第2章基因組學(xué)

1、遺傳作圖基本概念1. 1. 遺傳作圖定義遺傳作圖定義 采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其他采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其他DNADNA順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。2. 2. 遺傳作圖的基本原理遺傳作圖的基本原理 隨機(jī)的染色體上兩個(gè)任意基因座越遠(yuǎn)，隨機(jī)的染色體上兩個(gè)任意基因座越遠(yuǎn)，它們?cè)饺菀妆蝗旧w斷裂所分離。它們?cè)饺菀妆蝗旧w斷裂所分離。3.3.遺傳圖距的單位遺傳圖距的單位 厘摩（厘摩（cMcM）: :每單位厘摩為每單位厘摩為1 1交換率交換率。 交換率（交換值、重組頻率）交換率（交換值、重組頻率）= = 減數(shù)分裂的重組產(chǎn)物減數(shù)分裂的重組產(chǎn)物/ /減數(shù)分裂的總產(chǎn)物減數(shù)分

2、裂的總產(chǎn)物4.4.遺傳作圖的主要方法遺傳作圖的主要方法 雜交實(shí)驗(yàn)、雜交實(shí)驗(yàn)、 家系分析家系分析2、物理作圖、物理作圖: 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)直接將應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)直接將DNA分子標(biāo)記、基因分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組的實(shí)際位置或克隆標(biāo)定在基因組的實(shí)際位置物理圖的距離物理圖的距離:依作圖方法而異依作圖方法而異,輻射雜種作圖的計(jì)算單位為厘鐳輻射雜種作圖的計(jì)算單位為厘鐳(cR);限制性片段作圖與克隆作圖的圖距單位為堿基對(duì)限制性片段作圖與克隆作圖的圖距單位為堿基對(duì)(bp) 分辨率低100kb理想的標(biāo)記密度，但是當(dāng)時(shí)的結(jié)果是只能到2-5Mb 覆蓋面較低 重組時(shí)間發(fā)生少的區(qū)域，高密度的連鎖圖難以完成

3、分子標(biāo)記的排列有時(shí)會(huì)出錯(cuò)：環(huán)境因素或者取樣誤差，導(dǎo)致的非隨機(jī)的群體組成。 共同之處：共同之處：確定基因或分子標(biāo)記在染色體上的排列位置。確定基因或分子標(biāo)記在染色體上的排列位置?；蚪M測(cè)序策略基因組測(cè)序策略v有了高密度的基因組圖譜，就可以開(kāi)始全有了高密度的基因組圖譜，就可以開(kāi)始全基因組測(cè)序了基因組測(cè)序了v測(cè)序的技術(shù)飛速發(fā)展，全自動(dòng)化測(cè)序的技術(shù)飛速發(fā)展，全自動(dòng)化v測(cè)序的策略有兩個(gè)：測(cè)序的策略有兩個(gè)： 鳥(niǎo)槍法鳥(niǎo)槍法 克隆重疊群法克隆重疊群法鳥(niǎo)槍法（鳥(niǎo)槍法（shotgun sequencing）鳥(niǎo)槍法的優(yōu)缺點(diǎn)鳥(niǎo)槍法的優(yōu)缺點(diǎn)v優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 不需要高密度的圖譜不需要高密度的圖譜 速度快、簡(jiǎn)單、成本低速度快、

4、簡(jiǎn)單、成本低v缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 拼接組裝困難，尤其在重復(fù)序列多的區(qū)域拼接組裝困難，尤其在重復(fù)序列多的區(qū)域v主要用于重復(fù)序列少、相對(duì)簡(jiǎn)單的原核生物基主要用于重復(fù)序列少、相對(duì)簡(jiǎn)單的原核生物基因組因組克隆重疊群法（克隆重疊群法（clone contig）v 將基因組將基因組DNADNA切割長(zhǎng)度為切割長(zhǎng)度為0.1Mb0.1Mb1Mb1Mb的的大片段，克隆到大片段，克隆到Y(jié)ACYAC或或BACBAC載體上載體上v 然后再進(jìn)行亞克隆，分別測(cè)定單個(gè)亞克然后再進(jìn)行亞克隆，分別測(cè)定單個(gè)亞克隆的序列隆的序列v 再裝配、連接成連續(xù)的再裝配、連接成連續(xù)的DNADNA分子。分子。v 這是一種自上而下（這是一種自上而下（up

5、 to downup to down）的測(cè)）的測(cè)序策略序策略 v clone-by-clone methodclone-by-clone method兩種基因組測(cè)序策略兩種基因組測(cè)序策略The E.coli genome基因標(biāo)記 孟德?tīng)?肉眼 豌豆植株高矮、豌豆顏色等 摩爾根 顯微鏡、肉眼 果蠅軀體顏色、翅膀形狀等 生化表型細(xì)菌、酵母遺傳學(xué)研究；人類中如血型系列（ABO）分析、血清蛋白和免疫蛋白遺傳作圖標(biāo)記基因標(biāo)記的缺點(diǎn)基因標(biāo)記的缺點(diǎn)高等生物，如脊椎動(dòng)物和顯花植物等，可用作標(biāo)記的基因十分有限，許多性狀都涉及多基因；高等生物基因組中存在大量的基因間隔區(qū)，純粹用基因作為標(biāo)記將在遺傳圖譜中留下大片的

6、無(wú)標(biāo)記區(qū)段；只有部分基因其等位基因成員可以通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)予以區(qū)分，因而產(chǎn)生的遺傳圖是不完整的，必需尋找其他有效的標(biāo)記；2. DNA分子標(biāo)記2.1 DNA 分子標(biāo)記作圖的優(yōu)點(diǎn): 不以表型為參照 直接檢測(cè)個(gè)體基因型組成 具有共顯性的特點(diǎn)2.2 分子標(biāo)記用于基因定位的發(fā)展史 基因定位最早采用的方法就是基因定位最早采用的方法就是連鎖分析連鎖分析。通過(guò)基因與通過(guò)基因與DNADNA標(biāo)記之間的重組率來(lái)估計(jì)基因標(biāo)記之間的重組率來(lái)估計(jì)基因的位置。的位置。 可用于連鎖分析的可用于連鎖分析的DNADNA標(biāo)志是基因定位的標(biāo)志是基因定位的基礎(chǔ)，基礎(chǔ)，DNADNA標(biāo)記越多，雜合性越強(qiáng)，基因定位標(biāo)記越多，雜合性越強(qiáng)，基因定位

7、就越方便。就越方便。DNADNA標(biāo)記的選擇經(jīng)歷了從標(biāo)記的選擇經(jīng)歷了從RFLPRFLP- -STRSTRSNPSNP等發(fā)展過(guò)程。等發(fā)展過(guò)程。PIC(polymorphic formation content)PIC(polymorphic formation content)多態(tài)性信息量多態(tài)性信息量: :某一標(biāo)記在群體中出現(xiàn)多態(tài)性的頻率。某一標(biāo)記在群體中出現(xiàn)多態(tài)性的頻率。RFLPRFLP- -限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性STRSTR- -簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù) 1-61-6個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸SNP-SNP-單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性RFLP,多態(tài)性不夠高，雜合性（多態(tài)性不夠高，雜合

8、性（PIC）平均達(dá)到）平均達(dá)到 0 .3，而且在染色體上分布不均勻，難以將一些罕見(jiàn)的基而且在染色體上分布不均勻，難以將一些罕見(jiàn)的基因進(jìn)行定位；對(duì)多基因病的定位也難以奏效。因進(jìn)行定位；對(duì)多基因病的定位也難以奏效。STR位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到8000個(gè)，平均個(gè)，平均 100kb200kb有有一個(gè)一個(gè) STR位點(diǎn)，雜合性（位點(diǎn)，雜合性（PIC）平均達(dá)到）平均達(dá)到 0 .7,這已經(jīng)使得連鎖分析的功能發(fā)揮到了極限。這已經(jīng)使得連鎖分析的功能發(fā)揮到了極限。SNP位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到數(shù)十萬(wàn)個(gè)，平均位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到數(shù)十萬(wàn)個(gè)，平均 1000bp有有一個(gè)一個(gè) ，估計(jì)，估計(jì)1700萬(wàn)個(gè)萬(wàn)個(gè)(40個(gè)人篩選結(jié)果）。個(gè)人篩選結(jié)果）。

9、(簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列,STRs ,simple tendem repeats)2.3 分子標(biāo)記pRFLP(restriction fragment length polymorphisms,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)RFLP的特征: 處于染色體上的位置相對(duì)固定; 同一親本及其子代相同位點(diǎn)上的多態(tài)性片段特征不變; 同一凝膠電泳可顯示不同多態(tài)性片段,具有共顯性特點(diǎn);人類基因組中有人類基因組中有105 個(gè)個(gè)RFLP位點(diǎn)，每一位點(diǎn)只有位點(diǎn)，每一位點(diǎn)只有兩兩個(gè)等位基因。個(gè)等位基因。vDNADNA序列能或不能被某一酶酶切，相當(dāng)于一對(duì)等序列能或不能被某一酶酶切，相當(dāng)于一對(duì)等位基因的差異。位基因的差

10、異。 v 如有兩個(gè)如有兩個(gè)DNADNA分子（一對(duì)染色體），一個(gè)具有某分子（一對(duì)染色體），一個(gè)具有某一種酶的酶切位點(diǎn)，而另一個(gè)沒(méi)有這個(gè)位點(diǎn)，酶一種酶的酶切位點(diǎn)，而另一個(gè)沒(méi)有這個(gè)位點(diǎn)，酶切后形成的切后形成的DNADNA片段長(zhǎng)度就有差異，即多態(tài)性。片段長(zhǎng)度就有差異，即多態(tài)性。v 可將可將RFLPRFLP作為標(biāo)記，定位在基因組中某一位置作為標(biāo)記，定位在基因組中某一位置上。上。v人類基因組中有人類基因組中有10105 5個(gè)個(gè)RFLPRFLP位點(diǎn)，每一位點(diǎn)只有位點(diǎn)，每一位點(diǎn)只有兩個(gè)等位基因。兩個(gè)等位基因。RFLPRFLP分析分析pSSLPs(Simple sequence length polymorph

11、isms, 簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性) SSLP 產(chǎn)生重復(fù)序列的可變排列,同一位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)不同,表現(xiàn)DNA序列長(zhǎng)度變化; 與RFLP 不同,具有多等位性; 小衛(wèi)星(minisatellite)和微衛(wèi)星(microsatellite)序列都可用于遺傳作圖,但微衛(wèi)星更普遍。v這種重復(fù)序列的重復(fù)單位很短，常常只有這種重復(fù)序列的重復(fù)單位很短，常常只有2 2個(gè)、個(gè)、3 3個(gè)或個(gè)或4 4個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸v如一條染色體如一條染色體TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGACGCCGC 另一染色體另一染色體TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACGCCGC，就構(gòu)成了就構(gòu)成了多

12、態(tài)性。多態(tài)性。SSR ，任何兩個(gè)人的微衛(wèi)星組合都不同，可以用來(lái)編制遺傳檔案pSNP(single nucleotide polymorphisms,單核苷酸多態(tài)性) 1996年，年，Lander報(bào)道了報(bào)道了SNP，制備第三代遺傳，制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。連鎖圖的遺傳標(biāo)記。 基因組中單個(gè)核苷酸的突變稱為點(diǎn)突變; 理論上每個(gè)單核苷酸位置最多只有4種形式,但某些群體特定的單核苷酸位置只有2個(gè)或3個(gè)SNP,這些位點(diǎn)稱為雙等位或三等位;不同人群僅有140萬(wàn)個(gè)核苷酸差異 ； 人基因組人基因組SNP與與疾病的關(guān)系，及藥物遺傳學(xué)。疾病的關(guān)系，及藥物遺傳學(xué)。 人基因組人基因組SNP有有1000萬(wàn)個(gè)，在基

13、因內(nèi)部是萬(wàn)個(gè)，在基因內(nèi)部是20萬(wàn)個(gè)，基萬(wàn)個(gè)，基因外部是其因外部是其10倍倍 在基因組編碼順序中，SNP大多位于密碼子的搖擺位置，表現(xiàn)為基因沉默而被大量保留下來(lái); 大多數(shù)SNP所在的位置不能被限制酶識(shí)別，必須采取測(cè)序或寡核苷酸雜交檢測(cè); SNP在基因組中的數(shù)量極大，二倍體細(xì)胞中每個(gè)SNP最多只有2種等位型。/SNP/index.html孟德?tīng)栠z傳學(xué)簡(jiǎn)介 等位基因隨機(jī)分離定律 獨(dú)立遺傳定律 完全連鎖 不完全連鎖 不完全顯性 共顯性遺傳作圖的方法 1865年 不完全顯性 雜合子表現(xiàn)為2個(gè)純合子的中間表型 共顯性：雜合子同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)等位基因的表型孟德

14、爾第一定律孟德?tīng)柕谝欢?等位基因隨機(jī)分離等位基因隨機(jī)分離(The Law of Segregation) AAaaAaF1ParentsF2AAaaAa1:2:1A:a=1:1孟德?tīng)柕诙擅系聽(tīng)柕诙?獨(dú)立分配定律獨(dú)立分配定律(the law of independent assortment) F1ParentsF2AaBb AB Ab aB ab 25% 25% 25% 25%AB(25%) Ab(25%)aB(25%)Ab(25%)AABB AABb AaBB AaBbAABb AAbb AaBb AabbAaBB AaBb aaBB aaBbAaBb Aabb aaBb aabb

15、A:a=1:1 B:b=1:1AABBaabb連鎖遺傳定律連鎖遺傳定律 F1ParentsF2AaBb AB Ab* aB* ab50% 0% 0% 50%AB(50%) Ab(0%)aB(0%)ab(50%)AABB - - AaBb - - - - - - - -AaBb - - aabbAABBaabb* 完全連鎖完全連鎖 AB Ab aB ab(25) (25) (25) (25)(50) (0) (0) (50) (48) (2) (2) (48)配子類型配子類型(%)獨(dú)立遺傳獨(dú)立遺傳孟德?tīng)柕诙擅系聽(tīng)柕诙赏耆B鎖完全連鎖不完全連鎖不完全連鎖連鎖遺傳定律連鎖遺傳定律根據(jù)重組率計(jì)

16、算遺傳距離根據(jù)重組率計(jì)算遺傳距離2. 連鎖分析連鎖發(fā)生的時(shí)期 減數(shù)分裂期,同源染色體復(fù)制后不分離雙價(jià)體重組 重組(recombination)或交換(crossing-over):在雙價(jià)體中,并列的同源染色體臂發(fā)生機(jī)械斷裂,彼此交換DNA區(qū)段,這一過(guò)程被稱為交換或重組.連鎖基因之間的交換連鎖基因之間的交換重組率繪制遺傳圖 重組率為測(cè)量基因之間相對(duì)距離的尺度.果果蠅蠅連連鎖鎖圖圖 近端粒區(qū)和遠(yuǎn)著絲粒區(qū)有較高的重組率; 如老鼠主要組織兼容性復(fù)合座位 (major histocompatibility complex,MHC) 含有一組控制免疫反應(yīng)的基因，其中一個(gè)區(qū)段的重組率高于平均數(shù)數(shù)百倍. 遺傳

17、圖的偏離重組熱點(diǎn)(recombination hot spot)：染色體的某些位點(diǎn)之間比其他位點(diǎn)之間有更高的交換率.遺傳圖的偏離重組熱點(diǎn)區(qū)域的特點(diǎn)： 均發(fā)生在基因E beta的第二個(gè)內(nèi)含子上，長(zhǎng)度4.3kb， 檢測(cè)到9/11的核苷酸共有序列，5 TGGAAATCCCC- 3， 性別之間也會(huì)表現(xiàn)重組率的差異 同一染色體發(fā)生多起交換的現(xiàn)象 當(dāng)多起交換發(fā)生在2個(gè)基因之間時(shí)，會(huì)產(chǎn)生距離減少的假象。 性別特異性的重組熱點(diǎn)，女性的長(zhǎng)于男性 最初的兩個(gè)性別符號(hào)來(lái)自于天文符號(hào)。1751年，卡爾林奈最早使用它們來(lái)表示植物的性別。1 上上 來(lái)自火星符號(hào)，表示男性或其他雄性生物。 下下 來(lái)自金星符號(hào)，表示女性或其他

18、雌性生物。 3. 不同模式生物的連鎖分析 連鎖分析的三大范疇: 有性雜交實(shí)驗(yàn) 系譜分析 DNA轉(zhuǎn)移 有性雜交實(shí)驗(yàn) 果蠅、老鼠、玉米、水稻 系譜分析 人類、單仔生殖的大生物，多年生木本 DNA轉(zhuǎn)移 不發(fā)生減數(shù)分裂的生物，病毒、細(xì)菌3.1 雜交實(shí)驗(yàn)的連鎖分析選擇已知基因型的親本獲得交配的子代設(shè)計(jì)雜交方案分析其表型及基因型 兩點(diǎn)雜交 RFLP連鎖圖 RFLP 作圖的程序 與經(jīng)典遺傳作圖類似,只是統(tǒng)計(jì)性狀改為DNA 分子標(biāo)記 程序：選擇已知基因型的親本 設(shè)計(jì)雜交方案 獲得交配的子代 分析其DNA分子標(biāo)記 共分離: 在有性繁殖的后代,假如基因附近有一緊密連鎖的分子標(biāo)記,在細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)分子標(biāo)記與基因之間由于相距太近很少有機(jī)會(huì)發(fā)生交換，那么這種分子標(biāo)記與連鎖的基因有最大的可能同時(shí)出現(xiàn)在同一個(gè)個(gè)體中，這種現(xiàn)象被稱為共分離 圖位克隆:從分子標(biāo)記連鎖圖中找到與靶基因位于同一連鎖群的分子標(biāo)記,然后再?gòu)耐贿B鎖群的分子標(biāo)記中檢測(cè)與靶基因接近的分子標(biāo)記,依次漸進(jìn),直至獲得最接近基因座的標(biāo)記為止.3.2 系譜分析作圖 人類樣品有限，借助統(tǒng)計(jì)學(xué)方