第2章基因組學

1、遺傳作圖基本概念1. 1. 遺傳作圖定義遺傳作圖定義 采用遺傳學分析方法將基因或其他采用遺傳學分析方法將基因或其他DNADNA順序標定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。順序標定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。2. 2. 遺傳作圖的基本原理遺傳作圖的基本原理 隨機的染色體上兩個任意基因座越遠，隨機的染色體上兩個任意基因座越遠，它們越容易被染色體斷裂所分離。它們越容易被染色體斷裂所分離。3.3.遺傳圖距的單位遺傳圖距的單位 厘摩（厘摩（cMcM）: :每單位厘摩為每單位厘摩為1 1交換率交換率。 交換率（交換值、重組頻率）交換率（交換值、重組頻率）= = 減數(shù)分裂的重組產(chǎn)物減數(shù)分裂的重組產(chǎn)物/ /減數(shù)分裂的總產(chǎn)物減數(shù)分

2、裂的總產(chǎn)物4.4.遺傳作圖的主要方法遺傳作圖的主要方法 雜交實驗、雜交實驗、 家系分析家系分析2、物理作圖、物理作圖: 應用分子生物學技術(shù)直接將應用分子生物學技術(shù)直接將DNA分子標記、基因分子標記、基因或克隆標定在基因組的實際位置或克隆標定在基因組的實際位置物理圖的距離物理圖的距離:依作圖方法而異依作圖方法而異,輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳(cR);限制性片段作圖與克隆作圖的圖距單位為堿基對限制性片段作圖與克隆作圖的圖距單位為堿基對(bp) 分辨率低100kb理想的標記密度，但是當時的結(jié)果是只能到2-5Mb 覆蓋面較低 重組時間發(fā)生少的區(qū)域，高密度的連鎖圖難以完成

3、分子標記的排列有時會出錯：環(huán)境因素或者取樣誤差，導致的非隨機的群體組成。 共同之處：共同之處：確定基因或分子標記在染色體上的排列位置。確定基因或分子標記在染色體上的排列位置?；蚪M測序策略基因組測序策略v有了高密度的基因組圖譜，就可以開始全有了高密度的基因組圖譜，就可以開始全基因組測序了基因組測序了v測序的技術(shù)飛速發(fā)展，全自動化測序的技術(shù)飛速發(fā)展，全自動化v測序的策略有兩個：測序的策略有兩個： 鳥槍法鳥槍法 克隆重疊群法克隆重疊群法鳥槍法（鳥槍法（shotgun sequencing）鳥槍法的優(yōu)缺點鳥槍法的優(yōu)缺點v優(yōu)點：優(yōu)點： 不需要高密度的圖譜不需要高密度的圖譜 速度快、簡單、成本低速度快、

4、簡單、成本低v缺點：缺點： 拼接組裝困難，尤其在重復序列多的區(qū)域拼接組裝困難，尤其在重復序列多的區(qū)域v主要用于重復序列少、相對簡單的原核生物基主要用于重復序列少、相對簡單的原核生物基因組因組克隆重疊群法（克隆重疊群法（clone contig）v 將基因組將基因組DNADNA切割長度為切割長度為0.1Mb0.1Mb1Mb1Mb的的大片段，克隆到大片段，克隆到Y(jié)ACYAC或或BACBAC載體上載體上v 然后再進行亞克隆，分別測定單個亞克然后再進行亞克隆，分別測定單個亞克隆的序列隆的序列v 再裝配、連接成連續(xù)的再裝配、連接成連續(xù)的DNADNA分子。分子。v 這是一種自上而下（這是一種自上而下（up

5、 to downup to down）的測）的測序策略序策略 v clone-by-clone methodclone-by-clone method兩種基因組測序策略兩種基因組測序策略The E.coli genome基因標記 孟德爾 肉眼 豌豆植株高矮、豌豆顏色等 摩爾根 顯微鏡、肉眼 果蠅軀體顏色、翅膀形狀等 生化表型細菌、酵母遺傳學研究；人類中如血型系列（ABO）分析、血清蛋白和免疫蛋白遺傳作圖標記基因標記的缺點基因標記的缺點高等生物，如脊椎動物和顯花植物等，可用作標記的基因十分有限，許多性狀都涉及多基因；高等生物基因組中存在大量的基因間隔區(qū)，純粹用基因作為標記將在遺傳圖譜中留下大片的

6、無標記區(qū)段；只有部分基因其等位基因成員可以通過常規(guī)試驗予以區(qū)分，因而產(chǎn)生的遺傳圖是不完整的，必需尋找其他有效的標記；2. DNA分子標記2.1 DNA 分子標記作圖的優(yōu)點: 不以表型為參照 直接檢測個體基因型組成 具有共顯性的特點2.2 分子標記用于基因定位的發(fā)展史 基因定位最早采用的方法就是基因定位最早采用的方法就是連鎖分析連鎖分析。通過基因與通過基因與DNADNA標記之間的重組率來估計基因標記之間的重組率來估計基因的位置。的位置。 可用于連鎖分析的可用于連鎖分析的DNADNA標志是基因定位的標志是基因定位的基礎(chǔ)，基礎(chǔ)，DNADNA標記越多，雜合性越強，基因定位標記越多，雜合性越強，基因定位

7、就越方便。就越方便。DNADNA標記的選擇經(jīng)歷了從標記的選擇經(jīng)歷了從RFLPRFLP- -STRSTRSNPSNP等發(fā)展過程。等發(fā)展過程。PIC(polymorphic formation content)PIC(polymorphic formation content)多態(tài)性信息量多態(tài)性信息量: :某一標記在群體中出現(xiàn)多態(tài)性的頻率。某一標記在群體中出現(xiàn)多態(tài)性的頻率。RFLPRFLP- -限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性STRSTR- -簡單串聯(lián)重復簡單串聯(lián)重復 1-61-6個核苷酸個核苷酸SNP-SNP-單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性RFLP,多態(tài)性不夠高，雜合性（多態(tài)性不夠高，雜合

8、性（PIC）平均達到）平均達到 0 .3，而且在染色體上分布不均勻，難以將一些罕見的基而且在染色體上分布不均勻，難以將一些罕見的基因進行定位；對多基因病的定位也難以奏效。因進行定位；對多基因病的定位也難以奏效。STR位點已經(jīng)達到位點已經(jīng)達到8000個，平均個，平均 100kb200kb有有一個一個 STR位點，雜合性（位點，雜合性（PIC）平均達到）平均達到 0 .7,這已經(jīng)使得連鎖分析的功能發(fā)揮到了極限。這已經(jīng)使得連鎖分析的功能發(fā)揮到了極限。SNP位點已經(jīng)達到數(shù)十萬個，平均位點已經(jīng)達到數(shù)十萬個，平均 1000bp有有一個一個 ，估計，估計1700萬個萬個(40個人篩選結(jié)果）。個人篩選結(jié)果）。

9、(簡單串聯(lián)重復序列簡單串聯(lián)重復序列,STRs ,simple tendem repeats)2.3 分子標記pRFLP(restriction fragment length polymorphisms,限制性片段長度多態(tài)性)RFLP的特征: 處于染色體上的位置相對固定; 同一親本及其子代相同位點上的多態(tài)性片段特征不變; 同一凝膠電泳可顯示不同多態(tài)性片段,具有共顯性特點;人類基因組中有人類基因組中有105 個個RFLP位點，每一位點只有位點，每一位點只有兩兩個等位基因。個等位基因。vDNADNA序列能或不能被某一酶酶切，相當于一對等序列能或不能被某一酶酶切，相當于一對等位基因的差異。位基因的差

10、異。 v 如有兩個如有兩個DNADNA分子（一對染色體），一個具有某分子（一對染色體），一個具有某一種酶的酶切位點，而另一個沒有這個位點，酶一種酶的酶切位點，而另一個沒有這個位點，酶切后形成的切后形成的DNADNA片段長度就有差異，即多態(tài)性。片段長度就有差異，即多態(tài)性。v 可將可將RFLPRFLP作為標記，定位在基因組中某一位置作為標記，定位在基因組中某一位置上。上。v人類基因組中有人類基因組中有10105 5個個RFLPRFLP位點，每一位點只有位點，每一位點只有兩個等位基因。兩個等位基因。RFLPRFLP分析分析pSSLPs(Simple sequence length polymorph

11、isms, 簡單序列長度多態(tài)性) SSLP 產(chǎn)生重復序列的可變排列,同一位點重復次數(shù)不同,表現(xiàn)DNA序列長度變化; 與RFLP 不同,具有多等位性; 小衛(wèi)星(minisatellite)和微衛(wèi)星(microsatellite)序列都可用于遺傳作圖,但微衛(wèi)星更普遍。v這種重復序列的重復單位很短，常常只有這種重復序列的重復單位很短，常常只有2 2個、個、3 3個或個或4 4個核苷酸個核苷酸v如一條染色體如一條染色體TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGACGCCGC 另一染色體另一染色體TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACGCCGC，就構(gòu)成了就構(gòu)成了多

12、態(tài)性。多態(tài)性。SSR ，任何兩個人的微衛(wèi)星組合都不同，可以用來編制遺傳檔案pSNP(single nucleotide polymorphisms,單核苷酸多態(tài)性) 1996年，年，Lander報道了報道了SNP，制備第三代遺傳，制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標記。連鎖圖的遺傳標記。 基因組中單個核苷酸的突變稱為點突變; 理論上每個單核苷酸位置最多只有4種形式,但某些群體特定的單核苷酸位置只有2個或3個SNP,這些位點稱為雙等位或三等位;不同人群僅有140萬個核苷酸差異 ； 人基因組人基因組SNP與與疾病的關(guān)系，及藥物遺傳學。疾病的關(guān)系，及藥物遺傳學。 人基因組人基因組SNP有有1000萬個，在基

13、因內(nèi)部是萬個，在基因內(nèi)部是20萬個，基萬個，基因外部是其因外部是其10倍倍 在基因組編碼順序中，SNP大多位于密碼子的搖擺位置，表現(xiàn)為基因沉默而被大量保留下來; 大多數(shù)SNP所在的位置不能被限制酶識別，必須采取測序或寡核苷酸雜交檢測; SNP在基因組中的數(shù)量極大，二倍體細胞中每個SNP最多只有2種等位型。/SNP/index.html孟德爾遺傳學簡介 等位基因隨機分離定律 獨立遺傳定律 完全連鎖 不完全連鎖 不完全顯性 共顯性遺傳作圖的方法 1865年 不完全顯性 雜合子表現(xiàn)為2個純合子的中間表型 共顯性：雜合子同時出現(xiàn)2個等位基因的表型孟德

14、爾第一定律孟德爾第一定律 等位基因隨機分離等位基因隨機分離(The Law of Segregation) AAaaAaF1ParentsF2AAaaAa1:2:1A:a=1:1孟德爾第二定律孟德爾第二定律 獨立分配定律獨立分配定律(the law of independent assortment) F1ParentsF2AaBb AB Ab aB ab 25% 25% 25% 25%AB(25%) Ab(25%)aB(25%)Ab(25%)AABB AABb AaBB AaBbAABb AAbb AaBb AabbAaBB AaBb aaBB aaBbAaBb Aabb aaBb aabb

15、A:a=1:1 B:b=1:1AABBaabb連鎖遺傳定律連鎖遺傳定律 F1ParentsF2AaBb AB Ab* aB* ab50% 0% 0% 50%AB(50%) Ab(0%)aB(0%)ab(50%)AABB - - AaBb - - - - - - - -AaBb - - aabbAABBaabb* 完全連鎖完全連鎖 AB Ab aB ab(25) (25) (25) (25)(50) (0) (0) (50) (48) (2) (2) (48)配子類型配子類型(%)獨立遺傳獨立遺傳孟德爾第二定律孟德爾第二定律完全連鎖完全連鎖不完全連鎖不完全連鎖連鎖遺傳定律連鎖遺傳定律根據(jù)重組率計

16、算遺傳距離根據(jù)重組率計算遺傳距離2. 連鎖分析連鎖發(fā)生的時期 減數(shù)分裂期,同源染色體復制后不分離雙價體重組 重組(recombination)或交換(crossing-over):在雙價體中,并列的同源染色體臂發(fā)生機械斷裂,彼此交換DNA區(qū)段,這一過程被稱為交換或重組.連鎖基因之間的交換連鎖基因之間的交換重組率繪制遺傳圖 重組率為測量基因之間相對距離的尺度.果果蠅蠅連連鎖鎖圖圖 近端粒區(qū)和遠著絲粒區(qū)有較高的重組率; 如老鼠主要組織兼容性復合座位 (major histocompatibility complex,MHC) 含有一組控制免疫反應的基因，其中一個區(qū)段的重組率高于平均數(shù)數(shù)百倍. 遺傳

17、圖的偏離重組熱點(recombination hot spot)：染色體的某些位點之間比其他位點之間有更高的交換率.遺傳圖的偏離重組熱點區(qū)域的特點： 均發(fā)生在基因E beta的第二個內(nèi)含子上，長度4.3kb， 檢測到9/11的核苷酸共有序列，5 TGGAAATCCCC- 3， 性別之間也會表現(xiàn)重組率的差異 同一染色體發(fā)生多起交換的現(xiàn)象 當多起交換發(fā)生在2個基因之間時，會產(chǎn)生距離減少的假象。 性別特異性的重組熱點，女性的長于男性 最初的兩個性別符號來自于天文符號。1751年，卡爾林奈最早使用它們來表示植物的性別。1 上上 來自火星符號，表示男性或其他雄性生物。 下下 來自金星符號，表示女性或其他

18、雌性生物。 3. 不同模式生物的連鎖分析 連鎖分析的三大范疇: 有性雜交實驗 系譜分析 DNA轉(zhuǎn)移 有性雜交實驗 果蠅、老鼠、玉米、水稻 系譜分析 人類、單仔生殖的大生物，多年生木本 DNA轉(zhuǎn)移 不發(fā)生減數(shù)分裂的生物，病毒、細菌3.1 雜交實驗的連鎖分析選擇已知基因型的親本獲得交配的子代設(shè)計雜交方案分析其表型及基因型 兩點雜交 RFLP連鎖圖 RFLP 作圖的程序 與經(jīng)典遺傳作圖類似,只是統(tǒng)計性狀改為DNA 分子標記 程序：選擇已知基因型的親本 設(shè)計雜交方案 獲得交配的子代 分析其DNA分子標記 共分離: 在有性繁殖的后代,假如基因附近有一緊密連鎖的分子標記,在細胞減數(shù)分裂時分子標記與基因之間由于相距太近很少有機會發(fā)生交換，那么這種分子標記與連鎖的基因有最大的可能同時出現(xiàn)在同一個個體中，這種現(xiàn)象被稱為共分離 圖位克隆:從分子標記連鎖圖中找到與靶基因位于同一連鎖群的分子標記,然后再從同一連鎖群的分子標記中檢測與靶基因接近的分子標記,依次漸進,直至獲得最接近基因座的標記為止.3.2 系譜分析作圖 人類樣品有限，借助統(tǒng)計學方