安捷倫GCMS內(nèi)標(biāo)法定量簡介

1、安捷倫GCMS內(nèi)標(biāo)法定量簡介（以5975為例）一、 內(nèi)標(biāo)法基礎(chǔ)回顧（包括外標(biāo)法的概念）1. 定量響應(yīng)值不同的物質(zhì)，由于其物理性質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)（化學(xué)結(jié)構(gòu)）的不同，在氣相色譜檢測器（FID，TCD，F(xiàn)PD，ECD，MSD等）上的響應(yīng)會不同。相同量的同種物質(zhì)對不同檢測器響應(yīng)不同。相同量的不同物質(zhì)對于同一種檢測器響應(yīng)不同。在質(zhì)量選擇檢測器（MSD）上，物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，電離電位不同，需要的電離能量不同，裂解碎片不同，裂解碎片豐度不同，這樣得到的質(zhì)量離子色譜圖的峰面積或峰高也不同（當(dāng)然總離子色譜圖的峰面積也不同）。直接用響應(yīng)信號定量，必然導(dǎo)致較大誤差。故引入響應(yīng)因子或校正因子。定量響應(yīng)因子或校正因子對檢

2、測器產(chǎn)生的信號加以校正，校正后的峰面積可以定量的代表物質(zhì)的含量。例如圖1中A, B, C三個化合物的有不同的含量和峰面積。圖 1響應(yīng)值S，即為某一物質(zhì)（組分）在檢測器所產(chǎn)生的信號強(qiáng)度（電信號，峰高，峰面積等， 本篇均采用峰面積為例， 包括下面的校正因子計(jì)算，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算等），例如一定質(zhì)量（m）的某一物質(zhì)通過檢測器在工作站或積分儀上產(chǎn)生峰面積為A，則可用下式表示：絕對響應(yīng)值S i = Ai / mi(式中：mi -i組分的量；Si -i組分的校正因子；Ai-i組分的峰面積)絕對響應(yīng)值S就是單位量物質(zhì)通過檢測器時產(chǎn)生的信號強(qiáng)度（電信號，峰高，峰面積等），也成為絕對靈敏度。一個化合物的絕對響應(yīng)值就是該

3、化合物的含量除分析這個校正混合物時該化合物的峰面積（或峰高）的值。絕對響應(yīng)值校正了檢測器對不同化合物的響應(yīng)能力。當(dāng)校正樣和未知樣品在同樣的條件下分析時，外標(biāo)法是基本的定量方法。未知樣品的結(jié)果與校正樣的結(jié)果相比較從而計(jì)算出未知物的含量。外標(biāo)法使用絕對響應(yīng)。響應(yīng)因子從校正表中得到并可儲存。在分析后面的樣品時，響應(yīng)因子被用于計(jì)算化合物的含量。使用這種計(jì)算方法必須注意一點(diǎn)，即每次運(yùn)行的進(jìn)樣量必須是一致的?；蛘咧v每一組分的檢測面積除以其已知的含量得到各自的響應(yīng)值。例如圖1中A化合物的絕對響應(yīng)值S A=3000(假如單位為pA*sce)/100(假如單位為ng或ppm)=30B化合物的絕對響應(yīng)值S B=2

4、500/80=31.25C化合物的絕對響應(yīng)值S C=4000/200=20組分的面積除以以響應(yīng)值得到其含量（或濃度）, 即外標(biāo)法：m i = Ai S i m i = Ai /S i 外標(biāo)法優(yōu)點(diǎn)是：快速簡單, 只要待測組分出峰且完全分離即可。但要求：進(jìn)樣量、色譜質(zhì)譜分析操作條件嚴(yán)格不變。是屬于絕對法。絕對響應(yīng)值的使用也是要求進(jìn)樣量、色譜質(zhì)譜分析操作條件嚴(yán)格不變。所以引入相對響應(yīng)值，用于內(nèi)標(biāo)法的計(jì)算（進(jìn)樣量，操作條件沒有外標(biāo)法那樣嚴(yán)格要求，是相對測定法，下面會談到）?；衔飅的絕對響應(yīng)值為 S i = Ai / mi化合物s(基準(zhǔn)物或內(nèi)標(biāo)物)的絕對響應(yīng)值為 Ss = As / ms則化合物i對于

5、內(nèi)標(biāo)物s的相對響應(yīng)值：S i/ s = S i /Ss = Ai ms /（As mi）(或者講內(nèi)標(biāo)物的相對響應(yīng)值等于1)例如圖1中，假如化合物B為基準(zhǔn)物（或內(nèi)標(biāo)物），則相對于B，化合物A的相對響應(yīng)值是：S A/ s = 3000*80/(2500*100) = 0.96 或 S A/ s = 30/31.25 = 0.962. 定量校正因子校正因子是定量計(jì)算公式中的比例常數(shù)，其物理意義是單位面積所代表的被測組分的量?？捎孟率奖硎荆航^對質(zhì)量（或重量）校正因子 fi = mi/Ai 可以導(dǎo)出 mi = fi Ai式中：mi -i組分的量；fi -i組分的校正因子；Ai-i組分的峰面積例如圖1中A

6、化合物的絕對質(zhì)量校正因子 fA = mA/AA = 100/3000 = 0.033(與組分性質(zhì)、儀器靈敏度等有關(guān)，例如外標(biāo)法采用絕對質(zhì)量校正因子進(jìn)行計(jì)算)相對質(zhì)量校正因子 f i/ s = fi/fs = miAs/(msAi)例如圖1中，假如化合物B為基準(zhǔn)物（或內(nèi)標(biāo)物），則相對于B，化合物A的相對校正因子是：f A/ s = 2500*100/(3000*80) = 1.04響應(yīng)值和校正因子的關(guān)系是互為倒數(shù)：即 S = 1/f 或 f =1/S 或Sf=1。實(shí)際上一般多采用校正因子來進(jìn)行定量計(jì)算。注：安捷倫的儀器使用絕對響應(yīng)因子（用RF表示）進(jìn)行外標(biāo)法定量，別的儀器是絕對校正因子。實(shí)際上安

7、捷倫的RF就是一般的校正因子。3. 內(nèi)標(biāo)法簡單的講，內(nèi)標(biāo)法就是在待測的樣品中準(zhǔn)確加入一定量的內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)被測物和內(nèi)標(biāo)物的量及其在（在質(zhì)譜中是質(zhì)量色譜圖）色譜圖相應(yīng)的峰面積比取出此被測定組分的含量。樣品中加入內(nèi)標(biāo)物，利用被測物與內(nèi)標(biāo)物校正因子的比值不變來進(jìn)行定量的。首先用被測物標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，求得定量響應(yīng)因子或校正因子：S i/ s = S i /Ss = Ai ms /（As mi）或 f i/ s = fi/fs = miAs/(msAi)請參考上面的相對響應(yīng)值和相對校正因子的例子。在樣品中準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)物后，再由它和樣品的峰面積來計(jì)算： mi =（Ai /As ）*m s / (

8、S i /Ss)= （Ai /As ）*m s /S i/ s (在安捷倫上是mi =（Ai /As ）*m s * RFi/ s） 或 mi =（Ai /As ）*m s * fi/fs = （Ai /As ）*m s * f i/ s 例如，在含未知物A，C的樣品中加入100ppm*的內(nèi)標(biāo)物B，進(jìn)樣后得到圖2的色譜圖：注：*例如，準(zhǔn)確稱取1.0000樣品，加入1000ppm（即0.1%）的內(nèi)標(biāo)物化合物B標(biāo)準(zhǔn)液0.1000g，即在樣品中的內(nèi)標(biāo)含量為: 1000ppm*0.1000/1.0000 = 100ppm）圖2則A化合物的含量為：miA = （AA /As ）*m s * S A/ s

9、 = 2900/2400*100/0.96 = 126 (ppm)或 mi =（Ai /As ）*m s * f i/ s =2900/2400*100*1.04 = 126 (ppm)內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量不嚴(yán)格要求. 內(nèi)標(biāo)的加入消除了由于進(jìn)樣量、儀器不穩(wěn)定等因素帶來的系統(tǒng)誤差。只對欲分析的組分峰做校正內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)：每次需要準(zhǔn)確稱量內(nèi)標(biāo)物和樣品。必須加一個組分進(jìn)到樣品，有可能增加面積測量誤差。作為內(nèi)標(biāo)的化合物其化學(xué)性質(zhì)和保留時間最好都應(yīng)和目標(biāo)化合物相似（理想狀態(tài)）。但它必須能按保留時間或 m / z 值來和樣品區(qū)分。同位素標(biāo)記目標(biāo)化合物是一個理想的內(nèi)標(biāo)物，它可以由其離子和目標(biāo)化合物的M/Z值區(qū)

10、別開。選擇內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)1. 樣品中不存在 2. 化學(xué)性質(zhì)與樣品相似 3. 與樣品有相同的濃度范圍 4. 不會與樣品發(fā)生反應(yīng) 5. 在感興趣組分附近流出 6. 可得到分離良好的、干凈利落的峰* 7. 色譜性質(zhì)穩(wěn)定 8. 可迅速容易得到*GC/MS對于第6項(xiàng)不要求。如果有條件，運(yùn)用同位素標(biāo)記化合物做內(nèi)標(biāo)物，其化學(xué)性質(zhì)、色譜特性等都與目標(biāo)化合物一致，因此校正精度更高。二、積分要準(zhǔn)確定量，必須對色譜峰正確積分。質(zhì)譜工作站通過兩種積分方式，即RTE 積分器（RTE Integrator）和化學(xué)工作站積分器(ChemStation Integrator)。RTE 積分器對相對簡單的色譜圖（其中的峰很窄且已

11、完全解析）提供了一種非常快速的積分。尤其適用于 target compound analyses(目標(biāo)化合物分析)。缺省參數(shù)假設(shè)待積分的數(shù)據(jù)是在整個色譜圖范圍內(nèi)使用毛細(xì)管色譜柱色譜儀掃描到的數(shù)據(jù)的總離子流 (TIC)。如果選擇適當(dāng)?shù)姆e分參數(shù)，則 RTE 積分器即可處理采集 (SIM) 和積分目標(biāo)，如在較小的保留時間窗口中檢測內(nèi)標(biāo)化合物。化學(xué)工作站積分器可以滿足各種類型色譜圖的積分，包括那些帶有難于處理的基線和負(fù)峰的色譜圖。通過設(shè)置積分參數(shù)（通常稱作積分事件）可以控制積分過程。根據(jù)需要，在數(shù)據(jù)分析（Data Analysis）的色譜（Chromatogram）菜單的Select Integrat

12、or下面選擇RTE或ChemStation積分。在MS Signal Integration Parameters設(shè)置積分參數(shù)。我喜歡用ChemStation積分器。處理各種各樣的峰較為方便且積分準(zhǔn)，直觀，特別峰型復(fù)雜時。但自動編輯定量時，用RTE較好。有關(guān)兩種積分方法的各項(xiàng)參數(shù)的意義及使用方法請參考工作站中有關(guān)內(nèi)容。這里就不羅嗦了?？傊?，在編輯定量校正表，建立校正曲線，進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法計(jì)算時，要設(shè)置合理的積分參數(shù)，正確積分（必要時，采用手動積分）以得良好的結(jié)果。三、建立內(nèi)標(biāo)定量數(shù)據(jù)庫(單級校正)示例以演示數(shù)據(jù)文件 C:MSDCHEM1DATAEVALDEMO.D為例說明如何使用自動定量設(shè)置創(chuàng)建定量

13、數(shù)據(jù)庫。調(diào)用(load)evaldemo.d質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件。并選用合適的積分參數(shù)積分。圖3檢索的結(jié)果為：圖4這里假定四個化合物的含量如下：保留時間RT（min） 化合物 含量（ppm）5.28 十二烷（dodecane） 20 6.43 聯(lián)苯 (diphenyl) （內(nèi)標(biāo)） 307.74 4-氯聯(lián)苯 (4-chlorodiphenyl) 269.78 十六酸甲酯 (methyl palmitate) 23使用自動定量設(shè)置創(chuàng)建定量數(shù)據(jù)庫，選擇Calibate/AutoQuant Setup圖5圖6如果使用RTE積分，就在Use RTEINT前面打鉤。如果選用ChemStation積分，則去掉。圖7

14、定量數(shù)據(jù)庫全局參數(shù) (Quantitation Database Globals) 窗口用來編輯在當(dāng)前的分析 中所有化合物的有關(guān)信息。在這兒可以設(shè)置定量報(bào)告、峰位置、新化合物資料等參數(shù)。這些參數(shù)設(shè)置是針對所有化合物的，但對某具體化合物可以改變設(shè)置。Calibration Title（校準(zhǔn)標(biāo)題）：如果愿意輸入一個標(biāo)題（可選）。這個標(biāo)題將顯示在每個定量報(bào)告的標(biāo)題欄中。Default Multiplier（缺省的乘數(shù)）：在打印報(bào)告前，所有未知樣品定量計(jì)算結(jié)果乘以這一給定的乘數(shù)。Default Sample Concentration（缺省的樣品濃度）：在打印報(bào)告前對未知樣品的計(jì)算結(jié)果要除以這個濃度再

15、乘100。在最后的報(bào)告中濃度單位換成 ，輸入 0 值說明在報(bào)告中樣品濃度用絕對值表示而不是用百分?jǐn)?shù)。Reference Window / Non-Reference Window（參考峰窗口/非參考峰窗口）：用來確定在定量數(shù)據(jù)庫中指定的峰是否在要處理的數(shù)據(jù)文件中，單位是 或分鐘。如果設(shè)定值是5% 表示要處理的峰其保留時間必須是在定量數(shù)據(jù)庫中保留時間 的 +/- 2.5%之內(nèi)。若設(shè)置是5 分鐘，表示將要處理的峰其保留時間是在定量數(shù)據(jù)庫保留時間的 +/- 2.5 分鐘之內(nèi)。Reference window 用于作為時間參照（內(nèi)標(biāo)物）的峰。在一個完整的色譜圖中，參考峰用來校正保留時間的漂移。工作站首

16、先找到參考峰，確定參考峰的漂移，在將這一漂移值用于其他峰。 non-reference window 是用于其他所有化合物。這些值范圍一般小于預(yù)期的保留時間附近+/- 缺省時間值范圍。Correlation Window：用于處理當(dāng)前數(shù)據(jù)文件，以確定積分時找到的目標(biāo)化合物和限定信號，是否為同一色譜峰（具有相同保留時間）。對掃描方式 (scan) 的數(shù)據(jù)典型值為0.05，而對 SIM 方式的數(shù)據(jù)可能需要 0.025。點(diǎn)OK：出現(xiàn)Choose Compound Name小窗口圖8在Choose Compound Name選dodecane點(diǎn)Add加入到校正表；接著Biphenyl，內(nèi)標(biāo)物，點(diǎn)IST

17、D；接著Add 4-ChloroBiphenyl及Methyl Palmitate。Add（添加） 將該化合物、其目標(biāo)離子和三個限定離子添加到定量數(shù)據(jù)庫中。Skip（跳過） 指示軟件顯示在數(shù)據(jù)文件中找到的下一個化合物。ISTD（內(nèi)標(biāo)） 將該化合物添加到定量數(shù)據(jù)庫中，并將其標(biāo)識為內(nèi)標(biāo)。圖9圖10出現(xiàn)”File has not been quantitated, Quantitate now?”點(diǎn)是（y）在New Level ID中輸入1，在Compound Concentration中輸入20。圖11點(diǎn)Do Update （執(zhí)行更新），可以看到隨后出現(xiàn)Edit Compounds(編輯化合物)對

18、話框，其中顯示有定量數(shù)據(jù)庫中化合物的完整列表。Biphenyl（標(biāo)識為內(nèi)標(biāo)的化合物）已經(jīng)移動到了列表的頂部（盡管它在組內(nèi)的Dodecane化合物之后流出），并裝在一個其名稱旁邊帶紅色菱形標(biāo)志的黃瓶內(nèi)。帶紅色菱形標(biāo)志的黃瓶表示其為內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)必須位于引用它的化合物之前，除此之外，在定量數(shù)據(jù)庫中順序并不重要。圖12在上圖中，可以identification下面看到化合物名稱Dodecane, 濃度單位ppm。Signal to Be Used for Quantitation下面有保留時間，定量離子57.10，參比離子71.15，43.05, 85.15（這是自動選擇和添加的）及其相對豐度等信息。一

19、旦設(shè)置了數(shù)據(jù)庫，即可直接更改編輯化合物，這個板面是用來對化合物的每一特性進(jìn)行修改。窗口的標(biāo)題顯示化合物在數(shù)據(jù)庫中的編號位置。這里列出了用于鑒定（Identification）目標(biāo)化合物所需的大部分信息。 Ret Time (Retention Time Information)：以分鐘為單位輸入保留時間。Extract Signals from：缺省值是在此之前于Quant Database Globals 所輸入的預(yù)期保留時間范圍。輸入一個時間范圍（以分鐘計(jì)）或一個百分?jǐn)?shù)，由這一時間范圍來確定適用于對峰的兩側(cè)進(jìn)行積分的基線位置。該時間窗口轉(zhuǎn)化成相應(yīng)于預(yù)期保留時間的一段時間范圍（以分鐘計(jì)）。時

20、間范圍的相對值被存入方法中。在后面的再校正中，如果峰的保留時間偏移，該窗口會隨峰移動。Quantitation Options：內(nèi)標(biāo)可以被指定為時間參考峰。當(dāng)沒有保留時間漂移時，不需要時間參考峰，只有當(dāng)設(shè)定某化合物為內(nèi)標(biāo)時，ISTD Concentration（內(nèi)標(biāo)濃度）框才會顯示。在該框中設(shè)定該樣品中內(nèi)標(biāo)物的濃度。Measure response by：根據(jù)計(jì)算峰面積或峰高進(jìn)行測定，這一參數(shù)最初是以全局參數(shù)設(shè)置的。Ident By.：確定如何從多個限定標(biāo)準(zhǔn)中選出最適當(dāng)?shù)?。Anthracene（蒽）和 Phenanthrene（菲）適合這一情況。它們的質(zhì)譜圖非常一致。而保留時間只差 0.2-0.3分鐘。軟件如何判斷何者是 Anthracene，何者是 Phenanthrene呢？點(diǎn)Calibration，把Conc下面的濃度數(shù)字改成相應(yīng)的20（dodecane不用改，相同