基因工程復習

1、基因工程名詞解釋：第一章 基因工程概論1、基因工程：是利用DNA體外重組或PCR擴增技術(shù)從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，經(jīng)連接反應形成重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當?shù)氖荏w細胞（轉(zhuǎn)化），以期獲得基因表達的過程。第二章 分子克隆工具酶 1、限制性內(nèi)切酶：指一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。2、粘性末端：粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)。3、同尾酶：許多不同的限制酶切割 DNA 產(chǎn)生的末端是相同的，且是對稱的，即它們可產(chǎn)生相同的粘性突

2、出末端。4、星號活性：非特異性切割在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。5、DNA連接酶：可使一段DNA的3羥基末端和5磷酸末端形成3，5- 磷酸二酯鍵，把兩個DNA片段連在一起，封閉DNA雙鏈上形成的切口的酶。6、Klenow DNA 聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)蛋白酶裂解而從全酶中除去具53外切酶活性的肽段，也稱Klenow 片段。它具有53的DNA聚合酶活性，和很弱的35的外切核酸酶活性。第三章 分子克隆載體1、載體：將外源DNA或基因攜帶入宿主細胞并能自我復制的工具稱為載體2、質(zhì)粒：質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)攜帶的染色體外的能獨立進行復制的環(huán)狀DN

3、A分子3、噬菌粒：帶有絲狀噬菌體大間隔區(qū)的質(zhì)粒載體，是集質(zhì)粒和絲狀噬菌體的有利特征于一體的載體，具有ColE1復制起點及抗生素抗性選擇標記，以及絲狀噬菌體的間隔區(qū)4、科斯質(zhì)粒（柯斯質(zhì)粒，cosmid, cos sitecarring plasmid)：人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列（含兩側(cè)與包裝有關(guān)的序列）的質(zhì)粒載體第四章 人工染色體載體1、人工染色體載體：利用染色體的復制元件來驅(qū)動外源DNA片段復制的載體。2、酵母人工染色體載體：就是模擬酵母菌染色體的復制而構(gòu)建的載體，是第一個可保持為線性分子的載體，從而模擬了染色體。這樣的載體稱為酵母人工染色體 。當裝載外源DNA片段后，在酵母菌中可像酵

4、母的染色體一樣復制，從而達到克隆大片段DNA的目的。 3、BAC載體：細菌人工染色體是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高容量低拷貝質(zhì)粒載體。第五章 表達載體1、表達載體（Expression vectors）：就是在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件（如啟動子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達的載體。（是用于表達原核或真核細胞中某個特定基因所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的載體，其克隆位點的上游含有強啟動子、下游含有轉(zhuǎn)錄終止序列，適用于表達某特定蛋白質(zhì)。）2、融合蛋白：即編碼原核多肽DNA序列與編碼真核多肽cDNA（目的片段）融合成一體后表達出來的一種蛋白。N端由原核DNA序列編碼，C端由真核基因完整序列

5、cDNA編碼。 3、穿梭載體（Shuttle vector）：是能夠在兩類不同宿主中復制、增殖和選擇的載體。如有些載體既能在原核細胞中復制又能在真核細胞中復制，或能在 E.coli 中復制又能在革蘭氏陽性細菌中復制。這類載體主要是質(zhì)粒載體。第六章 基因工程中大分子的分離與檢測1、分子雜交：有一定同源性的兩條核酸單鏈，在適宜的溫度和離子濃度等條件下，通過堿基互補退火形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過程 。是在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用于檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質(zhì)分子是否存在，以及其分子量大小。2、印跡（bloting）：將DNA、RNA或蛋白質(zhì)固定到固體支持物上的過程。根據(jù)其固定物分為

6、 Southern bloting (DNA)、Northern bloting (RNA)和 Western bloting (蛋白質(zhì))。Southern bloting即目標 DNA 經(jīng)過限制性酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳以后，堿性條件下變性處理，并保持DNA為單鏈，然后通過毛細管滲吸或電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移的方式，將凝膠上的 DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對象為DNA，探針為DNA或RNA。Northern blotting是指DNA-RNA分子雜交，應用特異性基因探針分析基因的轉(zhuǎn)錄水平，檢測RNA（主要是mRNA）的方法。主要用來檢測細胞或組織樣品中是否存在與探針同

7、源的 mRNA 分子，從而判斷在轉(zhuǎn)錄水平上某基因是否表達，在有合適對照的情況下，通過雜交信號的強弱可比較基因表達的強弱。Western blotting將蛋白質(zhì)樣品從 SDS-PAGE 凝膠通過電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移到濾膜的方法3、原位雜交：就是將細菌菌落影印到濾膜上，或?qū)⒕N點種在濾膜上然后再生長出可見的菌落，對濾膜上的菌體進行原位裂解使 DNA 釋放出來，并使之固定在濾膜上。然后通過分子雜交，判斷哪個或哪些菌落含有與探針同源的 DNA 。4、探針（probe）：核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。5、轉(zhuǎn)化：一生物品系吸收了

8、來自另一生物品系的DNA并得到其遺傳性狀的現(xiàn)象。第七章 PCR技術(shù)原理1、聚合酶鏈式反應：又稱體外DNA擴增技術(shù)。是利用耐熱DNA聚合酶的反復作用，通過變性-退火-延伸循環(huán)操作，在體外特異地擴增所需要的DNA片段的一種技術(shù)。 第八章 DNA序列分析1引物步移：引物依次推進法是從目的片段的一端開始，利用載體上的序列為依據(jù)，設計第一次反應的反應引物進行測序，然后依次根據(jù)前一次測序結(jié)果設計下一次反應引物，遞進測序，直至完成。第九章 文庫的構(gòu)建1、 基因文庫：某個生物的基因組 DNA 或 cDNA 片段與適當?shù)妮d體在體外通過重組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體）

9、，所有菌落或噬菌體的集合。2、基因組 DNA 文庫：指將某生物體的全部基因組 DNA 用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的 DNA 片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應的宿主細胞獲得的所有陽性菌落。3、cDNA文庫：以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當?shù)妮d體常用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。4、表型篩選法：根據(jù)目的基因編碼比較特殊的功能，并且其與載體作用可以在宿主菌（如大腸桿菌）中表達該基因，表現(xiàn)出其特殊的功能所決定的表型性狀來，這樣就

10、很容易通過導入的基因帶來新的功能或恢復其缺失的功能來確定目的基因。5、雜交篩選：當把基因文庫轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜之后，就可以同特異性的核酸探針進行菌落或噬菌班雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆。這個過程叫做克隆基因的分離或篩選。應用核酸探針分離目的基因的方法叫做核酸雜交篩選法。6、免疫篩選：免疫篩選法和核酸雜交的方法類似，只是其使用的探針非核酸，而是特異性的抗體；或用放射性同位素標記、帶有特定蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA片段作探針篩選cDNA表達文庫，從中鑒定出能夠表達出與它發(fā)生特異性結(jié)合的目標蛋白質(zhì)的陽性克隆。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先要在宿主細胞中存在抗原蛋白的表達，用于篩選的

11、 DNA 文庫必須是表達文庫。第十章 DNA誘變1、體外隨機誘變： 指隨機地在克隆化DNA中引入堿基置換突變。2、DNA體外重組技術(shù) 主要是指依賴序列同源性的DNA體外重組，包括經(jīng)典的DNA洗牌法（DNA shuffling)以及在此基礎上發(fā)展出來的交錯延伸(staggered extension process，StEP)、隨機引發(fā)重組（random-priming recombination，RPR)等技術(shù)。3、嵌套缺失 逐步從感興趣的DNA的一端或兩端刪除多個寡核苷酸，得到一套終末端長短不同的嵌套缺失突變體，這個突變體群體也稱漸次截短文庫（incremental truncation l

12、ibrary,ITL）第十一章 基因操作中的核酸分析技術(shù)1、RNA干擾：RNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。簡答題：第一章 基因工程概論1、基因工程的基本程序獲得外源DNA片段; 外源DNA片段與載體連接; 重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細胞；重組細胞擴增;重組子的篩選與鑒定;目的基因的確認與分析第二章 分子克隆工具酶1、什么是細菌的限制與修飾系統(tǒng)？限制：細菌為防御外來DNA入侵而將其降解的現(xiàn)象。（一般由限制酶來降解外源DNA)修飾：細菌為防止自身DNA被降解而修飾自身DNA。 (一般

13、由甲基化酶進行修飾） 限制與修飾往往成對存在，它們的識別序列往往相同。2、限制酶命名法的原則限制酶來源菌，第一個字母屬名，（從分離的菌株屬名取第一個字母,大寫）；種名前兩個字母（從分離的菌株種名取前兩個字母,小寫）；菌株代號或生物型號；不同限制酶：如第三個限制酶（序號 羅馬字）比如 HindIII 組法： 3、第二型限制酶的特點底物專一性：其底物只能是雙鏈DNA分子，對單鏈RNA及雙鏈DNA-RNA雜交分子均不起作用；位點專一性：它的識別位點為4-8核苷酸序列，甲基化位點就是識別位點，識別位點也切割部位，產(chǎn)生特異性的片段；位點上核苷酸順序通常呈雙重螺旋結(jié)構(gòu)。4、大腸桿菌 DNA 聚合酶 發(fā)揮生

14、物學活性的條件（1）DNA模板（可以是單鏈或雙鏈）（2）帶有3-端游離羥基的引物鏈（3）底物和激活劑注：對雙鏈DNA，當有dNTP存在時， 35降解活性會被53方向的聚合活性所抑制。第三章 分子克隆載體1、載體的特征自主復制，具備復制原點必須具備合適的酶切位點供外源DNA片段插入，同時不影響其復制有一定的選擇標記，用于篩選有較高的拷貝數(shù)，便于載體的制備可容納較大的外源基因片段；具有對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性；具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移2、質(zhì)粒的三大基本特征質(zhì)粒的自主復制性：質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制。質(zhì)粒的不相容性：任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞

15、中。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^稱為細菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。3、質(zhì)粒分子三種存在形式共價閉合超螺旋形式：（covalently closed circular，簡寫cccDNA）（SC）開放環(huán)結(jié)構(gòu)：一條保持著完整的環(huán)結(jié)構(gòu)，另一條有一個或數(shù)個切刻。（OC)線性結(jié)構(gòu)：質(zhì)粒在限制性酶作用下，雙鏈斷裂，形成線性，又叫L型。4、幾種標記基因的篩選原理標記基因按用途可分為兩類：選擇標記基因和篩選標記基因。選擇標記基因用于鑒別目標 DNA （載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來；篩選標記基因用于鑒別重組子和非重組子。也可用于將特殊表型的重組子挑選出來選擇標記基因氨芐青霉素抗性基

16、因（Ampicillin resistance gene,ampr） 氨芐青霉素（Ampicillin）是殺菌劑，可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的活性，干擾細胞分裂，殺死細胞。 Ampr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質(zhì)的酶，能催化內(nèi)酰胺環(huán)的水解，使氨芐青霉素失活。四環(huán)素抗性基因（tetracycline resistance gene, tetr） 四環(huán)素是抑菌劑，可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。抑制細胞蛋白質(zhì)合成，細胞停止生長。 四環(huán)素抗性基因編碼一種399個氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，與細菌細胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進入細菌細胞。氯霉素抗性基因（c

17、hloramphenicol resistance gene , Cmr） 氯霉素是抑菌劑，可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。 Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；?，導致乙酰化的氯霉素不能結(jié)合在核糖體上。 篩選標記基因-互補（藍白斑試驗，又稱IPTG-Xgal試驗）：pUC質(zhì)粒系列含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和復制起始點。去除了pBR322的tetr區(qū)段，換用了M13噬菌體的476bp片段，含LacZ基因及其啟動子的操縱基因、M13的多聚接頭polylinker。自然狀態(tài)下，LacZ基因編碼的半乳糖苷酶可以分解乳糖，以IPTG為誘導劑代替乳糖，X-gal

18、為顯色劑，質(zhì)粒載體上存在的LacZ基因片段當被外源DNA片段插入時，會產(chǎn)生白色的克隆，不含插入片段的質(zhì)粒進入宿主細胞生成藍色菌落。插入失活：pBR322 質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標記。當外源 DNA 片段插入四環(huán)素抗性基因tetr基因后，導致 tetr基因失活，變成只對氨芐青霉素ampr有抗性。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。5、噬菌體克隆外源目的基因步驟通過裂解過程增殖載體，回收、純化載體載體與外源DNA的酶切載體與外源DNA連接重組噬菌體的體外包裝包裝噬菌體的感染infect篩選6、M13噬菌體載體優(yōu)缺點

19、優(yōu)點：復制以雙鏈DNA(RF DNA）為媒介，如同質(zhì)粒，易于純化和操作。RF DNA和ss DNA均能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，形成侵染的菌落或產(chǎn)生噬菌斑?？煞奖愕孬@得單鏈DNA(正鏈DNA)。無包裝限制問題，曾成功包裝了長度為M13 DNA6倍的DNA分子。具有多克隆位點成對構(gòu)建，是有效顆粒雙鏈中的任何一條鏈。缺點：外源DNA不穩(wěn)定，在液體培養(yǎng)過程中，尤其易產(chǎn)生缺失，液體培養(yǎng)液不易作再次培養(yǎng)的種子液。缺失突變體具選擇優(yōu)勢，經(jīng)幾次連續(xù)傳代后,原始重組體可能喪失殆盡。外源DNA往往是單向插入，另一方向的插入可能干擾了基因間隔區(qū)的功能，強制插入將導致外源DNA重組或缺失，不可取。第四章 人工染色體載體1

20、、YAC的構(gòu)建應含有的元件酵母染色體的端粒序列酵母染色體的復制子 酵母染色體的中心粒序列酵母系統(tǒng)的選擇標記 大腸桿菌的復制子 大腸桿菌的選擇標記裝載量：350-400kb2、 YAC載體的工作原理（YAC 載體主要是用來構(gòu)建大片段 DNA 文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。）當用 BamH切割成線狀后，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體復制的必要順式元件，如自主復制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。這些元件在酵母菌中可以驅(qū)動染色體的復制和分配，從而決定這個微型染色體可以攜帶酵母染色體大小的 DNA 片段。對于 BamH切割后形成的微型酵母染色體，當用 EcoR

21、或 Sma 切割抑制基因 sup4 內(nèi)部的位點后形成染色體的兩條臂。與外源大片段 DNA 在該切點相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進入到酵母菌后可象染色體一樣復制，并隨細胞分裂分配到子細胞中去，達到克隆大片段DNA 的目的。第五章 表達載體1、大腸桿菌表達載體應有的結(jié)構(gòu)成分大腸桿菌表達載體都是質(zhì)粒載體。作為表達載體首先必須滿足克隆載體的基本要求，即能將外源基因運載到大腸桿菌細胞中。在基本骨架的基礎上增加表達元件，就構(gòu)成了表達載體。各種表達載體的不同之處在于其表達元件的差異。表達系統(tǒng)元件：(1)啟動子：大腸桿菌表達載體中常用的啟動子：trp-lac啟動子（又稱tac啟動子）；噬菌體PL

22、啟動子。(2)核糖體結(jié)合位點(RBS)：RBS由SD序列、核糖體識別序列和起始密碼（ATG）組成。但有時也將SD序列稱為核糖體結(jié)合位點。(3)轉(zhuǎn)錄終止序列：一般由一段GC富集區(qū)組成的反向重復序列，具有回紋結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的對應區(qū)可行成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)。2、GST融合表達蛋白純化原理GST表達載體在啟動子tac和多克隆位點之間加入了兩個與分離純化有關(guān)的編碼序列，其一是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位點的編碼序列。當外源基因插入到多克隆位點后，可表達出由三部分序列組成的融合蛋白。GST是來源于血吸蟲的小分子酶（26kDa），在E.coli易表達，在融合蛋白狀態(tài)下保持酶學活性

23、，對谷胱甘肽有很強的結(jié)合能力。將谷胱甘肽固定在瓊脂糖樹脂上形成親和層析柱，當表達融合蛋白的全細胞提取物通過層析柱時，融合蛋白將吸附在樹脂內(nèi)，其它細胞蛋白就被洗脫出來。然后再用含游離的還原型谷胱甘肽的緩沖液洗脫，可將融合蛋白釋放出來。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可獲得純化的目標蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位點外，其它還有 Xa 因子（Factor Xa）和腸激酶。3、融合蛋白表達的優(yōu)點偽裝不易降解，其中真核蛋白由原核多肽偽裝，不易被細菌蛋白酶降解，穩(wěn)定；大多數(shù)以可溶性形式存在，不需切割就有生物活性；易酶切分離，如腸激酶或設計酶切位點切掉原核多肽，即可釋放出有活性的真核蛋白；易分離純化，如用原核多

24、肽/或融合蛋白免疫家兔產(chǎn)生相應單抗親和，純化實驗操作簡單；產(chǎn)生分泌性蛋白，若E.coli結(jié)構(gòu)基因是一段信號肽，可產(chǎn)生分泌性產(chǎn)物。4、大腸桿菌表達體系的優(yōu)缺點 特征：穩(wěn)定的遺傳和復制能力,在無選擇壓力下保存于E.coli細胞內(nèi)；具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標記；promotor是可以調(diào)控的，抑制時本底轉(zhuǎn)錄水平低；轉(zhuǎn)錄的mRNA能在合適位置終止,轉(zhuǎn)錄過程不影響表達載體復制；具備有適用外源基因插入的MCS。優(yōu)點：積累了充足經(jīng)驗，有數(shù)不清的載體可供應用； 可因不同載體而選擇不同菌種作宿主；操作安全，致病能力低；成本相對低得多；真核生物的基因先在原核體系上構(gòu)建克隆，稱為亞克隆（subclone），然后采用其它方式

25、轉(zhuǎn)移至真核細胞上表達。缺點：原核生物載體構(gòu)建的重組體是無法進入動物細胞進行表達；沒有加工所需的酶系統(tǒng)；熱源、內(nèi)毒素不易除去；常會形成包涵體。第六章 基因工程中大分子的分離與檢測1、核酸分離提取的原則保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性排除其它分子的污染 核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； 將其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染降到最低； 排除其它核酸分子的污染。 2、變性法提取質(zhì)粒DNA的原理在變性條件（堿性或高溫)下，線狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開，而cccDNA (共價閉合環(huán)狀超螺旋DNA）雖然互補鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。當變性

26、條件恢復時，質(zhì)粒DNA迅速復性恢復天然構(gòu)型，染色體DNA難以復性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)和RNA纏繞在一起，通過離心沉淀下來，而質(zhì)粒DNA存在于上清液中。3、核酸電泳的基本原理核酸分子中的磷酸基團帶負電荷，在電場中將向正極移動，通過凝膠的分子篩作用可以將不同大小和構(gòu)型的核酸分子分離，分子量小的DNA，具有較緊密的構(gòu)型，在凝膠中移動快；反之，分子量大的DNA移動慢。 4、毛細管虹吸印跡法利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜

27、向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上。5、CaCl2轉(zhuǎn)化法原理（這個答案在ppt上沒找到，因此答案在網(wǎng)上找的，僅供參考）將快速生長的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹，同時Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導細胞成為感受態(tài)細胞。第七章 PCR技術(shù)原理1、PCR的基本步驟（1）高溫變性： 95左右35分鐘使雙鏈DNA變性形成單鏈DNA。（2）引物與模板結(jié)合（低溫退火）：降低溫度以后，引物在單鏈DNA與之互補的部位結(jié)合。溫度是 PCR 擴增是否

28、順利的關(guān)鍵因素，退火通常在 50-60 之間，具體的溫度主要由引物的 Tm 值決定。（3）新鏈形成：在DNA聚合酶（常用Taq酶）的最適溫度（Taq酶為72）下，以dNTP為原料，根據(jù)堿基互補的原則，按照模板DNA的序列組成，從引物的 3開始，逐一將dNTP聚合上去，合成一條新的DNA雙鏈（適溫延伸） 。延伸時間由擴增片段長度決定。2、PCR反應的特點1.靈敏度高：（1）皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平。（2）能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞（3）病毒檢測的靈敏度可達3個RFU（空斑形成單位） （4）細菌檢測的最小檢出率為3個細菌 2. 簡便、快速：（1）一次性加

29、好反應液，24 h即可完成擴增；（2）擴增產(chǎn)物一般用電泳分析 。3. 對標本的純度要求低：血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA均可 。4. 高度的特異性： PCR擴增的特異性由兩個引物的序列決定，具有高度的特異性。第八章 DNA序列分析1、Sanger氏酶學法的基本原理當脫氧核糖3位置羥基缺失的雙脫氧核苷酸分子與其他正常核苷酸混合在同一個擴增反應體系中時，在DNA多聚酶的作用下雖然它也能夠象正常核苷酸一樣以其5位置的磷酸基與上位脫氧核苷酸的3位置的羥基結(jié)合，但是由于它自身3位置羥基的缺失，至使下位核苷酸的5磷酸基無法與之結(jié)合。2、Maxam-Gilbert 化學降解法的基

30、本原理將一個 DNA 片段的 5 端磷酸基作放射性標記，再分別采用不同的化學方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長度不一而 5 端被標記的 DNA 片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿基序列。第九章 文庫的構(gòu)建1、一個理想的基因文庫應具備的條件一個理想的基因文庫應具備下列條件： 1、盡可能高的完備性 2、重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力 3、載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆4、克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域， 以利克隆排序 5、克隆片段易于從載體分子上完整卸下6、重組克隆能穩(wěn)

31、定保存、擴增、篩選 2、基因組文庫與cDNA文庫的比較（1）基因組文庫優(yōu)點：基因組文庫可以含有基因組的編碼序列和間隔序列，用于研究基因編碼序列和編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能?；蚪M文庫可以含有所有的基因組DNA序列，受細胞來源和發(fā)育影響較小。缺點：基因組文庫篩選工作量大；有時假陽性雜交信號沒有意義。（2）cDNA文庫主要優(yōu)點cDNA文庫以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。cDNA文庫的篩選比較簡單易行。每一個cDNA文庫都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率就會比較低，因此陽性雜交信號一般都是有意義的，由此選擇出來的陽性克

32、隆將會含有目的基因。cDNA文庫可用于在細菌中能進行表達的基因的克隆，直接應用于基因工程操作。cDNA克隆還可用于真核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。主要的缺點1、cDNA文庫所包含的遺傳信息要遠遠少于基因組DNA文庫，并且受細胞來源或發(fā)育時期的影響。2、cDNA文庫雖能反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)和功能信息，但不能直接獲得基因內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面信息。3、在cDNA文庫中，相應于高豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來比較容易，而相應于低豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。 第十章 DNA誘變1、DNA 洗牌法的優(yōu)點可在短

33、時間內(nèi)通過重組有效的突變體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進化速度；而且對可操作的靶序列沒有任何要求，長度可達幾十kb;通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導致功能的明顯提高；從表型上早期進行選擇，而不必了解DNA片段上序列的信息，簡化了操作程序；比隨機突變顯著提高了良性突變的概率。2、寡核苷酸介導定點誘變的基本流程首先,化學合成能與野生型DNA模板的靶區(qū)退火、并攜帶所需突變的寡核苷酸,作為體外合成DNA的引物。其次,由DNA聚合酶根據(jù)模板序列延伸寡核苷酸,產(chǎn)生含有預定突變的雙鏈DNA。最后,對突變體DNA測序,驗證靶點的突變,并確保其他區(qū)域沒有發(fā)生額外的突變。3、誘變寡核

34、苷酸的設計原則1.與靶DNA的適當鏈互補，并注意與模板的其他區(qū)域不能錯誤雜交。2.錯配堿基位于中央位置， 1-2個核苷酸突變時，使每側(cè)有10-15個堿基與模板鏈完全匹配。有效引入多于3個核苷酸突變時，要求引物在誘變點的每側(cè)有30個核苷酸互補于模板。3.足夠的長度與靶序列特異地結(jié)合。1 2個堿基改變的引物要求至少25個堿基長度。4.含有與模板完全雜交的5端區(qū)，這樣從上游引物起始的DNA合成不至于取代誘變寡核苷酸引物。DNA聚合酶的5 3，外切核酸酶活性是造成上游DNA合成取代5核苷酸的原因。5.誘變寡核苷酸引物3，區(qū)域有10-15個堿基與模板鏈完全匹配，形成足夠穩(wěn)定的雜交分子，以有效地從誘變寡核

35、苷酸引物3端引發(fā)DNA的合成。6.無回文，如果有重復或自身互補序列，這樣的序列會形成二級結(jié)構(gòu)，具有穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的誘變寡核苷酸與模板上靶序列的雜交率降低，可能導致得不到突變體。7.必要時可在誘變寡核苷酸上加入新的酶切位點，或消除靠近誘變點的已有酶切位點，便于誘變后通過限制性酶消化篩選候選突變子。4、PCR介導的定點誘變的優(yōu)缺點優(yōu)點1.突變體的回收率高。一些改進的方案可使得回收率達到近100。2.快速簡便，能用雙鏈DNA為模板，不需制備單鏈模板，因而不需將目的DNA亞克隆到單鏈噬菌體載體上。3.高溫度的利用，可降低模板DNA形成二級結(jié)構(gòu)的幾率。4.所有的反應可以在同一只試管中進行.缺點1.PCR擴

36、增DNA時會產(chǎn)生一定程度的堿基錯配2.在擴增DNA的3末端加上非預設堿基3.對每套引物和模板,PCR反應的條件都需要優(yōu)化4.標準PCR不能有效擴增大于3kb的DNA片段第十一章 基因操作中的核酸分析技術(shù)1、凝膠阻滯實驗原理：是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，是當前被選作鑒定特定DNA或RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實驗方法。 原理：DNA/RNA分子與蛋白的結(jié)合導致了電泳時遷移率的降低。 實驗步驟：1、首先制備細胞蛋白質(zhì)提取物（理論上其中含有某種特殊的轉(zhuǎn)錄因子）2、用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位

37、點）3、這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質(zhì)提取物一起進行溫育，于是產(chǎn)生DNA-蛋白質(zhì)復合物4、在控制使DNA-蛋白質(zhì)保持結(jié)合狀態(tài)的條件下，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳5、最后進行放射自顯影，分析電泳結(jié)果凝膠阻滯實驗的作用：1 . 鑒定在特殊類型細胞的提取物中，是否存在與某一特定DNA片斷結(jié)合的蛋白質(zhì)分子 2. 研究發(fā)生此中結(jié)合之精確的DNA序列的特異性。（加入超量的非標記競爭DNA）3.可以間接的闡明體內(nèi)發(fā)生DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 (1). 用具有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的競爭DNA，可檢測蛋白是否屬于此類轉(zhuǎn)錄因子 (2). 在競爭DNA的已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上，引入突變可評估突變對競爭D

38、NA性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的影響。2、DNase 足跡實驗原理：是一類用于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實驗技術(shù)。足跡實驗的一個明顯優(yōu)點是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。實驗原理：當DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護而免受DNaseI酶的切割作用，而不會產(chǎn)生出相應的切割分子，結(jié)果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個空白區(qū)，俗稱為“足跡”。實驗步驟：1、將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5末端標記。 2、并用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切出其中的一個末端，于是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA3、在體外同細胞蛋

39、白質(zhì)提取物（細胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質(zhì)復合體 4、在反應混合物中加入少量的DNaseI，并控制用量使之達到平均每條DNA鏈，只發(fā)生一次磷酸二酯鍵的斷裂（1）如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特定蛋白質(zhì)，使DNaseI消化之后，便會產(chǎn)生出距離放射性標記末端1個核苷酸，2個核苷酸，3個核苷酸-等等一系列前后長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續(xù)的DNA片段梯度群體.（2）如果DNA分子同蛋白質(zhì)提取物中的某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，被結(jié)合部位的DNA就可以得到保護免受DNaseI酶的降解作用.5、除去蛋白，加樣在20%序列膠上進行電泳分離，實驗分兩組： 實驗組：DNA+蛋白質(zhì)混合物 對照組：

40、只有DNA，未與蛋白質(zhì)提取物進行溫育6、最后進行放射性自顯影，分析實驗結(jié)果。如果使用較大的DNA片段，通過足跡實驗便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠阻滯實驗一樣，我們也可以加入非標記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據(jù)此測定其核苷酸序列的特異性。 3、RNAi作用機制（1）起始階段：病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內(nèi)，并利用宿主細胞進行轉(zhuǎn)錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。這些dsRNA被胞質(zhì)中的Dicer酶切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約2123 bp），即siRNA 。（dicer是RNase III家族

41、中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉(zhuǎn)基因病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA）siRNA的特點：3端均有23個突出的核苷酸（2）效應階段：siRNA雙鏈結(jié)合核酶復合物形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex, or RISC）。在ATP存在情況下，siRNA雙鏈展開激活RISC，激活的RISC即可通過堿基互補與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。 被切割后的斷裂mRNA隨即降解，使與此mRNA相應的特定基因( targetgene)表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄默狀態(tài)。（3）擴增擴散階段：siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA。 依次循環(huán)：新合成的長鏈dsRNA同樣可被Dicer切割、降解生成大量的次級siRNA。次級siRNA又可進入合成一切割的循環(huán)過程，進一步放大RNAi作用。4、RNAi現(xiàn)象的特征 RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制；靶基因內(nèi)源性序列不發(fā)生改變，即RNAi不引起穩(wěn)定的遺傳改變。