病毒培養(yǎng)技術(shù)PPT課件

1、病毒增殖技術(shù)病毒增殖技術(shù) 動(dòng)物增殖病毒技術(shù)動(dòng)物增殖病毒技術(shù)禽胚增殖病毒技術(shù)禽胚增殖病毒技術(shù)細(xì)胞增殖病毒技術(shù)細(xì)胞增殖病毒技術(shù)一、動(dòng)物增殖病毒技術(shù)一、動(dòng)物增殖病毒技術(shù) 選擇動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)：選擇動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)：大動(dòng)物應(yīng)來源于非疫區(qū)，最好是未接種過相應(yīng)病毒疫苗、青壯年和健康(經(jīng)臨床檢查、檢疫)；對(duì)相應(yīng)病毒易感，并十分敏感；經(jīng)隔離飼養(yǎng)和觀察檢查證明健康；家兔、小鼠、大鼠等應(yīng)符合普通級(jí)或清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)；雞應(yīng)屬非免疫雞或SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；犬和貓應(yīng)品種明確，并符合普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)；體重、年齡要基本一致，個(gè)體差別不宜過大。 二、禽胚增殖病毒技術(shù)二、禽胚增殖病毒技術(shù)（一）禽胚的選擇（一）禽胚的選擇 SPF雞胚雞胚 據(jù)國

2、家標(biāo)準(zhǔn)，無據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，無22種特定病原體種特定病原體 非免疫雞胚非免疫雞胚 應(yīng)無特定病原的母源抗體，應(yīng)無特定病原的母源抗體， 普通雞胚普通雞胚 可能帶有雞的多種病原體，不適用于疫苗生產(chǎn)可能帶有雞的多種病原體，不適用于疫苗生產(chǎn) 異源性性疫苗：鴨胚和鴿胚異源性性疫苗：鴨胚和鴿胚（二）禽胚接種途徑與收獲（二）禽胚接種途徑與收獲 絨毛尿囊膜接種法 尿囊腔接種法 卵黃囊接種法 羊膜腔接種法 靜脈接種法 腦內(nèi)接種法雞胚絨毛尿囊膜接種法雞胚絨毛尿囊膜接種法 尿囊腔接尿囊腔接種法種法 尿囊液收獲方法尿囊液收獲方法 雞雞胚卵黃囊接種法胚卵黃囊接種法1種蛋質(zhì)量種蛋質(zhì)量病原微生物：垂直傳遞，如白血病、腦脊髓炎、腺病

3、毒、支原體及傳染性貧血因子等。母源抗體：抗生素：立克次氏體和鸚鵡熱衣原體 2孵化技術(shù)孵化技術(shù)溫度：3739.5。傳染性支氣管炎病毒37 濕度：雞胚5357，水禽胚比雞胚高510。通風(fēng)：氧氣，二氧化碳。 翻蛋：（三）影響禽胚增殖病毒的因素（三）影響禽胚增殖病毒的因素3接種技術(shù)接種技術(shù) 不同病毒的增殖有不同的接種途徑， 同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。接種日齡：雞胚1314日齡。鴨胚1516日齡，尿囊液含 量最高，平均約68ml，羊水約12ml。接種部位：不應(yīng)傷及胚體和血管，以免影響其發(fā)育嚴(yán)格防止禽胚污染 雞胚接種時(shí)嚴(yán)格無菌操作； 定期清掃消毒孵化室，保持室內(nèi)空氣新鮮； 種蛋入孵前先

4、用溫水清洗，消毒，涼干。三、細(xì)胞增殖病毒技術(shù)三、細(xì)胞增殖病毒技術(shù) 1細(xì)胞培養(yǎng)的概念細(xì)胞培養(yǎng)的概念 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指利用機(jī)械、酶或化學(xué)方法使動(dòng)物組織或傳代細(xì)胞分散成單個(gè)乃至24個(gè)細(xì)胞團(tuán)懸液進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞分類細(xì)胞分類：根據(jù)細(xì)胞染色體和繁殖特性 原代細(xì)胞(primary cell) 細(xì)胞株(cell strain) 傳代細(xì)胞（continued cell line） 細(xì)胞系(cell line)（1）原代細(xì)胞）原代細(xì)胞(primary cell) 指由新鮮組織經(jīng)剪碎和胰酶消化制備的細(xì)胞，如指由新鮮組織經(jīng)剪碎和胰酶消化制備的細(xì)胞，如CEF細(xì)胞。細(xì)胞。（2）細(xì)胞株）細(xì)胞株(cel

5、l strain) 又稱二倍體細(xì)胞又稱二倍體細(xì)胞 指自繼代培養(yǎng)的細(xì)胞中選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標(biāo)記的指自繼代培養(yǎng)的細(xì)胞中選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標(biāo)記的細(xì)胞。這類細(xì)胞且能保持原來的二倍染色體數(shù)目，能連續(xù)傳很細(xì)胞。這類細(xì)胞且能保持原來的二倍染色體數(shù)目，能連續(xù)傳很多代多代(50100代代)，但為有限生命；沒有腫瘤原。如，但為有限生命；沒有腫瘤原。如PKl5、BHK21和和Vero （3）傳代細(xì)胞（）傳代細(xì)胞（continued cell line） 細(xì)胞系細(xì)胞系(cell line) 能在體外無限傳代，應(yīng)用方便，其染色體數(shù)目及增殖特性均能在體外無限傳代，應(yīng)用方便，其染色體數(shù)目及增殖特性均類似于惡

6、性腫瘤細(xì)胞，且多來源于癌細(xì)胞，如類似于惡性腫瘤細(xì)胞，且多來源于癌細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞系細(xì)胞系 靜置培養(yǎng)靜置培養(yǎng) 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)(suspension cell culture ) 微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)(microcarrier cell culture) 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)(hollow fibre cell culture) 微囊化細(xì)胞培養(yǎng)微囊化細(xì)胞培養(yǎng)2細(xì)胞培養(yǎng)方法細(xì)胞培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng) 通過振蕩或轉(zhuǎn)動(dòng)裝置使細(xì)胞始終處于分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的培養(yǎng)方法，主要用于一些在振蕩或攪拌下能生長繁殖的細(xì)胞，如生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)微載體直

7、徑應(yīng)為60105nm，無毒性，透明，顆粒密度與培養(yǎng)液密度相近似，略重于液體，低速攪拌即能懸浮，不吸收培養(yǎng)液和化學(xué)反應(yīng)，表面光滑、硬度小、有彈性，易于細(xì)胞吸附在表面，如DEAESephadexA-50、Cytodexl、Cytodex2、Cytodex3等。微載體培養(yǎng)的容器為特制的生物反應(yīng)器，有自動(dòng)化裝置。細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)106107個(gè)/m1，每升培養(yǎng)液可加微載體25g，每克有80009000個(gè)珠子，培養(yǎng)面積約為25萬cm2，比常規(guī)培養(yǎng)面積大1025倍。 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)(hollow fibre cell culture) 組成組成:中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動(dòng)泵中空

8、纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動(dòng)泵中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯丙烯復(fù)合物或多聚碳酸硅中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯丙烯復(fù)合物或多聚碳酸硅等材料制成，外徑等材料制成，外徑50100m，壁厚，壁厚2575m，壁呈海綿狀，壁呈海綿狀，上面有很多微孔。上面有很多微孔。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，允許營養(yǎng)物質(zhì)中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對(duì)細(xì)胞和大分子物質(zhì)（如單克隆抗體）有和代謝廢物出入，而對(duì)細(xì)胞和大分子物質(zhì)（如單克隆抗體）有滯留作用。滯留作用。培養(yǎng)液能有效地分布，細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間可達(dá)數(shù)月，保持高培養(yǎng)液能有效地分布，細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間可達(dá)數(shù)月，保持

9、高度活性，培養(yǎng)的細(xì)胞密度大，細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)濃度高，純度度活性，培養(yǎng)的細(xì)胞密度大，細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)濃度高，純度可達(dá)可達(dá)6090；占用空間小，適于各類細(xì)胞，但設(shè)備昂貴。；占用空間小，適于各類細(xì)胞，但設(shè)備昂貴。 培養(yǎng)液培養(yǎng)液血清血清細(xì)胞接種量細(xì)胞接種量pH溫度溫度無菌條件無菌條件培養(yǎng)器皿清潔度培養(yǎng)器皿清潔度3. 細(xì)胞培養(yǎng)要素細(xì)胞培養(yǎng)要素RPMI-1640、199、DMEM、F12 血清血清成分：必需氨基酸、促進(jìn)細(xì)胞生長和貼壁的成分。成分：必需氨基酸、促進(jìn)細(xì)胞生長和貼壁的成分。-珠蛋珠蛋白和白蛋白能促進(jìn)細(xì)胞生長；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、白和白蛋白能促進(jìn)細(xì)胞生長；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、a2-球蛋

10、白和球蛋白和脂蛋白脂蛋白G2能促進(jìn)細(xì)胞貼壁。能促進(jìn)細(xì)胞貼壁。血清選擇：同種動(dòng)物優(yōu)于異種動(dòng)物血清；人和牛血清優(yōu)于血清選擇：同種動(dòng)物優(yōu)于異種動(dòng)物血清；人和牛血清優(yōu)于馬血清；馬血清優(yōu)于兔血清和雞血清。馬血清；馬血清優(yōu)于兔血清和雞血清。血清使用：目前國內(nèi)多用犢牛血清，使用前須經(jīng)血清使用：目前國內(nèi)多用犢牛血清，使用前須經(jīng)56滅活滅活30min，并進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。生長液血清含量一般為，并進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。生長液血清含量一般為520。維持液中血清量為。維持液中血清量為0%5。血清替代因子：激素和生長因子（如胰島素、上皮生長因血清替代因子：激素和生長因子（如胰島素、上皮生長因子）、結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）、貼

11、壁因子（如魚精蛋白、子）、結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白）、貼壁因子（如魚精蛋白、聚賴氨酸）和微量元素（如硒）四類幾十種，多數(shù)無血清聚賴氨酸）和微量元素（如硒）四類幾十種，多數(shù)無血清培養(yǎng)液須補(bǔ)加培養(yǎng)液須補(bǔ)加38種血清替代因子。種血清替代因子。細(xì)胞接種量細(xì)胞接種量 細(xì)胞在生長過程中分泌刺激細(xì)胞分裂的物質(zhì)，若細(xì)胞量太少，細(xì)胞在生長過程中分泌刺激細(xì)胞分裂的物質(zhì)，若細(xì)胞量太少，這些物質(zhì)分泌量少，而作用也小。這些物質(zhì)分泌量少，而作用也小。接種細(xì)胞數(shù)量越大，細(xì)胞生長為單層的速度越快，但細(xì)胞過多接種細(xì)胞數(shù)量越大，細(xì)胞生長為單層的速度越快，但細(xì)胞過多對(duì)細(xì)胞生長也不利。對(duì)細(xì)胞生長也不利。雞胚成纖維細(xì)胞為雞胚成纖維細(xì)胞為1

12、00萬萬m1小鼠或地鼠腎細(xì)胞為小鼠或地鼠腎細(xì)胞為50萬萬m1猴腎細(xì)胞量為猴腎細(xì)胞量為30萬萬ml傳代細(xì)胞為傳代細(xì)胞為1030萬萬m1(1) 細(xì)菌污染細(xì)菌污染(2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。真菌污染：念珠菌或酵母菌。 培養(yǎng)液中可見黃白色小點(diǎn)狀懸浮物培養(yǎng)液中可見黃白色小點(diǎn)狀懸浮物 鏡檢時(shí)可見菌絲結(jié)構(gòu)。鏡檢時(shí)可見菌絲結(jié)構(gòu)。 (3) 支原體污染：污染率為支原體污染：污染率為5060(4) 病毒污染病毒污染 組織帶毒組織帶毒 培養(yǎng)液帶毒培養(yǎng)液帶毒4細(xì)胞培養(yǎng)污染問題細(xì)胞培養(yǎng)污染問題（1）血清）血清 ：維持液內(nèi)犢牛血清含量一般不超過：維持液內(nèi)犢牛血清含量一般不超過2。（2）溫度：）溫度：狂犬病病毒狂犬病病

13、毒32，犬皰疹病毒，犬皰疹病毒36。（3）pH：（4）病毒接種劑量：）病毒接種劑量：應(yīng)以應(yīng)以TCID50為依據(jù)為依據(jù) 一般按維持液的一般按維持液的110(VV)量接入。量接入。 接種量小，細(xì)胞不能完全發(fā)生感染，會(huì)影響毒價(jià)；接種量小，細(xì)胞不能完全發(fā)生感染，會(huì)影響毒價(jià)； 接種量過大，會(huì)產(chǎn)生大量無感染性缺陷病毒。接種量過大，會(huì)產(chǎn)生大量無感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接種方法：病毒接種方法：異步接毒和同步接毒。異步接毒和同步接毒。5. 細(xì)胞培養(yǎng)病毒要素細(xì)胞培養(yǎng)病毒要素6. 病毒增殖指標(biāo)與收獲病毒增殖指標(biāo)與收獲細(xì)胞病變細(xì)胞病變(CPE)：細(xì)胞圓縮，如痘病毒和呼腸孤病毒等；細(xì)胞聚合，如腺病毒；細(xì)胞融合形成合胞體，如副粘病毒和皰疹病毒；輕微病變，