面要帶上M（Modification）。）。（現(xiàn)已省略）。（現(xiàn)已省略）。2. 用一個(gè)右下標(biāo)的大寫字母表示用一個(gè)右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型菌株或型。如如Ecok, EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。）。3. 如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅

10、馬字母表示。的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如如EcoR I，EcoR V。DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。等都會(huì)影響酶的活性。 1. DNA的純度的純度 純化純化DNA 加大酶的用量加大酶的用量 延長保溫時(shí)間延長保溫時(shí)間 擴(kuò)大反應(yīng)體積（擴(kuò)大反應(yīng)體積（ 20 l）一般采取一般采取大腸桿菌一般有大腸桿菌一般有兩種甲基化酶兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：修飾質(zhì)粒：dam甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾GATC中的中的A）；）； dcm甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾CCA/TGG的的C）。）。基因工程中必須使用甲基化酶失活基因工程中必須

11、使用甲基化酶失活突變的菌株。突變的菌株。不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是大多數(shù)是37 oC，少數(shù)要求，少數(shù)要求40-65 oC。是影響限制酶活性的重要因素。是影響限制酶活性的重要因素。（1）緩沖液的化學(xué)組成）緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl： 提供提供Mg2+ +和離子強(qiáng)度；和離子強(qiáng)度； Tris-HCl： 維持維持pH； 二硫蘇糖醇（二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。

12、1. 內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式內(nèi)切酶與識(shí)別序列的結(jié)合模式 1986年年J.A. McClarin等通過等通過X射線晶體射線晶體衍射發(fā)現(xiàn)衍射發(fā)現(xiàn)II類限制酶是以類限制酶是以同型二聚體同型二聚體的的形式與靶序列結(jié)合。形式與靶序列結(jié)合。GAATTCCTTAAG內(nèi)切酶在內(nèi)切酶在DNA上的上的所有所有識(shí)別位點(diǎn)都被切識(shí)別位點(diǎn)都被切開。開。12 341234只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。只有有限數(shù)量的酶切位點(diǎn)被切開。 通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減通過縮短保溫時(shí)間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。12 3414大多數(shù)酶可用大多數(shù)酶可用65 oC溫育溫育5

13、分鐘失活。分鐘失活。 或用或用乙醇乙醇沉淀沉淀DNA。c從細(xì)菌從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。雙鏈連接到一起的酶。一、一、DNA連接酶（連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制一定有斷口。復(fù)制一定有斷口。（1）大腸桿菌連接酶）大腸桿菌連接酶1. 兩種兩種DNA連接酶連接酶只能連接只能連接粘性末端粘性末端。（2）T4噬菌體的連接酶噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，不但能連接粘性末端， 還能連接還能連接齊平末端齊平末端。（1）必須是兩條）必須是兩條雙鏈雙鏈DNA。（2）DNA3端有游離的端有游離的-OH， 5端有一個(gè)磷酸

14、基團(tuán)（端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。）。（3）需要）需要能量能量動(dòng)物或噬菌體中：動(dòng)物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中：大腸桿菌中： NAD+ +1. ATP（NAD+ +)提供激活的提供激活的AMP。2. ATP與連接酶形成共價(jià)與連接酶形成共價(jià)“連接酶連接酶-AMP”復(fù)復(fù)合物，并釋放出焦磷酸合物，并釋放出焦磷酸PPi。3. AMP與連接酶的與連接酶的賴氨酸賴氨酸 -氨基氨基相連。相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ + +H3NAMPATPPPi4. AMP隨后從連接酶的賴氨酸隨后從連接酶的賴氨酸 -氨氨基轉(zhuǎn)移到基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的一條鏈的5端端P上，形上，形成成“DNA-腺苷酸

15、腺苷酸”復(fù)合物。復(fù)合物。-OH HO-P-AMP-OHO-P-AMP5. 3-OH對磷原子作親核攻擊，形成對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出磷酸二脂鍵，釋放出AMP。連接酶反應(yīng)的最佳溫度是連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37 C。1. 最佳溫度最佳溫度但在但在37下下粘性末端粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。的結(jié)合很不穩(wěn)定。2. 實(shí)用溫度實(shí)用溫度所以一般采用所以一般采用 416 C。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。減少載體自我連接的現(xiàn)象。1. 插入片段與載體的濃度比例插入片段與載體的濃度比例 2. 反應(yīng)溫度反應(yīng)溫度12.5。1020倍。倍。一般一般141

16、6一、基因工程中常用的一、基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶聚合酶 4. T4 DNA聚合酶聚合酶 5. 修飾過的修飾過的T7 DNA聚合酶聚合酶 6. 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶1. 共同特點(diǎn)共同特點(diǎn)把把dNTPs連續(xù)地加到引物的連續(xù)地加到引物的3OH端。端。2. 主要區(qū)別主要區(qū)別T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來。而不從模板上掉下來。其它幾種其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加聚合酶只能連續(xù)添加10多多個(gè)個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。就會(huì)從模板上解

17、離下來。持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。1. 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 I主要用來制備帶放射性標(biāo)記的主要用來制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針。探針。（1）大腸桿菌）大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I 的性質(zhì)的性質(zhì)一條一條單鏈多肽單鏈多肽。 用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的端的部分。就成為部分。就成為Klenow fragment。 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ + 帶有帶有3OH游離端的引物游離端的引物 DNA模板模板-OH5 3 dNTPs標(biāo)記標(biāo)記能夠同某種被研究的核酸序列特異能夠同某種被

18、研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分子。子。已知序列的核酸片斷已知序列的核酸片斷顯示位置顯示位置與互補(bǔ)的待測序列雜交與互補(bǔ)的待測序列雜交標(biāo)記標(biāo)記已知序列的核酸片斷已知序列的核酸片斷標(biāo)記標(biāo)記已知序列的核酸片斷已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5 3 切口轉(zhuǎn)移法切口轉(zhuǎn)移法(nick translation )： 放射性同位素標(biāo)記：放射性同位素標(biāo)記：DNA聚合酶聚合酶I 同時(shí)具備同時(shí)具備53外切酶外切酶活活性和性和53的聚合酶的聚合酶活性（以及活性（以及35外外切酶活性）。切酶活性）。53外切酶活性從外切酶活性從D

19、NA切口的切口的下一段下一段DNA5端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會(huì)在切口端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會(huì)在切口的的上一段上一段DNA的的3一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。切口切口切口切口5 5 3 3 5 3 5 3 純化的純化的DNA片斷片斷DNase I 制制造單鏈切口造單鏈切口DNA Pol I 進(jìn)進(jìn)行切口轉(zhuǎn)移行切口轉(zhuǎn)移一種一種 -32P-dNTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標(biāo)記從頭至尾都被標(biāo)記8具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性。（性。（失去了失

20、去了53外切酶活性外切酶活性）。）。（1）Klenow fragment的性質(zhì)的性質(zhì)DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶 3端補(bǔ)平端補(bǔ)平5 5 klenow補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3隱蔽端隱蔽端。在在3隱蔽端隱蔽端加上放射性標(biāo)記的加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow3隱蔽末端的隱蔽末端的DNA片斷片斷Klenow fragment補(bǔ)平補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇根據(jù)末端的順序選擇一種一種 -32P-dNTPs末端標(biāo)記的末端標(biāo)記的DNA 限制性內(nèi)切酶切限制性內(nèi)切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CT

21、TAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I -32P-dATP -32P-dGTP25oC 1hmRNAcDNA第一鏈第一鏈逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈第二鏈klenow5 3 3 5 5 3 引物引物（1） T4 DNA聚合酶的性質(zhì)聚合酶的性質(zhì)從從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由中分離純化。由噬菌體基因噬菌體基因43編碼。編碼。有有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性（降解單鏈更快）。性（降解單鏈更快）。 來源來源 酶

22、活性酶活性當(dāng)沒有當(dāng)沒有dNTP時(shí)，時(shí)，T4DNA聚合酶行使聚合酶行使35外切酶功能，制造出外切酶功能，制造出3隱蔽端。隱蔽端。如果只有一種如果只有一種dNTP，則降解到該，則降解到該dNTP的位置。的位置。5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶聚合酶無無dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶有有dNTPs5 5 標(biāo)記末端（取代合成法）標(biāo)記末端（取代合成法）用用35外切酶活性作用于外切酶活性作用于所有末端形式所有末端形式的的3端端（平端、（平端、3隱蔽端、隱蔽端、5隱蔽端）制隱蔽端）制造出造出3隱蔽端。隱蔽端。 再利用它的再利用它的53聚合酶活性補(bǔ)平，并加聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記

23、的入放射性標(biāo)記的dNTP。 補(bǔ)平隱蔽末端補(bǔ)平隱蔽末端 DNA 3末端標(biāo)記末端標(biāo)記酶切中間酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記末端標(biāo)記加入某種加入某種32P-dNTP和和dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶 （35外切）外切）DNA酶切片斷酶切片斷T4 DNA聚合酶聚合酶 （53聚合）聚合）5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 內(nèi)切酶切內(nèi)切酶切無無dNTPs制作簡單、制作簡單、 高比放射性、高比放射性、 放射自顯影效果好。放射自顯影效果好。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：半衰期短（半衰期短（32P只有只有14.3天）、天）、 不易保存、不易保存、 對人體有害。對人體有

24、害。 要求在專門實(shí)驗(yàn)室操作。要求在專門實(shí)驗(yàn)室操作。i）生物素標(biāo)記：）生物素標(biāo)記：生物素（生物素（biotin），又稱維生素），又稱維生素H、輔酶、輔酶R可以與可以與dNTP?；Y(jié)合成為生物素酰化結(jié)合成為生物素-1,6-dUTP、生物素生物素-1,4-dATP、生物素、生物素-1,1-dUTP等。等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素連接酶（也可以被生物素連接酶（biotin ligase）催化與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。催化與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。純化的純化的DNA片斷片斷DNase I 制制造單鏈缺口造單鏈缺口DNA Pol I 進(jìn)行進(jìn)行缺口轉(zhuǎn)移缺口轉(zhuǎn)移生物素生物素-

25、dTTP和和dNTPs 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 生物素生物素-dTTP生物素生物素-dTTP生物素生物素連接臂連接臂光敏基因光敏基因探針序列探針序列探針序列探針序列生物素生物素連接臂連接臂光敏基因光敏基因+光照光照抗生物素蛋白（抗生物素蛋白（avidin）：）：鏈霉抗生物素蛋白（鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin）：）：是一種是一種雞雞卵清蛋白。卵清蛋白。細(xì)菌細(xì)菌中中avidin的類似物。的類似物。能與生物素特異結(jié)合的蛋白或抗體，常用：能與生物素特異結(jié)合的蛋白或抗體，常用：可以與可以與dNTP連接成地高辛連接成地高辛-dUTP等，參等，參入入DN

26、A合成過程。形成地高辛標(biāo)記的合成過程。形成地高辛標(biāo)記的DNA探針。探針。生物素和地高辛標(biāo)記的探針都有商品化生物素和地高辛標(biāo)記的探針都有商品化的試劑盒的試劑盒 (kit)。地高辛的結(jié)合物是地高辛的結(jié)合物是抗地高辛抗體抗地高辛抗體。常用的兩種酶：常用的兩種酶：辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRPO） 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP）催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中催化一些特殊的反應(yīng)，反應(yīng)的過程中發(fā)出發(fā)出熒光熒光（或生成（或生成有色的產(chǎn)物有色的產(chǎn)物）。）。酶的作用：酶的作用：生物素生物素探針序列探針序列待測基因

27、待測基因親和素親和素酶酶底物底物中間產(chǎn)物中間產(chǎn)物產(chǎn)物產(chǎn)物發(fā)光發(fā)光探針探針DNA用用生物素或地高辛生物素或地高辛標(biāo)記。標(biāo)記。親和素或地高辛抗體與親和素或地高辛抗體與酶酶偶聯(lián)。偶聯(lián)。酶酶催化一個(gè)催化一個(gè)發(fā)光或顯色反應(yīng)發(fā)光或顯色反應(yīng)。親和素或地高辛抗體親和素或地高辛抗體與與生物素或地高辛結(jié)合生物素或地高辛結(jié)合。核酸核酸探針探針雜交篩選雜交篩選法的缺點(diǎn)是：法的缺點(diǎn)是：只檢測是否有外源只檢測是否有外源DNA插入，而不論插入，而不論該該DNA是否表達(dá)出是否表達(dá)出產(chǎn)物。產(chǎn)物。（1）來源）來源從從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個(gè)亞基組成：出來的，由兩個(gè)亞基組成： T7

28、 T7基因基因5 5編碼的大亞基：編碼的大亞基：有有53聚合酶和聚合酶和35外切酶活性。外切酶活性。 大腸桿菌編碼的小亞基：大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。硫氧還蛋白。 增加大亞基對增加大亞基對模板的親和性模板的親和性。 持續(xù)合成能力強(qiáng)持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。互補(bǔ)鏈。 35外切酶活性高外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。單鏈和雙鏈都能降解。 不受不受DNADNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙 進(jìn)行末端標(biāo)記進(jìn)行末端標(biāo)記 以大分子量以大分子量DNA為模板的合成為模板的合成如如M13

29、 補(bǔ)平隱蔽末端補(bǔ)平隱蔽末端取代合成法標(biāo)記取代合成法標(biāo)記3末端。末端。與與T4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。合成合成補(bǔ)平補(bǔ)平3隱蔽末端；隱蔽末端； 水解水解修平修平3突出末端。突出末端。（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾聚合酶的化學(xué)修飾去除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚聚合能力和聚合速率提高了合能力和聚合速率提高了3倍。倍。（2）修飾后的）修飾后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 DNA測序測序雙脫氧法。雙脫氧法。 標(biāo)記標(biāo)記DNA 3隱蔽末端隱蔽末端 更有效地補(bǔ)平末端更有效地補(bǔ)平末端最普遍使用的是來源于最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒細(xì)胞瘤病毒（avian m

30、yeloblastosis virus, AMV）：）：依賴依賴RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RNA指指導(dǎo)的導(dǎo)的DNA聚合酶）。聚合酶）。（1）來源）來源RNA腫瘤病毒。腫瘤病毒。（2）AMV的性質(zhì)的性質(zhì)由由 和和 兩條多肽鏈組成。兩條多肽鏈組成。 鏈鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和有反轉(zhuǎn)錄活性和 RNaseH活性?；钚浴NaseH： 鏈經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。鏈經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。 以以53或或35方向特異地水解方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的雜交雙鏈中的RNA鏈鏈。RNaseHRNA DNARNA DNA 鏈鏈RNA-DNA雜交雙鏈中雜交雙鏈中53DNA外外切酶活性。切酶活

31、性。 合成合成cDNA以以oligo dT為引物（與為引物（與mRNA的的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA 合成合成DNA探針探針用隨機(jī)引物（用隨機(jī)引物（random primer）或）或oligo dT做引物。做引物。隨機(jī)引物：隨機(jī)引物：隨機(jī)順序形成的寡聚隨機(jī)順序形成的寡聚DNA片斷。片斷。（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合）（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合） RT-PCR用的模板用的模板克隆某個(gè)基因時(shí)，用其克隆某個(gè)基因時(shí)，用其mRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄出出cDNA第一鏈。第一鏈。一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1. 來源來

32、源小牛胸腺。小牛胸腺。2. 組成組成大小兩個(gè)亞基。大小兩個(gè)亞基。3. 特性特性（1） 53DNA聚合酶活性聚合酶活性（terminal transferase） 不需要模板不需要模板！ 需要需要3OH、二甲胂酸緩沖液。、二甲胂酸緩沖液。 底物可以是單鏈底物可以是單鏈DNA、 是是3OH突出的雙鏈突出的雙鏈DNA、 平末端平末端在在Co2+ +代替代替Mg2+ +下也可以。下也可以。 隨機(jī)添加的隨機(jī)添加的dNTPs。 如果只有一種如果只有一種dNTP，就添加上，就添加上同聚物同聚物。DNA 5 3 TTTdTTP ，末端轉(zhuǎn)移酶，末端轉(zhuǎn)移酶（1）同聚物加尾）同聚物加尾給給外源外源DNA片斷片斷和和

33、載體載體分子分別加上分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。連接。外源外源DNADNA載體載體DNADNA5 3 5 3 CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶便于回收克隆片斷。便于回收克隆片斷。AAGCTT TTCGAA5 5 Hind酶切酶切A TTCGAAGCTT AKlenow補(bǔ)平補(bǔ)平AAGCT TTCGAAGCTT TCGAAAAGCATTT TTCGA AGCTT TTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源外源DNAAAGCTTTT TTCGA AGCTT TTTTCGAAAAAAAAHind位點(diǎn)位點(diǎn)

34、Hind位點(diǎn)位點(diǎn)連接連接催化非放射性標(biāo)記物參入催化非放射性標(biāo)記物參入DNA片斷的片斷的3端。（生物素端。（生物素-11-dUTP等）等）1. 來源來源T4噬菌體的噬菌體的pseT基因編碼?；蚓幋a。 從從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2. 功能功能催化催化 磷酸從磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或或RNA的的5-OH端。端。不論不論5-OH端突出與否。端突出與否。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 P-OH5 3 HO-P5 ATPT4多核苷酸激酶多核苷酸激酶如果如果ATP的的 磷酸

35、帶有磷酸帶有32P標(biāo)記，就會(huì)被轉(zhuǎn)標(biāo)記，就會(huì)被轉(zhuǎn)移到移到DNA的的5端。端。但天然的但天然的DNA的的5端都是磷酸化的。端都是磷酸化的。DNA 5-OH端磷酸化、標(biāo)記端磷酸化、標(biāo)記DNA的的5端。端。5 3 HO-OH5 3 HO-OH3 32P-OH5 3 HO-32P5 ( -32P)ATP多核苷酸激酶多核苷酸激酶3 P-OH5 3 HO-P5 堿性磷酸酶堿性磷酸酶（1）正向反應(yīng)（）正向反應(yīng)（forward reaction）（2）交換反應(yīng)標(biāo)記法）交換反應(yīng)標(biāo)記法反應(yīng)混合物中具有超量反應(yīng)混合物中具有超量( -32P)ATP和和ADP時(shí)，多核苷酸激酶能催化時(shí)，多核苷酸激酶能催化( -32P)AT

36、P的的 -32P與與DNA5端的磷酸端的磷酸交換交換。3 P-OH5 3 HO-P5 3 32P-OH5 3 HO-32P5 ( -32P)ATP、ADP多核苷酸激酶多核苷酸激酶反應(yīng)效果不理想。反應(yīng)效果不理想。1. 堿性磷酸酶種類堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。從大腸桿菌中分離出來。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）細(xì)菌性堿性磷酸酶）細(xì)菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶）小牛腸堿性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。從小牛腸中純化出來。具有抗熱性。具有抗熱性。SDS中加熱中加熱6

37、8oC可完全失活。可完全失活。催化脫掉催化脫掉DNA（或（或RNA）5端的磷酸端的磷酸根。根。3 P-OH5 3 HO-P5 5 3 HO-OH5 3 HO-OH堿性磷酸酶堿性磷酸酶（1）防止線性化的載體份子自我連接）防止線性化的載體份子自我連接單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTT TTCGAAHind酶切酶切A-OH TTCGA-PP-AGCTT HO-A堿性磷酸酶堿性磷酸酶5 5 5 A-OH TTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH與與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。能自我連接。但同一酶切后

38、的但同一酶切后的外源外源DNA的的5端有端有P，能與脫磷酸的載體能與脫磷酸的載體OH連接。連接。A TTCGA AGCTT AAGCTTA ATTCGA 連接酶連接酶-OH與與-OH連不住連不住其中每條鏈上都有一個(gè)其中每條鏈上都有一個(gè)nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù)。菌后會(huì)被修復(fù)。3 P-AGCTTA-OH5 3 HO-ATTCGA-P5 外源外源DNA9是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化是一類從多核苷酸鏈的一頭開始催化降解降解核苷酸的酶。核苷酸的酶。一、單鏈一、單鏈DNA外切酶外切酶1. 大腸桿菌核酸外切酶大腸桿菌核酸外切酶I（exo I）53外切外切識(shí)別識(shí)別5-OH2. 大腸桿菌核酸外切酶大腸桿菌核酸外切酶（exo ）53、35外切外切識(shí)別識(shí)別3-OH、5-P1. 核酸外切酶核酸外切酶（exo exo ）35外切外切識(shí)別識(shí)別3-OH主要用途：主要用途：在在DNA雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域。雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域。5 5 5 5 exo 與與klenow配合進(jìn)行配合進(jìn)行3端標(biāo)記端標(biāo)記-OHHO-53外切。外切。主要用途：主要用途：使使DNA雙鏈變成單鏈（短）。雙鏈變成單鏈（短）。5 P-P 5 5 5 exo 成為測序模板。成為測序模板。識(shí)別識(shí)別5-P（但不能降解（但不能降解5-