蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1、林琳林琳蛋白質(zhì)的含量測(cè)定蛋白質(zhì)的含量測(cè)定基于蛋白質(zhì)的基于蛋白質(zhì)的元素組成特點(diǎn)元素組成特點(diǎn)基于蛋白質(zhì)的基于蛋白質(zhì)的化學(xué)顯色反應(yīng)化學(xué)顯色反應(yīng)基于蛋白質(zhì)的基于蛋白質(zhì)的光吸收特性光吸收特性選擇測(cè)定選擇測(cè)定方法主要基于幾點(diǎn)考慮方法主要基于幾點(diǎn)考慮：實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度的靈敏度和精確度檢測(cè)條件檢測(cè)條件溶液中存在溶液中存在的干擾物質(zhì)的干擾物質(zhì)蛋白質(zhì)特點(diǎn)蛋白質(zhì)特點(diǎn)測(cè)定所要花測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間等費(fèi)的時(shí)間等在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1. 學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理原理 2. 掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含

2、量的實(shí)驗(yàn)掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和使用方法技術(shù)和使用方法。紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)原理】【實(shí)驗(yàn)原理】 蛋白質(zhì)中蛋白質(zhì)中酪氨酸酪氨酸、色氨酸色氨酸和苯丙氨酸和苯丙氨酸殘基殘基的苯的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在280nm具有一具有一個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)內(nèi)（0.1-10mg/mL），蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度與其濃度成正比，因此可作蛋白質(zhì)定量分析。度與其濃度成正比，因此可作蛋白質(zhì)定量分析。TyrTrpPhe【儀器與試劑

3、】【儀器與試劑】 1.1.紫外分光光度計(jì)，紫外分光光度計(jì)，比色皿比色皿，吸量，吸量管。管。 2. 2.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：0.9% NaCl0.9% NaCl溶液溶液溶解溶解0.25g0.25g結(jié)晶牛結(jié)晶牛血清蛋白血清蛋白，稀釋到，稀釋到250ml250ml。 3. 3.待測(cè)蛋白溶液：用酪蛋白配制，濃待測(cè)蛋白溶液：用酪蛋白配制，濃度在度在1.0-2.5mg/ml1.0-2.5mg/ml 4.0.9% NaCl 4.0.9% NaCl溶液溶液 5. 5.試管試管1.5cm1.5cm15cm15cm（9 9） 6. 6.移液管移液管1ml1ml（3 3），），2ml2ml（2 2），）

4、，5ml5ml（2 2）。）?！緦?shí)驗(yàn)步驟】【實(shí)驗(yàn)步驟】項(xiàng) 目12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/ml00.51.01.52.02.53.04.0蒸餾水/ml4.03.53.02.52.01.51.00蛋白質(zhì)濃度/ml00.1250.250.3750.500.6250.751.0A280表表1-2 1-2 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度-標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 1 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線法法（1 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：?。?biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取8 8只試管按表只試管按表1-21-2加入試劑，搖勻。選擇加入試劑，搖勻。選擇光程光程1cm 1cm 石英比色皿，在石英比色皿，在280

5、nm280nm波長(zhǎng)測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定A280A280，以，以A280A280值為縱坐標(biāo)，值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2 2）樣品測(cè)定：）樣品測(cè)定： 配制待測(cè)蛋白質(zhì)溶液配制待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1ml1ml，加入蒸餾水，加入蒸餾水3ml3ml，搖勻，搖勻，測(cè)定測(cè)定A280A280，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出蛋白質(zhì)濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出蛋白質(zhì)濃度。吸吸光光度度蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度 簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用 低濃度的鹽低濃度的鹽(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定

6、等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定 紫紫外吸收法的外吸收法的缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：紫外吸收法的優(yōu)點(diǎn)：紫外吸收法的優(yōu)點(diǎn)： 測(cè)定測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多 在在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差 附注附注對(duì)于有核酸存在時(shí)所造成的誤差，可將待測(cè)的蛋白質(zhì)溶液稀對(duì)于有核酸存在時(shí)所造成的誤差，可將待測(cè)的蛋白質(zhì)溶液稀釋至光密度在釋至光密度在0.22.00.22.0之間，選用光程為之間，選用光程為1cm1cm的石英比色杯，的石

7、英比色杯，在在280nm280nm及及260nm260nm處分別測(cè)出光密度，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即處分別測(cè)出光密度，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度可算出蛋白質(zhì)的濃度。此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來建立的。的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來建立的。蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度=1.45=1.45A280A2800.740.74A260 (mg/ml)A260 (mg/ml)分光光度計(jì)的分類分光光度計(jì)的分類分光光度計(jì)的分類分光光度計(jì)的分類紅外分光光度計(jì)紅外分光光

8、度計(jì):可見光分光光度計(jì)可見光分光光度計(jì):紫外分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì):測(cè)定波長(zhǎng)范圍為測(cè)定波長(zhǎng)范圍為大于大于760 nm的紅外光區(qū)的紅外光區(qū) 測(cè)定波長(zhǎng)范圍為測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400760 nm的可見光區(qū)的可見光區(qū)測(cè)定波長(zhǎng)范圍為測(cè)定波長(zhǎng)范圍為200200400 400 nmnm的紫外光區(qū)的紫外光區(qū)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu) 無論哪一類分光光度計(jì)都包括無論哪一類分光光度計(jì)都包括5 5個(gè)基本部件：光源、單個(gè)基本部件：光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表。色器、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量?jī)x表。分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示分光光度計(jì)各部件的次序如圖所示: : 分光光度計(jì)分光光度計(jì) 1光源：鎢燈或鹵

9、鎢燈光源：鎢燈或鹵鎢燈可見光源可見光源 400760nm 氫燈或氘燈氫燈或氘燈紫外光源紫外光源 200400nm 2單色器：?jiǎn)紊鳎喊鸦旌瞎獠ǚ纸鉃閱伟鸦旌瞎獠ǚ纸鉃閱尾ㄩL(zhǎng)光的裝置波長(zhǎng)光的裝置3吸收池吸收池（比色皿）（比色皿） ： 玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)光，僅適用于可見光區(qū) 石英石英不能吸收不能吸收UV光，適用于紫外和可見光區(qū)光，適用于紫外和可見光區(qū) 4檢測(cè)器：將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)的裝置檢測(cè)器：將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)的裝置5記錄裝置：訊號(hào)處理和顯示系統(tǒng)記錄裝置：訊號(hào)處理和顯示系統(tǒng)分光光度計(jì)使用方法（分光光度計(jì)使用方法（72007200型）型） （1 1）通電）通電-儀器自檢

10、儀器自檢-預(yù)熱預(yù)熱20min20min； （2 2）用）用 鍵設(shè)置測(cè)試方式：透射比（鍵設(shè)置測(cè)試方式：透射比（T T），吸光度（），吸光度（A A），），已知標(biāo)樣濃度方式（已知標(biāo)樣濃度方式（C C）和已知標(biāo)樣濃度斜率（）和已知標(biāo)樣濃度斜率（K K）方式；）方式； （3 3）波長(zhǎng)選擇：用波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)置所需的單色光波長(zhǎng)）波長(zhǎng)選擇：用波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)置所需的單色光波長(zhǎng); ; （4 4）放樣順序：打開樣品室蓋，在）放樣順序：打開樣品室蓋，在1414號(hào)放置比色皿槽中，依號(hào)放置比色皿槽中，依次放入次放入%T%T校具（黑體），參比液，樣品液校具（黑體），參比液，樣品液1 1和樣品液和樣品液2 2。 （5 5）

11、校具（黑體）校）校具（黑體）?！?.000”0.000”：將：將%T%T校具（黑體）置入光路，校具（黑體）置入光路，在在T T方式下按方式下按“%T”%T”鍵，此時(shí)儀器自動(dòng)校正后顯示鍵，此時(shí)儀器自動(dòng)校正后顯示“0.000”0.000” （6 6）參比液校）參比液?！?00”%T100”%T或或“0.000”A0.000”A：將參比液拉入光路中，：將參比液拉入光路中，按按“0A/100%T”0A/100%T”鍵調(diào)鍵調(diào)0A/100%T0A/100%T，此時(shí)儀器顯示，此時(shí)儀器顯示“BLA”BLA”，表示儀器，表示儀器正在自動(dòng)校正，校正完畢后顯示正在自動(dòng)校正，校正完畢后顯示“100”%T100”%T或

12、或“0.000”A0.000”A后后, ,表示校表示校正完畢，可以進(jìn)行樣品測(cè)定。正完畢，可以進(jìn)行樣品測(cè)定。 （7 7）樣品測(cè)定：將兩樣品液分別拉入光路中，此時(shí)若在）樣品測(cè)定：將兩樣品液分別拉入光路中，此時(shí)若在“T”T”方式下則可依次顯示樣品的透射比（透光度）；若在方式下則可依次顯示樣品的透射比（透光度）；若在“A”A”方式下，方式下，則顯示測(cè)得的樣品吸光度。則顯示測(cè)得的樣品吸光度。分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng) （1） 預(yù)熱是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要步驟，不預(yù)熱是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要步驟，不可忽略?？珊雎?。（2） 在波長(zhǎng)在波長(zhǎng)320nm以下的實(shí)驗(yàn)范圍一定要選用石以下的實(shí)驗(yàn)范圍一定要選用石英比色皿，絕不可以玻璃比色皿替代。英比色皿，絕不可以玻璃比色皿替代。（3）比色皿的清潔程度，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。先用比色皿的清潔程度，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。先用自來水將用過的比色皿反復(fù)沖洗，然后用蒸餾水淋自來水將用過的比色皿反復(fù)沖洗，然后用蒸餾水淋洗，倒立于濾紙片上，待干后收回比色皿盒中。必洗，倒立于濾紙片上，待干后收回比色皿盒中。必要時(shí)，比色皿用濃硝酸或鉻酸洗液浸泡、沖洗。要時(shí)，比色皿用濃硝酸或鉻酸洗液浸泡、沖洗。 (4) 比色皿內(nèi)盛液應(yīng)為其容量的比色皿內(nèi)盛液應(yīng)為其容量的2/33/4，過少會(huì)，過少會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，過多易在測(cè)量過程中外溢，污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，過多易在測(cè)量過程中外溢