微生物的生長繁殖與生存因子

1、在微生物學(xué)中提到的在微生物學(xué)中提到的“生長生長”，一般均指群體生長，這一點與，一般均指群體生長，這一點與 研究大生物時有所不同。研究大生物時有所不同。 細菌太小，往往討論其群體生長。細菌太小，往往討論其群體生長。用于培養(yǎng)微生物的搖床一般搖床都可以控制轉(zhuǎn)速和溫度一條典型的生長曲線至少可以分為一條典型的生長曲線至少可以分為 遲緩期遲緩期，對數(shù)期對數(shù)期，穩(wěn)定期穩(wěn)定期和和衰亡期衰亡期等四個生長時期等四個生長時期 生產(chǎn)上延長穩(wěn)定期的方法：生產(chǎn)上延長穩(wěn)定期的方法： 補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）或取走代謝產(chǎn)物；補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）或取走代謝產(chǎn)物； 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)溫度；、調(diào)節(jié)溫度； 對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩對

2、好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩（二）連續(xù)培養(yǎng)（二）連續(xù)培養(yǎng)dN dt=N 菌數(shù)增加速率菌數(shù)增加速率dN dt=DN 菌數(shù)減少速率菌數(shù)減少速率一般用于菌體以及與菌體生長平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)一般用于菌體以及與菌體生長平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè) 縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率；縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率； 便于自動控制；便于自動控制； 降低動力消耗及體力勞動強度；降低動力消耗及體力勞動強度； 產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；雜菌污染和菌種退化雜菌污染和菌種退化生物反應(yīng)器（用于微生物的連續(xù)培養(yǎng)或分批培養(yǎng)，可以控制溫度、溶解氧、pH等多項指標）以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定以數(shù)量變化對微生物生

3、長情況進行測定 以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定 同一稀釋度三個以上重復(fù)同一稀釋度三個以上重復(fù),取平均值；取平均值； 每支移液管及涂布棒只能接觸一個每支移液管及涂布棒只能接觸一個 稀釋度的菌液；稀釋度的菌液； 樣品充分混勻；樣品充分混勻；每個平板上的菌落數(shù)目合適，便于每個平板上的菌落數(shù)目合適，便于 準確計數(shù)；準確計數(shù)； 要求：要求：每每ml活菌數(shù)同一稀釋度平均數(shù)活菌數(shù)同一稀釋度平均數(shù)稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)5 注意：要三個以上重復(fù)平板平均計數(shù)；不適合絲狀菌注意：要三個以上重復(fù)平板平均計數(shù)；不適合絲狀菌以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測定以數(shù)量變化對微生物生長情況進行測

4、定 每每ml原液含菌數(shù)每小格平均菌數(shù)原液含菌數(shù)每小格平均菌數(shù)400 1000 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)以生物量為指標測定微生物的生長以生物量為指標測定微生物的生長 測定多細胞及絲狀真菌生長情況的有效方法測定多細胞及絲狀真菌生長情況的有效方法 以生物量為指標測定微生物的生長以生物量為指標測定微生物的生長 以生物量為指標測定微生物的生長以生物量為指標測定微生物的生長 環(huán)境對生長影響環(huán)境對生長影響 葉狀地衣 （南極石耳） 殼狀地衣 （南極中國長城站海邊崖巖上的地衣群落） 殼狀地衣 （南極麗石黃衣，紅色和赤星衣，米黃色） 殼狀地衣 （南極的癭茶漬衣）寄生型的放線菌照片寄生型的放線菌照片金黃色葡萄球菌的生長為本

5、來在平板上不能生長的嗜血流感菌金黃色葡萄球菌的生長為本來在平板上不能生長的嗜血流感菌 提供生長因子，后者在其菌苔周圍形成衛(wèi)星菌落。提供生長因子，后者在其菌苔周圍形成衛(wèi)星菌落。l 性狀穩(wěn)定的菌種是微生物工作最性狀穩(wěn)定的菌種是微生物工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進行。都無法正常進行。l 影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素： a a）變異；）變異；b b）污染；）污染；c c）死亡）死亡 菌種衰退（菌種衰退（degenerationdegeneration）是指由于自）是指由于自發(fā)突變的結(jié)果，而使某物種原有的一系列發(fā)突變的結(jié)果，而使某

6、物種原有的一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。 純菌種純菌種自發(fā)突變自發(fā)突變突變個體突變個體傳代增殖傳代增殖原始個體原始個體不純菌種不純菌種衰退菌種衰退菌種l 菌落和細胞形態(tài)改變菌落和細胞形態(tài)改變l 生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少l 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降，即出現(xiàn)負突變代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降，即出現(xiàn)負突變l 致病菌對宿主侵染能力下降致病菌對宿主侵染能力下降l 對外界不良條件的抵抗能力下降等對外界不良條件的抵抗能力下降等l 基因突變基因突變主要原因主要原因 1 1、有關(guān)基因發(fā)生負突變導(dǎo)致菌種衰退、有關(guān)基因發(fā)生負突變導(dǎo)致菌種衰退 2 2、表型

7、延遲造成菌種衰退、表型延遲造成菌種衰退 3 3、質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退、質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退l 連續(xù)傳代連續(xù)傳代加速衰退加速衰退l 不適宜的培養(yǎng)和保藏條件不適宜的培養(yǎng)和保藏條件加速衰退加速衰退l 控制傳代次數(shù)控制傳代次數(shù)l 創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件l 利用不易衰退的細胞移種傳代利用不易衰退的細胞移種傳代l 采用有效的菌種保藏方法采用有效的菌種保藏方法l 講究菌種選育技術(shù)講究菌種選育技術(shù)l 定期進行分離純化定期進行分離純化n 狹義的復(fù)壯狹義的復(fù)壯消極的措施消極的措施 是指在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過純是指在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標，從已種

8、分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。n 廣義的復(fù)壯廣義的復(fù)壯積極的措施積極的措施 是指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰是指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個狀測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個體。體。 菌落純（菌落純（“菌種純菌種純”）細胞純（細胞純（“菌株純菌株純”） 通過純種分離通過純種分離, ,可將衰退菌種細胞群體可將

9、衰退菌種細胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細胞分離中一部分仍保持原有典型性狀的單細胞分離出來出來, ,經(jīng)擴大培養(yǎng)經(jīng)擴大培養(yǎng), ,就可恢復(fù)原菌株的典型性就可恢復(fù)原菌株的典型性狀。狀。n 菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達到便于研究、亡、不變異、不被污染，以達到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。交換和使用等諸方面的需要。n 該法是將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例分該法是將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例分裝于小試管中，砂土的高度約裝于小試管中，砂土

10、的高度約1cm1cm，121121蒸汽滅菌蒸汽滅菌1 11.5h1.5h，間歇滅菌，間歇滅菌3 3次。次。5050烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。將烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。將待保藏的菌株制成菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線待保藏的菌株制成菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約中抽真空約2 24h4h，用火焰熔封管口，用火焰熔封管口( (或用石蠟封口或用石蠟封口) )，置，置于干燥器中，在室溫或于干燥器中，在室溫或44冰箱內(nèi)保藏。冰箱內(nèi)保藏。 n 此法適用于各大類微生物。此法適用于各大類微生物。n

11、 此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有 保護劑，保藏期一般長達保護劑，保藏期一般長達5 51515年，存活率高，年，存活率高， 變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的 保藏方法。保藏方法。n 該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍 干機等設(shè)備。干機等設(shè)備。ATCCATCC采用的兩種保藏方法的優(yōu)點示意圖采用的兩種保藏方法的優(yōu)點示意圖培養(yǎng)物培養(yǎng)物純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物混合培養(yǎng)物混合培養(yǎng)物純培養(yǎng)能較好地得到重復(fù)結(jié)果純培養(yǎng)能較好地得到重復(fù)結(jié)果 ， 是微生物研究的重要技術(shù)之一是微生物

12、研究的重要技術(shù)之一分離、轉(zhuǎn)接、純化時防止其他微生物污染的技術(shù)分離、轉(zhuǎn)接、純化時防止其他微生物污染的技術(shù)微生物培養(yǎng)常用器皿及滅菌微生物培養(yǎng)常用器皿及滅菌 接種操作，最基本技術(shù)接種操作，最基本技術(shù)無菌操作臺無菌操作臺火焰旁無菌區(qū)火焰旁無菌區(qū)各種菌落各種菌落一、微生物的分離和純培養(yǎng)一、微生物的分離和純培養(yǎng)菌落菌落(colony)：單個微生物在固體單個微生物在固體 培養(yǎng)基或內(nèi)層）生長繁殖形成肉眼培養(yǎng)基或內(nèi)層）生長繁殖形成肉眼 可見的，有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞可見的，有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞 生長群體。生長群體。 菌落連成片為菌苔（菌落連成片為菌苔（lawn）不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般

13、都具有穩(wěn)定的特征不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征 （形狀、顏色形狀、顏色等等），是微生物分類、鑒定的重要依據(jù)），是微生物分類、鑒定的重要依據(jù)。同一細菌在不同的培養(yǎng)平板上形成不同的特征菌落同一細菌在不同的培養(yǎng)平板上形成不同的特征菌落 常用固體分離純培養(yǎng)方法：常用固體分離純培養(yǎng)方法： 稀釋平板法稀釋平板法常用固體分離純培養(yǎng)方法：常用固體分離純培養(yǎng)方法： 涂布平板法涂布平板法平板劃線分離平板劃線分離一、微生物的分離和純培養(yǎng)一、微生物的分離和純培養(yǎng)厭氧罐厭氧罐厭氧手套箱厭氧手套箱有些微生物有些微生物液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)，原生動物、藻類。分離純培養(yǎng)，原生動物、藻

14、類。 方法稀釋法：方法稀釋法： 接種物在液體培養(yǎng)基中順序稀釋，高度稀釋，每個試接種物在液體培養(yǎng)基中順序稀釋，高度稀釋，每個試管中分配不到一個。若稀釋后同一梯度的平行試管中大管中分配不到一個。若稀釋后同一梯度的平行試管中大多數(shù)（多數(shù)（95）沒有，那么有微生物的可能是純培養(yǎng)，）沒有，那么有微生物的可能是純培養(yǎng)，否則可能性下降。否則可能性下降。單細胞（單孢子）顯微分離：單細胞（單孢子）顯微分離：選擇培養(yǎng)分離方法：選擇培養(yǎng)分離方法：選擇培養(yǎng)分離方法：選擇培養(yǎng)分離方法：待分離的微生物生長，其它微生物的生長被抑制待分離的微生物生長，其它微生物的生長被抑制選擇培養(yǎng)分離方法：選擇培養(yǎng)分離方法：富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)

15、 特定的環(huán)境條件特定的環(huán)境條件僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加從自然界中分離到所需的特定微生物從自然界中分離到所需的特定微生物根據(jù)微生物的特殊要求，從自然界分離出特定已知微生物種類；根據(jù)微生物的特殊要求，從自然界分離出特定已知微生物種類；分離培養(yǎng)在特定環(huán)境中能生長的微生物；分離培養(yǎng)在特定環(huán)境中能生長的微生物；富集培養(yǎng)富集培養(yǎng) 普通顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖普通顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖顯微鏡種類和原理：顯微鏡種類和原理：目鏡：目鏡：10 15 ；物鏡：；物鏡： 100 ；總放大倍數(shù)；總放大倍數(shù)10001500 ； 如何

16、實現(xiàn)光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)？其原理？如何實現(xiàn)光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)？其原理？使用油鏡，即在使用油鏡，即在100 物鏡和載玻片之間滴加香柏油；物鏡和載玻片之間滴加香柏油； 香柏油與玻璃折射率相近香柏油與玻璃折射率相近分辨率與所用波長成反比！分辨率與所用波長成反比！分辨率與所用波長成反比！分辨率與所用波長成反比！空氣（空氣（n=1.0）、水（）、水（n=1.33）、香柏油（）、香柏油（n=1.52）顯微觀察時可根據(jù)物鏡的特性而選用不同的介質(zhì)顯微觀察時可根據(jù)物鏡的特性而選用不同的介質(zhì) 光線在穿過折射率不同的介質(zhì)時發(fā)生折射光線在穿過折射率不同的介質(zhì)時發(fā)生折射 很多原來由于在透鏡及載

17、片表面的反射和折射而損失的很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的 光線可以進入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。光線可以進入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。活細菌在普通顯微鏡下是透明，觀察不清，采用暗活細菌在普通顯微鏡下是透明，觀察不清，采用暗視野顯微鏡，如：黑夜看星星就很清楚。視野顯微鏡，如：黑夜看星星就很清楚。 暗視野顯微鏡結(jié)構(gòu)與照明示意圖暗視野顯微鏡結(jié)構(gòu)與照明示意圖特殊聚光器實現(xiàn)斜射照明，給樣品照明的光線不直接特殊聚光器實現(xiàn)斜射照明，給樣品照明的光線不直接穿過物鏡，而經(jīng)樣品反射或折射后進入物鏡，使樣品穿過物鏡，而經(jīng)樣品反射或折射后進入物鏡，使樣品與背景差別大，可以清楚看到

18、透明微小顆粒。用于：與背景差別大，可以清楚看到透明微小顆粒。用于：生活細菌運動性觀察。生活細菌運動性觀察。光線透過透明標本，光線透過透明標本，波長（顏色）波長（顏色）和和振幅（亮度）振幅（亮度）沒有多大變化，用普通顯微鏡觀察透明標本，其形態(tài)沒有多大變化，用普通顯微鏡觀察透明標本，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)難以分辨。細胞各部分折射率和厚度不同，和內(nèi)部結(jié)構(gòu)難以分辨。細胞各部分折射率和厚度不同，當(dāng)光線通過時，直射光和衍射光光程有差別，而人眼當(dāng)光線通過時，直射光和衍射光光程有差別，而人眼看不到，但是可通過相差顯微鏡看到?？床坏?，但是可通過相差顯微鏡看到。 相差顯微鏡相差顯微鏡采用特殊光學(xué)裝置：采用特殊光學(xué)裝置：

19、環(huán)狀光闌環(huán)狀光闌和和相差板相差板，利用光的干涉，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢姷恼穹霉獾母缮?，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢姷恼穹睿靼担?，使能不染色而看到活細胞及細胞?nèi)的某差（明暗），使能不染色而看到活細胞及細胞內(nèi)的某些顯微結(jié)構(gòu)。其發(fā)明人些顯微結(jié)構(gòu)。其發(fā)明人F.Zernike因此獲因此獲1953年諾貝爾年諾貝爾物理獎。物理獎。熒光素吸收熒光素吸收uv放出波長較長的可見光，因此在放出波長較長的可見光，因此在uv照射下，照射下，發(fā)熒光的物體會在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體，為熒發(fā)熒光的物體會在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體，為熒光顯微技術(shù)原理。在免疫學(xué)和分子生物學(xué)應(yīng)用廣泛。光顯微技術(shù)原理。在免疫學(xué)和分子

20、生物學(xué)應(yīng)用廣泛。用波長短的電磁波取代可見光，用波長短的電磁波取代可見光，使分辨率提高。使分辨率提高。 工作原理類似，因光源不同，有工作原理類似，因光源不同，有區(qū)別區(qū)別: 電子若遇空氣中分子會發(fā)生偏轉(zhuǎn)電子若遇空氣中分子會發(fā)生偏轉(zhuǎn)使物象不清楚，因此鏡筒高真空使物象不清楚，因此鏡筒高真空 2)電子帶電荷，電鏡是用電磁圈電子帶電荷，電鏡是用電磁圈使之聚焦使之聚焦 3)電子像人眼看不到，用熒光屏電子像人眼看不到，用熒光屏顯示或感光膠片記錄顯示或感光膠片記錄大腸桿菌大腸桿菌 透射電子顯微鏡圖透射電子顯微鏡圖掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖大腸桿菌掃描電鏡圖二、顯微鏡和顯微技術(shù)二、顯微鏡和顯微

21、技術(shù)工作原理與光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡不同，是電子束掃描，激工作原理與光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡不同，是電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標本表面立體形貌有關(guān)。發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標本表面立體形貌有關(guān)。電子經(jīng)探測器收集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于電子經(jīng)探測器收集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。熒光屏上。 主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)80年代出現(xiàn)的，原理：利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。年代出現(xiàn)的，原理：利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)。 其橫向分辨率：其橫向分辨率：0.10.2nm，縱向分辨率：，縱向分辨率：0.001nm 這種分辨率足以對單個原子觀察。這種分辨率足以對單個原子觀察。 利用這種顯微鏡直接觀察蛋白質(zhì)、利用這種顯微鏡直接觀察蛋白質(zhì)、DNA、RNA等以及等以及CM、virus等結(jié)構(gòu)。等結(jié)構(gòu)。 廚房抹布上的細菌和霉菌廚房抹布上的細菌和霉菌棉纖維上的汗垢棉纖維上的汗垢掃描隧道顯微鏡下的掃描隧道顯微鏡下的DNA樣品好壞直接影響觀察結(jié)果。樣品好壞直接影響觀察結(jié)果。 考慮因素：根據(jù)所用顯微鏡特點采用合適制樣考慮因素：根據(jù)所用顯微鏡特點采用合適制樣方法，盡可能使樣品生理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，采用各種方法，盡可能使樣