課題一微生物的實驗室培養(yǎng)

1、專題專題2 :2 :微生物的培養(yǎng)與應用微生物的培養(yǎng)與應用課題課題1 1：微生物的實驗室培養(yǎng)：微生物的實驗室培養(yǎng)一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識（一）、培養(yǎng)基（一）、培養(yǎng)基 人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基 碳源：碳源：凡是作為微生物細胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳架凡是作為微生物細胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質(zhì)，稱為碳源。常見的碳源有：糖類等來源的營養(yǎng)物質(zhì)，稱為碳源。常見的碳源有：糖類等含碳有機物、二氧化碳等。其中有機碳為微生物提供含碳有機物、二氧化碳等。其中有機碳為微生物提供能量。能量。 氮源

2、：氮源：凡是構(gòu)成微生物細胞的物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮凡是構(gòu)成微生物細胞的物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮元素來源的營養(yǎng)物質(zhì)。常見的碳源有：蛋白胨、牛肉元素來源的營養(yǎng)物質(zhì)。常見的碳源有：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米漿膏、酵母膏、玉米漿 ，有的微生物能利用無機氮，有的微生物能利用無機氮 。1、培養(yǎng)基的基本成分、培養(yǎng)基的基本成分 無機鹽：無機鹽：無機鹽也是微生物生長所不無機鹽也是微生物生長所不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。其主要功能是：可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。其主要功能是： 構(gòu)成細胞的組成成分；構(gòu)成細胞的組成成分； 作為酶的組成作為酶的組成成分；成分； 維持酶的活性；維持酶的活性； 調(diào)節(jié)細胞的調(diào)節(jié)細胞的滲透壓、氫離子濃度和氧化還原電位。

3、滲透壓、氫離子濃度和氧化還原電位。 常見的無機鹽有：磷、硫、鉀、鈉、鈣、常見的無機鹽有：磷、硫、鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、錳、銅、鈷、鋅、鉬鎂、鐵、錳、銅、鈷、鋅、鉬 水：水：水是微生物的重要組成部分水是微生物的重要組成部分 生長因子：生長因子：對微生物有顯著影響的微對微生物有顯著影響的微量有機物。常見的有氨基酸、維生素、嘌量有機物。常見的有氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶及其衍生物呤、嘧啶及其衍生物 液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：主要在生產(chǎn)中應用。主要在生產(chǎn)中應用。 固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：用于菌種的鑒定和選擇（可在用于菌種的鑒定和選擇（可在 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添加瓊脂）液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添加瓊脂） 半固

4、體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基：介于液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)介于液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng) 基之間?；g。 2 2、培養(yǎng)基的種類、培養(yǎng)基的種類（1 1）、按物理狀態(tài)分）、按物理狀態(tài)分（2 2）、按用途分）、按用途分選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：加入某種化學物質(zhì)，從眾多微：加入某種化學物質(zhì)，從眾多微生物中分離出所需微生物。生物中分離出所需微生物。鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基：加入某種試劑，鑒別不同種類的：加入某種試劑，鑒別不同種類的微生物（伊紅與美藍使大腸桿菌顯深紫色）微生物（伊紅與美藍使大腸桿菌顯深紫色）加入青霉素的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基: :不加有機氮源的無氮培養(yǎng)基不加有機氮源的無氮培養(yǎng)基: : 不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)

5、基不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: : 幾種選擇培養(yǎng)基舉例：幾種選擇培養(yǎng)基舉例：分離酵母菌、霉菌等真菌分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離固氮菌 分離自養(yǎng)型微生物分離自養(yǎng)型微生物唯一碳源為纖維素的培養(yǎng)基唯一碳源為纖維素的培養(yǎng)基分解纖維素的細菌分解纖維素的細菌（3 3）按培養(yǎng)基的成分來分）按培養(yǎng)基的成分來分 天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：由天然物質(zhì)制成的培養(yǎng)基。如：由天然物質(zhì)制成的培養(yǎng)基。如：煮熟的馬鈴薯、腐乳制作豆腐。煮熟的馬鈴薯、腐乳制作豆腐。 半合成培養(yǎng)基：半合成培養(yǎng)基：在天然有機物的基礎(chǔ)上適當在天然有機物的基礎(chǔ)上適當加入已知成分的無機鹽類加入已知成分的無機鹽類 。如：泡菜制作。如：泡菜制作。 合成

6、培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的各種成分完全是已知培養(yǎng)基的各種成分完全是已知的各種化學物質(zhì)。如：高氏一號合成培養(yǎng)基的各種化學物質(zhì)。如：高氏一號合成培養(yǎng)基 物質(zhì)物質(zhì)牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl瓊脂瓊脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至1000mL1000mL二、無菌技術(shù)二、無菌技術(shù) 1 1、無菌技術(shù)：指在培養(yǎng)微生物的操作中，、無菌技術(shù)：指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。 2 2、無菌技術(shù)的種類、無菌技術(shù)的種類 （1 1）消毒：使用較為溫和的方法（酒精、）消毒：使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來殺死物體表面和內(nèi)部

7、的微生物。紫外線）來殺死物體表面和內(nèi)部的微生物。 （2 2）滅菌：使用較為強烈的理化因素殺死）滅菌：使用較為強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。3 3、在微生物培養(yǎng)中需要進行無菌操作的環(huán)境、在微生物培養(yǎng)中需要進行無菌操作的環(huán)境與物品與物品對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔消毒；潔消毒；將培養(yǎng)皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌；將培養(yǎng)皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌；接種的過程要在酒精燈火焰附近進行滅菌。接種的過程要在酒精燈火焰附近進行滅菌。4 4、常用的消毒與滅菌的方法、常用的消毒與滅菌的方

8、法(1)(1)消毒的方法消毒的方法煮沸消毒法：煮沸消毒法：100100沸水煮沸水煮5-6min5-6min。巴氏消毒法：巴氏消毒法：70-75 70-75 煮煮30min30min；8080 煮煮15min15min化學試劑消毒法化學試劑消毒法: :酒精消毒、高錳酸鉀溶液酒精消毒、高錳酸鉀溶液消毒，甲醛消毒等消毒，甲醛消毒等紫外線消毒法：紫外線消毒法：紫外線消毒紫外線消毒30min30min，臭氧消，臭氧消毒。毒。 灼燒滅菌：灼燒滅菌：接種用具和接種過程中的試管口接種用具和接種過程中的試管口或瓶口放在酒精燈火焰的充分燃燒層中進行灼或瓶口放在酒精燈火焰的充分燃燒層中進行灼燒滅菌。燒滅菌。（2 2

9、）滅菌的方法）滅菌的方法 干熱滅菌：干熱滅菌：將玻璃器皿、金屬用具等能耐將玻璃器皿、金屬用具等能耐高溫并需要保持干燥的物品放到干熱滅菌箱高溫并需要保持干燥的物品放到干熱滅菌箱內(nèi)，在內(nèi)，在160160170170O OC C中加熱中加熱1 12h2h即可。即可。 高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌：將需滅菌的物品放到盛有水將需滅菌的物品放到盛有水的高壓滅菌鍋內(nèi)煮沸，待冷空氣排盡后，密閉的高壓滅菌鍋內(nèi)煮沸，待冷空氣排盡后，密閉繼續(xù)加熱至鍋內(nèi)壓力到繼續(xù)加熱至鍋內(nèi)壓力到100kPa100kPa，溫度到，溫度到121121O OC C后，后，維持維持151530min30min即可。即可。（一）制備牛肉膏蛋白胨

10、固體培養(yǎng)基（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.1.計算計算（按培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分表計算配制（按培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分表計算配制100mL100mL培養(yǎng)基）培養(yǎng)基）物質(zhì)物質(zhì)牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl瓊脂瓊脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至1000mL1000mL2.2.稱量稱量 準確稱取各種成分，注意事項：牛肉膏要放在稱量準確稱取各種成分，注意事項：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。三、實驗操作三、實驗操作 3.3.溶化：溶化：先將牛肉膏

11、連同稱量紙一起放入燒杯，加少先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加自來水定溶至溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加自來水定溶至100mL100mL。 4.4.滅菌：滅菌：將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3 35 5套，用幾層報紙?zhí)?，用幾層報紙包好）一起放到高壓鍋?nèi)滅菌

12、。包好）一起放到高壓鍋內(nèi)滅菌。 5.5.倒平板：倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到待培養(yǎng)基冷卻到5050O OC C左右時倒平板。左右時倒平板。倒平板操作的討論倒平板操作的討論 1.1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到5050O OC C時倒平板。用時倒平板。用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？ 用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時即可開始倒平板。時即可開始倒平板。 2.2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。 3.3.平板

13、冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 4.4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 空氣中的微生物

14、可能在皿蓋與皿底之間的空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。微生物。（二）純化大腸桿菌（二）純化大腸桿菌 微生物接種方法常見的有微生物接種方法常見的有平板劃線法平板劃線法和和稀釋涂布平板法。稀釋涂布平板法。1.1.平板劃線法平板劃線法 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。表面。 在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細胞繁殖而在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體稱來

15、的肉眼可見的子細胞群體稱菌落菌落。平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長情況平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長情況 （1 1）、為什么在操作的第一步以及劃線之前）、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)？要灼燒接種環(huán)？ 第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上

16、的菌種直接來源于上次劃線的末次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后仍然要灼數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。菌污染環(huán)境和感染操作者。平板劃線法的討論平板劃線法的討論 2.2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？再進行劃線？ 以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

17、3.3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。 2.2.稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法 將菌液將菌液進行一系列的梯度進行一系列的梯度稀釋稀釋，然后，然后將不將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培

18、養(yǎng)基的同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面表面進行培養(yǎng)。進行培養(yǎng)。 在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表微生物將分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。面形成單個的菌落。 稀釋涂布平板法操作過程分稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟兩個步驟，即，即系列稀釋操作系列稀釋操作和和涂布平板操作涂布平板操作。系列稀釋操作系列稀釋操作101102103104105106 (1)(1)將分別盛有將分別盛有9mL9mL水的試管滅菌并編號。水的試管滅菌并編號。(2)(2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL培養(yǎng)的菌液，注

19、入第二支試培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。(3)(3)從從10101 1倍稀釋的試管中吸取倍稀釋的試管中吸取1mL1mL稀釋液，注入第稀釋液，注入第三支試管中，重復步驟三支試管中，重復步驟2 2，直至到第六支試管。，直至到第六支試管。涂布平板操作涂布平板操作(1)(1)將涂布器浸在盛有將涂布器浸在盛有7070的酒精的燒杯中。的酒精的燒杯中。(2)(2)取少量菌液（不超取少量菌液（不超0.1mL0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。），滴加到培養(yǎng)基表面。(3)(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷將沾有酒精的涂布器在火焰上

20、引燃，火熄后冷卻卻8 810s10s。(4)(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。稀釋涂布平板法獲取的大腸桿菌菌落稀釋涂布平板法獲取的大腸桿菌菌落 1.1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？果有菌落生長，說明了什么？ 未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1 12 d2 d后無后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。需要重新制備。 2.2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？ 如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。到大小、形狀、顏色相似的菌