單克隆抗體的制備1

1、一.單克隆抗體的概念抗體是機(jī)體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過(guò)動(dòng)物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的，因而抗血清通常含有針對(duì)其他無(wú)關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。一般的抗原分子大多含有多個(gè)不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體也是針對(duì)多個(gè)不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對(duì)同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因而，常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體（polyclonal antibody），簡(jiǎn)稱多抗。由于常規(guī)抗體的多克隆性質(zhì)，加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差異很大，使它在免疫化學(xué)試驗(yàn)等使用中帶來(lái)許多麻煩。因此，制備針對(duì)預(yù)定抗原的特異性均質(zhì)

2、的且能保證無(wú)限量供應(yīng)的抗體是免疫化學(xué)家長(zhǎng)期夢(mèng)寐以求的目標(biāo)。隨著雜交瘤技術(shù)的誕生，這一目標(biāo)得以實(shí)現(xiàn)。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù)定抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與能在體外培養(yǎng)中無(wú)限制生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征，既像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能無(wú)限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴細(xì)胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過(guò)克隆化可得到來(lái)自單個(gè)雜交瘤細(xì)胞的單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對(duì)同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體（monoclonal antibody），簡(jiǎn)稱單抗。與多抗相比，單抗純度高

3、，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。單抗技術(shù)的問(wèn)世，不僅帶來(lái)了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)了眾多學(xué)科的發(fā)展。Kohler和Milstein兩人由此杰出貢獻(xiàn)而榮獲1984年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。二、雜交瘤技術(shù)（一） 雜交瘤技術(shù)的誕生淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的誕生是幾十年來(lái)免疫學(xué)在理論和技術(shù)兩方面發(fā)展的必然結(jié)果，抗體生成的克隆選擇學(xué)說(shuō)、抗體基因的研究、抗體結(jié)構(gòu)與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機(jī)制的揭示等，為雜交瘤技術(shù)提供了必要理論基礎(chǔ)，同時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)、細(xì)胞融合與雜交細(xì)胞的篩選等提供了技術(shù)貯備。1975年8月7日，Kohler和Milstei

4、n在英國(guó)自然雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細(xì)胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。融合由仙臺(tái)病毒介導(dǎo)，雜交細(xì)胞通過(guò)在含有次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（amino

5、pterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培養(yǎng)基（HAT）中生長(zhǎng)進(jìn)行選擇。在融合后的細(xì)胞群體里，盡管未融合的正常脾細(xì)胞和相互融合的脾細(xì)胞是HGPRT ，但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞因得到分別來(lái)自親本脾細(xì)胞的HGPRT和親本骨髓瘤細(xì)胞的連續(xù)繼代特性，而在HAT培養(yǎng)基中存活下來(lái)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果完全像起始設(shè)計(jì)的那樣，最終得到了很多分泌抗綿羊紅細(xì)胞抗體的克隆化雜交瘤細(xì)胞系。用這些細(xì)胞系注射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長(zhǎng)雜交瘤的小鼠血清和腹水中

6、含有大量同質(zhì)的抗體，即單克隆抗體。這一技術(shù)建立后不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細(xì)胞系等方面即得到改進(jìn)。最早仙臺(tái)病毒被用做融合劑，后來(lái)發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問(wèn)題，從而得到廣泛的應(yīng)用。隨后建立的骨髓瘤細(xì)胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系，只分泌一種針對(duì)預(yù)定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細(xì)胞MOPC-21等的不足。再后來(lái)又建立了大鼠、人和雞等用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞系，但其基本原理和方法是一樣的。（二） 基本程序和方法雜交瘤技術(shù)在具體操作上，各實(shí)驗(yàn)室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介

7、紹的方法是作者所在實(shí)驗(yàn)室采用的、實(shí)踐證明成熟的程序，該程序適合國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。在開(kāi)展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞必須具備下列主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或

8、塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（50ul，200ul，1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細(xì)胞的篩選與檢測(cè)的儀器設(shè)備，依據(jù)檢測(cè)單抗的方法不同而各異，請(qǐng)參閱本節(jié)有關(guān)部分。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括：動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗檢測(cè)、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)研制單抗的主要過(guò)程。1、動(dòng)物免疫(1) 抗原制備 制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說(shuō)雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會(huì)增加，同時(shí)可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純?cè)胶茫瑧?yīng)根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)

9、室的條件來(lái)決定。一般來(lái)說(shuō)，抗原的來(lái)源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時(shí)易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時(shí)，則必須對(duì)抗原進(jìn)行純化。檢測(cè)用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。(2) 免疫動(dòng)物的選擇 根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動(dòng)物。因?yàn)?，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來(lái)源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來(lái)源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動(dòng)物作為免疫動(dòng)物。但是，

10、有時(shí)為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動(dòng)物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因?yàn)槿旧w容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時(shí)以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。(3) 免疫程序的確定 免疫是單抗制備過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機(jī)會(huì)。因此在設(shè)計(jì)免疫程序時(shí)，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時(shí)間、佐劑的應(yīng)用及動(dòng)物對(duì)該抗原的應(yīng)答能力等。沒(méi)有一個(gè)免疫程序能適用于各種抗原?，F(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常

11、用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點(diǎn)眼。最后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因?yàn)榭墒箍乖瓕?duì)脾細(xì)胞作用更迅速而充分。在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾融合為好，許多實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時(shí)獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應(yīng)答時(shí)獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會(huì)陽(yáng)性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無(wú)明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細(xì)胞，這在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天

12、取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報(bào)道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對(duì)抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時(shí)間，一般免疫3天后即可融合。 表6-1 不同免疫抗原的免疫程序免疫原特性 抗原量 接種次數(shù) 間隔時(shí)間 單抗的特性抗體滴度 親和性免疫原性強(qiáng)（如細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等） 106-107個(gè)細(xì)胞或1-10ug 2-42-4周 高中等至強(qiáng)免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高 中等或強(qiáng)免疫原性弱 A.20-400ug 2-4隨后2-3 每月2-3月 中等 強(qiáng)B.10-50ug其后200-400ug 2其后4 每月每天 中等 中等C.10-100ug 2其后4其后“休息”最后加強(qiáng)每月10天1-2月 中等 中

13、等或強(qiáng)(摘自劉秀梵)體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、來(lái)源充分的抗原，對(duì)于免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能采用體內(nèi)免疫法。因此，針對(duì)這些情況，可采用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胞，或外周血淋巴細(xì)胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。其基本方法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，制成單細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2-3次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.5-5ug/ml，細(xì)胞抗原105-106個(gè)細(xì)胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液；在3

14、7，6%CO2濃度下培養(yǎng)3-5天，再分離脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。2、細(xì)胞融合主要試劑的配制a、 細(xì)胞培養(yǎng)基 雜交瘤技術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體配制方法按廠家規(guī)定的程序，配好后過(guò)濾除菌（0.22um），分裝，4保存。不完全RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液96ml100×L.G.溶液1ml雙抗溶液1ml7.5% NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml不完全DMEM培養(yǎng)基：DMEM 13.37g超純水或四蒸水980mlNaHCO3 3.7g雙抗溶液

15、10ml100×L.G.溶液10ml用1N HCl調(diào)試PH至7.2-7.4，過(guò)濾除菌，分裝4保存。完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基：不完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基80ml小牛血清15-20ml用于骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和建株后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)。HT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基99mlHT貯存液1mlHAT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基98mlHT貯存液1mlA貯存液1mlb、 氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L） : 稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90m

16、l超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補(bǔ)加超純水或四蒸水至100ml。過(guò)濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20保存。c、 次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50水浴中使完全溶解，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20凍存。用前可置37加溫助溶。d、 L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×

17、，0.2mol/L） : 稱取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20凍存。e、 青、鏈霉素（雙抗）溶液（100×）: 取青霉素G（鈉鹽）100萬(wàn)單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g，溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20凍存。f、 7.5% NaHCO3溶液 : 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4保存。g、 HEPES溶液（1mol/L）: 稱取23.83

18、g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超純水或四蒸水中，過(guò)濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4保存。h、 8-氮鳥(niǎo)嘌呤貯存液（100×）: 稱取200mg 8-氮鳥(niǎo)嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml，過(guò)濾除菌；分裝小瓶，-20凍存。使用時(shí)按1%濃度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml）。i、 50% PEG: 稱取PEG 1000 或

19、4000 20-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80水浴融化，0.6ml分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許7.5% NaHCO3調(diào)PH至8.0，或購(gòu)買(mǎi)Sigma或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn)品。  髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前骨髓瘤細(xì)胞維持的方式，對(duì)成功地得到雜交瘤是最為重要的。目標(biāo)是使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的時(shí)間盡可能長(zhǎng)，融合前肯定不能少于1周。凍存的細(xì)胞在復(fù)蘇后要2周時(shí)間才能處于適合于融合的狀態(tài)，長(zhǎng)過(guò)了的骨髓瘤細(xì)胞至少幾天才可能恢復(fù)。在實(shí)驗(yàn)室中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞維持在含10%小牛血清的培養(yǎng)基中，方法是用6個(gè)裝5ml培

20、養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細(xì)胞。1周后到細(xì)胞相當(dāng)密而又未長(zhǎng)過(guò)的一瓶重新移植。典型的倍增時(shí)間為14-16小時(shí)。骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備方法如下：a、  于融合前48-36小時(shí)，將骨髓細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)（一般按一塊96孔板的融合試驗(yàn)約需2-3瓶100ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)備）。b、  融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集于50ml離心管或融合管內(nèi)。c、  1000r/min離心5-10分鐘，棄去上清。d、  加入30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于10ml不完全培養(yǎng)基，混勻。e

21、、 取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，取細(xì)胞懸液0.1ml加入0.9ml臺(tái)盼藍(lán)染液中，混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù)=4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)×105/4；或每毫升細(xì)胞數(shù)=5個(gè)中方格細(xì)胞數(shù)×106/2 脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照血清。同時(shí)通過(guò)頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，于解剖臺(tái)板上固定后掀開(kāi)左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺(tái)中用無(wú)菌手術(shù)剪剪開(kāi)腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車(chē)Y(jié)締組織

22、。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟），使脾細(xì)胞進(jìn)入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液。為了除去脾細(xì)胞懸液中的大團(tuán)塊，可用200目銅網(wǎng)過(guò)濾。收獲脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心5-10分鐘，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，然后將細(xì)胞重懸于10ml不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液，加臺(tái)酚藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108個(gè)脾細(xì)胞，每只大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細(xì)胞。 飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cells）的制

23、備在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過(guò)程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長(zhǎng)刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長(zhǎng)條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。其中以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的來(lái)源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細(xì)胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：按上述采小鼠脾細(xì)胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露

24、腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml HAT培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2×105/ml，備用。通常對(duì)巨噬細(xì)胞來(lái)說(shuō)，96孔培養(yǎng)板每孔需2×104個(gè)細(xì)胞，24孔板每孔需105細(xì)胞。每只小鼠可得3-5×106個(gè)細(xì)胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板的飼養(yǎng)細(xì)胞。也可在細(xì)胞融合前1-2天制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞，這樣使培養(yǎng)板孔底先鋪上一層飼養(yǎng)細(xì)胞

25、層。做法是，將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當(dāng)于2滴），然后置37 6% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 細(xì)胞融合的程序已報(bào)道的有很多種，這里介紹的是作者所在實(shí)驗(yàn)室常用的一種。A、 將1×108脾細(xì)胞與2×107-5×107骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。B、 1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。C、 在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻;置40水浴中預(yù)熱。D、 用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時(shí)間為45秒）加預(yù)熱至40的50% PEG（PH

26、8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。E、 用10ml吸管在90秒內(nèi)加20-30ml預(yù)熱至37的不完全培養(yǎng)基；20-37靜置10分鐘。F、 1000r/min 5分鐘；棄去上清。G、 加入5ml HAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含腹腔巨噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至80-100ml。H、 分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后將培養(yǎng)板置37，6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。I、 5天后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。J、 7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。L、 經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)

27、至孔底面積1/10以上時(shí)吸出上清供抗體檢測(cè)。3雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來(lái)，通常也稱為抗體檢測(cè)?？贵w檢測(cè)的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測(cè)方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡(jiǎn)便，便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯€(gè)樣品需要在短短幾個(gè)小時(shí)就報(bào)告結(jié)果，以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測(cè)方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說(shuō)來(lái)，在融合之前就必須建立好抗體檢測(cè)方法，并克服可能存在的問(wèn)題。另一個(gè)重要問(wèn)題是抗體檢測(cè)方法所需要的“動(dòng)力學(xué)范圍”，即檢出背景以上的最強(qiáng)與最弱信

28、號(hào)之比，依所用的檢測(cè)抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對(duì)純化的蛋白質(zhì)抗原的，100%的抗原參與反應(yīng)，一個(gè)陽(yáng)性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對(duì)細(xì)胞表面微量的蛋白抗原，檢測(cè)系統(tǒng)可能需要能測(cè)出微弱信號(hào)，則動(dòng)力學(xué)范圍至少應(yīng)為10：1，最好為100：1。另外，檢測(cè)方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預(yù)定的用途的影響。結(jié)合補(bǔ)體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性反應(yīng)的檢測(cè)方法來(lái)選出。如需結(jié)合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A的檢測(cè)方法。下面簡(jiǎn)要介紹幾種常用的抗體檢測(cè)方法： 免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度

29、高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。A、器材和試劑a. 包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調(diào)PH至9.6。Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至1000ml。b. 洗滌緩沖液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（B

30、SA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。d. 酶反應(yīng)終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此一次不宜配制過(guò)多。f. 底物使用液：OPD底物使用液（測(cè)490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（測(cè)450nm的OD值）：TMBS或

31、TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS底物使用液（測(cè)410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。g. 抗體對(duì)照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽(yáng)性血清。h. 抗原： 可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗原。淋巴細(xì)胞等懸液。i. 酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo)SPA或其他類似試劑。j. 細(xì)胞固定液：-20丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20甲

32、醇。k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。l. 酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機(jī)等。B、 可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）a. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。b. 以50-100ul/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4過(guò)夜或37吸附2小時(shí)。c. 棄去孔內(nèi)的液體，同時(shí)用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，拍干。d. 每孔加200ul封閉液4過(guò)夜或37封閉2小時(shí)；該步驟對(duì)于一些抗原，可省略。e. 洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可-20或4保存?zhèn)溆?。f. 每孔加50-100ul待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；37孵育1-

33、2小時(shí)；洗滌，拍干。g. 加酶標(biāo)第二抗體，每孔50-100ul，37孵育1-2小時(shí)，洗滌，拍干。h. 加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul，3710-30分鐘。i. 以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。j. 結(jié)果判定：以P/N2.1，或PN 3D為陽(yáng)性。若陰性對(duì)照孔無(wú)色或接近無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。C、 全菌抗原的ELISASa. 新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸餾水或PBS懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至1×108個(gè)/ml。必須指出，對(duì)于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。 b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1

34、mol/L NaHCO3 95ml 25%戊二醛溶液5ml），37作用2小時(shí)，蒸餾水洗滌3次；加上述細(xì)菌懸液50ul/孔；37-56烘干；每孔加200ul封閉液4過(guò)夜或37 2小時(shí)封閉。c. 步驟b也可采用先每孔加50ul細(xì)菌懸液，37-56烘干，然后用-20預(yù)冷的無(wú)水甲醇室溫作用15分鐘，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4過(guò)夜或37 2小時(shí)封閉。d. 洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可在-20或4保存?zhèn)溆?。e. 以下步驟同上法。D、 用全細(xì)胞抗原的ELISAa. 按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS制成適當(dāng)濃度懸液。b. 淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周

35、血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1500rpm離心30分鐘，吸取界面細(xì)胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞，離心后加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鐘，洗滌一次即可。將該細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度。c. 每孔加100ul上述a或b的細(xì)胞懸液，使每孔含細(xì)胞5×104個(gè)；1500r/min 15分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4固定10分鐘；可4或-20保存?zhèn)溆?。d. 以下步驟同上法。E、抗體捕捉ELISA試驗(yàn)本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb，再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELIS

36、A中較理想的一種；其操作步驟如下：a. 以適當(dāng)濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標(biāo)板，每孔加100ul，37 2小時(shí)或4過(guò)夜。b. 洗滌、拍干后加待測(cè)的McAb樣品，37 1-2小時(shí)。c. 洗滌后加適量的抗原，37 1-2小時(shí)。d. 洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體，37 1-2小時(shí)。洗滌后加底物顯色，判定結(jié)果。F、ABC-ELISA試驗(yàn)ABC-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，增加了生物素（Biotin）與親和素（Avidin）間的放大作用。親和素有4個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素有高度的親合力。生物素很易與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。因此，結(jié)合了酶的親和素與結(jié)合有抗體的生物素發(fā)生反應(yīng)即起到了多極放大作用。其操作步驟

37、如下：a. 已知抗原的包被及加待檢McAb樣品，同間接ELISA試驗(yàn)。b. 加生物素化抗鼠Ig抗體，每孔100ul，37 1小時(shí)；洗滌。c. 加酶標(biāo)親和素，每孔100ul，37 30分鐘洗滌；加底物顯色，判定結(jié)果。G、Dot-ELISA試驗(yàn)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（Dot-ELISA）是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固相載體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫檢測(cè)手段。該法采用不溶性底物（如DAB，或4-氯萘酚或AgNO3等），其與相應(yīng)標(biāo)記物（HRP、AP、膠體金）作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀著色，從而易于判定結(jié)果。根據(jù)所用的標(biāo)記物不同，可分為HRP 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、AP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和免疫金銀斑點(diǎn)法等。其操作步驟大致

38、如下：a. 將抗原液2-5ul點(diǎn)加于纖維素膜上，室溫37干燥。b. 將纖維膜浸入封閉液中，37 30分鐘。c. 用洗滌液洗2次，吸干后加待檢McAb樣品，37 1小時(shí)；用洗滌液振蕩洗滌三次，每次5分鐘，加HRP或AP或膠體金標(biāo)記的抗鼠Ig抗體，37作用30分鐘。d. 同法洗滌，吸干，用新配的相應(yīng)底物溶液顯色，然后水洗終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。H、免疫組化染色法該法主要用于檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞抗原成分的McAb，常用的方法是間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)（IIP，indirect immunoperoxidase）及APAAP技術(shù)。其結(jié)果用光鏡或倒置顯微鏡檢查。 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可用于多種抗原的雜交瘤抗體檢測(cè)

39、，如細(xì)胞性抗原（包括細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞）、感染細(xì)胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡(jiǎn)單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點(diǎn)，在McAb的篩選與鑒定上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。A、器材和試劑a. 供檢測(cè)抗體用的抗原制備固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。b. PBS（PH7.2，0.01mol/L）c. 待檢的McAb樣品。d. 冷丙酮e. FITC（異硫氰酸熒光素）或TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明熒光素）標(biāo)記的抗鼠Ig抗體等f(wàn). 熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機(jī)，水浴箱等。B、間接免疫熒光法a. 固定細(xì)胞片的制備：生長(zhǎng)在蓋片上的細(xì)胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片，在PBS中洗滌，用4丙酮固定10分鐘，空氣干

40、燥，置密封容器于-20保存?zhèn)溆?；單?xì)胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。細(xì)胞涂片的制備：將10ul細(xì)菌懸液（1×108個(gè)/ml）涂抹7×21mm蓋片上，自然干燥后，用-20丙酮固定10-15分鐘，于-20保存?zhèn)溆?。b. 蓋片在去離子水中濕潤(rùn)后置架上滴加10-20ul雜交瘤上清或其他待檢樣品；設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照；置37水浴孵育0.5-1小時(shí)。c. 取出蓋片置PBS中用磁力攪拌器洗滌15分鐘。d 蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠Ig的熒光抗體10-20ul，37孵育0.5-1小時(shí)。e 同法洗滌15分鐘；取出蓋片，用延緩熒光碎滅的封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PBS）封于干

41、凈載玻片上。f. 光顯微鏡上觀察，陽(yáng)性結(jié)果可見(jiàn)特異性熒光（FITC為黃綠色熒光，TRITC為桔紅色熒光）。g. 細(xì)胞固定片的制備，也可改在培養(yǎng)板孔中進(jìn)行，其余步驟同上，在觀察結(jié)果時(shí)，將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下，判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。C、 細(xì)胞的膜熒光染色完整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜，抗體不能透過(guò)。如果細(xì)胞在4操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞膜。必須注意死細(xì)胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗(yàn)過(guò)程中要保證細(xì)胞的高活力。活細(xì)胞的膜熒光染色大致步驟如下：a. 制備活性較好的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至107個(gè)/ml。b. 在小試管（5×50mm）中加入100ul細(xì)胞懸液，再加入100ul待檢McAb的樣品，混

42、勻，4作用30-90分鐘。c. 用洗滌液（PBS 900ml，小牛血清50ml，4%NaN3 50ml）洗二次，每次加洗滌液1-5ml，1000r/min離心5分鐘，棄上清。加入100ul熒光抗體，4作用30-90分鐘。d. 同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于載玻片上，加蓋片封載。e. 立即在熒光顯微鏡上檢查。f. 細(xì)胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在4可保存一周。 間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)又稱被動(dòng)血凝試驗(yàn)（PHA），是目前應(yīng)用較廣的檢測(cè)方法之一。本試驗(yàn)是以包被可溶性抗原的紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包

43、被在紅細(xì)胞上的抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象?？梢?jiàn)，該法具有靈敏、快速、容易操作和無(wú)需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，而且經(jīng)改用醛化紅細(xì)胞以后，克服原來(lái)重復(fù)性差的缺點(diǎn)。A、 器材和試劑a. 綿羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。b. 緩沖液：PBS（PH7.2）；醋酸緩沖液。c. 甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝劑等。d. 血凝板，振蕩器等。B、 多糖抗原的間接血凝試驗(yàn)a. 甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：無(wú)菌采集綿羊頸靜脈血50ml，用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用5倍于紅細(xì)胞壓積的PH7.2 PBS（Na2HPO412H2O 3.58g，KH2PO4 0.41g，NaCl 8.01g，蒸餾水1000ml）充分洗滌5次，每

44、次1500r/min 5-10分鐘，直至上清測(cè)定無(wú)蛋白質(zhì)（用飽和硫酸銨滴定上清，觀察有無(wú)白色沉淀），再以相同緩沖液配成25%紅細(xì)胞懸液；將25%紅細(xì)胞懸液與20%甲醛以2.5：1的比例混勻，37水浴作用2小時(shí)，每15分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐漸由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?；以PH7.2 PBS洗滌4次，每次2000r/min 10分鐘，再以同樣的PBS制成25%紅細(xì)胞懸液；其后，重復(fù)醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸液，加甲醛至0.3%防腐，4保存?zhèn)溆?。b. 脂多糖抗原致敏甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：取脂多糖（LPS），以0.2mol/L PH8.0 PB液，調(diào)整多糖濃度至120ug/ml，

45、然后100水浴處理1小時(shí)；將冷卻至37的熱處理LPS與6%醛化紅細(xì)胞等量混合，37攪拌作用45分鐘；取出離心2000r/min 10分鐘，以0.01mol/L PH7.2 PBS洗滌4次；配制成4%致敏血球，分裝，保存于4備用，或凍干保存。c. McAb的篩選：取待測(cè)McAb樣品25ul，加入V型微量血凝板孔中，同時(shí)設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照；再加入0.5-4%致敏紅血球懸液25ul，在振蕩器上混勻30秒；置室溫或37 30-60分鐘觀察結(jié)果。陰性對(duì)照孔應(yīng)呈緊縮的圓點(diǎn)。C、 可溶性蛋白抗原的間接血凝試驗(yàn)a. 紅細(xì)胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人“O”型抗凝血，每次加10倍于紅細(xì)胞壓積的PBS洗滌4-6次

46、，然后配成8%紅細(xì)胞懸液；向此8%紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS，于室溫緩慢攪拌17小時(shí)；其后洗滌3次，配成20%雙醛化紅細(xì)胞懸液，加0.1% NaN3防腐，4保存?zhèn)溆?。b. 致敏紅細(xì)胞：取20%雙醛化紅細(xì)胞0.1ml，1500r/min 10分鐘，棄上清，沉積紅細(xì)胞加0.2mol/L PH4.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液1ml，并加最適濃度（應(yīng)預(yù)先測(cè)定，蛋白抗原為50ug/ml左右）的抗原1ml，混勻，于45致敏30分鐘，有時(shí)輕輕搖動(dòng)，使紅細(xì)胞不下沉。然后離心去上清，并用20倍于紅細(xì)胞壓積的PBS洗3-4次，最后用PBS配成0.5-1%致敏紅細(xì)胞，4保存?zhèn)溆谩. McAb

47、測(cè)定：同上法。 放射免疫測(cè)定放射免疫測(cè)定是用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，以檢測(cè)相應(yīng)抗原或抗體的定量方法。在篩選和鑒定單抗時(shí)常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以檢測(cè)樣品中的McAb，其操作步驟如下：a. 用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至適宜的濃度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔內(nèi)，100ul/孔，4過(guò)夜或37 2小時(shí)。b. 棄去抗原液，每孔加100ul含0.5-1% BSA的PBS，4 1-2小時(shí)封閉。c. 用BSA-PBS洗滌3次，每次3分鐘。d. 加待檢樣品，每孔100ul，設(shè)立陰性孔、陽(yáng)性孔和空白孔；371-2小時(shí)，同法洗滌。e. 每孔加125I標(biāo)記的抗鼠Ig抗體工作液100u

48、l，37 1-2小時(shí)，同法洗滌。f. 用-射線閃爍計(jì)數(shù)儀分別測(cè)定各孔放射性。通常要求樣品孔和陽(yáng)性對(duì)照孔的放射性脈沖分別超過(guò)本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性為基準(zhǔn)，凡樣品孔與陰性孔放射性之比大于3的樣品定為陽(yáng)性。4、雜交瘤細(xì)胞的克隆化從原始孔中得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，可能來(lái)源于二個(gè)或多個(gè)雜交瘤細(xì)胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。另一方面，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（又稱亞克隆），也需要克隆化。另外，長(zhǎng)期液氮凍存

49、的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化，以檢測(cè)抗體分泌情況。通常在得到針對(duì)預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行2-3次克隆化，有時(shí)還需進(jìn)行多次。所謂克隆化是指使單個(gè)細(xì)胞無(wú)性繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán)體的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程?？寺』姆椒ê芏?，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS）分離法。這里介紹最簡(jiǎn)單也是使用最廣泛的前兩種方法。（1） 有限稀釋法材料：a. 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等；b. HT培養(yǎng)基；c. 活力強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞；d. 小鼠腹腔細(xì)胞。方法：a. 制備小鼠腹腔細(xì)胞。同“細(xì)胞融合”一節(jié)中的方法。b. 制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液

50、，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、15和50個(gè)細(xì)胞3中不同的稀釋度。c. 按每毫升加入5×104-1×105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。d. 每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個(gè)稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為0.5、3和10。e. 37、7.5% CO2濕潤(rùn)培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆即可檢測(cè)抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔，取上清作抗體檢測(cè)。f. 取抗體檢測(cè)陽(yáng)性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存。g. 本法中（b）、（c）、（d）也可簡(jiǎn)化為將計(jì)數(shù)后的雜交瘤細(xì)胞準(zhǔn)確地進(jìn)行系列稀釋，直至每毫

51、升含10個(gè)細(xì)胞，按每孔接種0.1ml細(xì)胞懸液，即每孔含1個(gè)細(xì)胞。（2） 軟瓊脂法材料：a. HT培養(yǎng)基（雙倍濃度）。b. 用0.15mol/L NaCl配制的2.0%瓊脂糖：稱取2.0g細(xì)胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4保存。c. 小鼠腹腔細(xì)胞。d. 滅菌平皿。e. 45水浴。f. 活力很好的雜交瘤細(xì)胞。方法：a. 在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層。b. 臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45水浴中溫育。c. 吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液

52、3ml，室溫10分鐘。d. 取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。e. 37、7.5%濕潤(rùn)培養(yǎng)7-14天；克隆生長(zhǎng)至2mm時(shí)，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)。f. 吸取上清，檢測(cè)抗體，陽(yáng)性孔可繼續(xù)克隆化，或擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。3、雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來(lái)，通常也稱為抗體檢測(cè)?？贵w檢測(cè)的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測(cè)方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡(jiǎn)便，便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯€(gè)樣品需要在短短幾個(gè)小時(shí)就報(bào)告結(jié)果，以便

53、決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測(cè)方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說(shuō)來(lái)，在融合之前就必須建立好抗體檢測(cè)方法，并克服可能存在的問(wèn)題。另一個(gè)重要問(wèn)題是抗體檢測(cè)方法所需要的“動(dòng)力學(xué)范圍”，即檢出背景以上的最強(qiáng)與最弱信號(hào)之比，依所用的檢測(cè)抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對(duì)純化的蛋白質(zhì)抗原的，100%的抗原參與反應(yīng)，一個(gè)陽(yáng)性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對(duì)細(xì)胞表面微量的蛋白抗原，檢測(cè)系統(tǒng)可能需要能測(cè)出微弱信號(hào)，則動(dòng)力學(xué)范圍至少應(yīng)為10：1，最好為100：1。另外，檢測(cè)方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預(yù)定的用途的影響。結(jié)合補(bǔ)體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性

54、反應(yīng)的檢測(cè)方法來(lái)選出。如需結(jié)合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A的檢測(cè)方法。下面簡(jiǎn)要介紹幾種常用的抗體檢測(cè)方法： 免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對(duì)底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。A、器材和試劑a. 包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調(diào)PH至9.6。Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至10

55、00ml。b. 洗滌緩沖液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。c. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。d. 酶反應(yīng)終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。e. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的

56、底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此一次不宜配制過(guò)多。f. 底物使用液：OPD底物使用液（測(cè)490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（測(cè)450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS底物使用液（測(cè)410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。g. 抗體對(duì)照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽(yáng)性血清。h. 抗原： 可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗原。淋巴細(xì)胞等懸液

57、。i. 酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo)SPA或其他類似試劑。j. 細(xì)胞固定液：-20丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20甲醇。k. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。l. 酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。m. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機(jī)等。B、 可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）a. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。b. 以50-100ul/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4過(guò)夜或37吸附2小時(shí)。c. 棄去孔內(nèi)的液體，同時(shí)用洗滌液洗3次，每次3-5分

58、鐘，拍干。d. 每孔加200ul封閉液4過(guò)夜或37封閉2小時(shí)；該步驟對(duì)于一些抗原，可省略。e. 洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可-20或4保存?zhèn)溆谩. 每孔加50-100ul待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；37孵育1-2小時(shí)；洗滌，拍干。g. 加酶標(biāo)第二抗體，每孔50-100ul，37孵育1-2小時(shí)，洗滌，拍干。h. 加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul，3710-30分鐘。i. 以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。j. 結(jié)果判定：以P/N2.1，或PN 3D為陽(yáng)性。若陰性對(duì)照孔無(wú)色或接近無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。C、 全菌抗原的EL