人工誘發(fā)單倍體及其應(yīng)用

1、第一節(jié)第一節(jié) 植物單倍體概念及人工植物單倍體概念及人工誘發(fā)單倍體的應(yīng)用誘發(fā)單倍體的應(yīng)用二倍體(diploid )植物其單倍體（haploid）即一倍體（monoploid ）如， 玉米 2n = 2x = 20 n= x = 10； 水稻 2n = 2x = 24 n= x = 12四倍體(tetraploid)植物其haploid為dihaploid如，馬鈴薯 2n = 4x = 48， n = 2x = 24六倍體(hexaploid)植物其haploid為triploid 如，普通小麥2n = 6x = 42， n = 3x = 21八倍體(octoploid)植物其haploid為te

2、traploid如，草莓 2n = 8x = 56 ，n = 4x = 28單倍體單倍體(haploid)指具有配子體（gametophyte）染色體數(shù)的孢子體(植物個體)(sporophyte)。 一、一、 植物單倍體與人工誘發(fā)單倍體的應(yīng)用植物單倍體與人工誘發(fā)單倍體的應(yīng)用人工誘發(fā)單倍體（人工誘發(fā)單倍體（artificial induced haploid）單倍體細(xì)胞在人工離體條件下培養(yǎng)，使其單性發(fā)育成植物體。人工誘發(fā)單倍體的方法： 組織和細(xì)胞離體培養(yǎng) 遠(yuǎn)緣雜交 體細(xì)胞染色體消失 異質(zhì)體 孿生苗1. 半配合和輻射等 一、一、 植物單倍體與人工誘發(fā)單倍體的應(yīng)用植物單倍體與人工誘發(fā)單倍體的應(yīng)用單倍

3、體的優(yōu)點(diǎn)：單倍體的優(yōu)點(diǎn)：1. 單倍體的每個染色體組都是單的，加倍后，由不育單倍體的每個染色體組都是單的，加倍后，由不育變可育，快速純合；變可育，快速純合；2. 單倍體每一種基因都只有一個，在單倍體內(nèi)，每個單倍體每一種基因都只有一個，在單倍體內(nèi)，每個基因都能發(fā)揮自己對性狀發(fā)育的作用，不再區(qū)分基基因都能發(fā)揮自己對性狀發(fā)育的作用，不再區(qū)分基因的顯隱性，是研究基因性質(zhì)及作用的優(yōu)良材料；因的顯隱性，是研究基因性質(zhì)及作用的優(yōu)良材料；3. 異源多倍體的各個染色體組之間并不是絕對異源的異源多倍體的各個染色體組之間并不是絕對異源的，一些染色體組間的染色體可能存在部分同源的關(guān)，一些染色體組間的染色體可能存在部分同

4、源的關(guān)系，對研究物種起源和進(jìn)化有幫助。系，對研究物種起源和進(jìn)化有幫助。二、二、 植物單倍體在植物遺傳育種中的應(yīng)用植物單倍體在植物遺傳育種中的應(yīng)用應(yīng)用：應(yīng)用：1. 利用單倍體植物控制雜種分離，加快常規(guī)育種速度利用單倍體植物控制雜種分離，加快常規(guī)育種速度；2. 排除顯隱性基因的干擾，提高育種的選擇效率；排除顯隱性基因的干擾，提高育種的選擇效率；3. 遺傳分析；遺傳分析；4. 物種進(jìn)化研究。物種進(jìn)化研究。二、二、 植物單倍體在植物遺傳育種中的應(yīng)用植物單倍體在植物遺傳育種中的應(yīng)用第二節(jié)第二節(jié) 花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)一、一、 概述概述概念概念 花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng): :把發(fā)育到一定階段的花藥接種在把發(fā)育到一定階段

5、的花藥接種在人工培養(yǎng)基上人工培養(yǎng)基上, ,使其發(fā)育和分化成為植株的使其發(fā)育和分化成為植株的過程過程. .花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)是獲花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)是獲是植物是植物單倍體單倍體的有效方法之一的有效方法之一 體細(xì)胞染色體數(shù)體細(xì)胞染色體數(shù)減半減半；單倍體植物與二倍體相比較，有三個明顯的特點(diǎn)：單倍體植物與二倍體相比較，有三個明顯的特點(diǎn)： 生長發(fā)育生長發(fā)育弱弱，體形，體形小小、各器官明顯、各器官明顯減小減??； 雌雄配子嚴(yán)重雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮龜∮械纳踔敛荒苓M(jìn)入有性，有的甚至不能進(jìn)入有性 世代。世代。 （二）花藥或花粉培養(yǎng)在作物育種中的作用：（二）花藥或花粉培養(yǎng)在作物育種中的作用：供體植株小孢子（N）花粉培

6、養(yǎng)花粉植株（N）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株（2N）（1 1）縮短育種年限：常規(guī)育種需）縮短育種年限：常規(guī)育種需4-64-6年獲得純年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需系，而小孢子培養(yǎng)僅需1-21-2年。年。一年內(nèi)獲得純系例：例：二倍體供體植株基因型為二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中，若要從后代中選擇基因?yàn)檫x擇基因?yàn)锳Abb的純合單株的純合單株常規(guī)方法：常規(guī)方法： AAbb出現(xiàn)的概率為出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能，并且不能將將AAbb與與Aabb、aAbb區(qū)分開。區(qū)分開。（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBba

7、BaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb例：例：二倍體供體植株基因型為二倍體供體植株基因型為AaBbAaBb，若要從后代中，若要從后代中選擇基因?yàn)檫x擇基因?yàn)锳AbbAAbb的純合單株的純合單株單倍體方法：單倍體方法： AAbbAAbb出現(xiàn)的概率為出現(xiàn)的概率為1/41/4。 單倍體單倍體 二倍體二倍體AB- - AABBaB- aaBBAb- AAbbab- - aabb供體親本供體親本AaBb花粉花粉培養(yǎng)培養(yǎng)（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率 植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能植株不受顯隱性的影響，在

8、誘變育種中能在當(dāng)代及時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的在當(dāng)代及時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。利于篩選隱性突變體純系。利于篩選隱性突變體 提高誘變效率。提高誘變效率。（3 3）誘變育種中的作用）誘變育種中的作用（4 4） 利于獲得優(yōu)良植株利于獲得優(yōu)良植株 如：蘆筍全雄系的培育如：蘆筍全雄系的培育（5 5）用作基礎(chǔ)研究的各個領(lǐng)域）用作基礎(chǔ)研究的各個領(lǐng)域花花藥藥的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)及及花花粉粉管管的的形形成成花藥的結(jié)構(gòu)及花粉粒的發(fā)育2NN減數(shù)分裂 四分體 4個單核花粉粒（細(xì)胞壁薄、細(xì)胞質(zhì)濃、核位于細(xì)胞中央） 營養(yǎng)細(xì)胞（大） 單核花粉粒（單核靠邊期） （兩者僅以質(zhì)膜相隔） 精細(xì)胞 生殖細(xì)胞（?。?有絲分

9、裂 （2-細(xì)胞花粉粒） 精細(xì)胞 (3-細(xì)胞花粉粒）N雙核早期（三）花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑（三）花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑 1、A途徑途徑 小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞 （1）A-V途徑途徑 由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （2）A-G途徑途徑 由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （3）A-VG途徑（途徑（E途徑）途徑） 由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體 （4）C途徑途徑 營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通

10、過核融合，營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過核融合，形成多倍體植株形成多倍體植株2、B途徑途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分小孢子第一次有絲分裂為均等分裂裂，形成大小相近的兩個細(xì)胞。然后由這，形成大小相近的兩個細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞連續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核兩細(xì)胞連續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株。融合形成多倍體植株。（三）花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑（三）花藥和花粉培養(yǎng)中雄核發(fā)育的途徑（四）花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)的異同點(diǎn)（四）花藥培養(yǎng)與花粉培養(yǎng)的異同點(diǎn) 培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株。 花藥培養(yǎng)屬于花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于；而花粉培養(yǎng)屬于

11、細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)。 花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾，單倍體產(chǎn)量高。花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾，單倍體產(chǎn)量高。（一）研究歷史：首先報(bào)道通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株成功的是印度學(xué)者Guha和Maheshwari (1964, 1966)。 1996年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,已有至少250多種植物花藥培養(yǎng)成功。 花藥培養(yǎng)獲得單倍體的技術(shù)途徑已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育種中廣泛應(yīng)用。二、二、 花藥培養(yǎng)技術(shù)花藥培養(yǎng)技術(shù)（二）花藥培養(yǎng)的基本程序是（二）花藥培養(yǎng)的基本程序是：外植體選擇消毒剝?nèi)』ㄋ幗臃N誘導(dǎo)培養(yǎng)植株再生q外植體的選擇：供試材料的遺傳背景，供試材料的生理狀態(tài)，花粉的發(fā)育時期等。 四分體 4個單核花粉

12、粒（細(xì)胞壁薄、細(xì)胞質(zhì)濃、核位于細(xì)胞中央） 營養(yǎng)細(xì)胞（大） 單核花粉粒（單核靠邊期） （兩者僅以質(zhì)膜相隔） 精細(xì)胞 生殖細(xì)胞（?。?有絲分裂 （2-細(xì)胞花粉粒） 精細(xì)胞 (3-細(xì)胞花粉粒）N雙核早期 選擇花藥時，一般通過鏡檢來確定其中的花粉選擇花藥時，一般通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。是否處于適宜的發(fā)育期。 最常用的方法有最常用的方法有醋酸洋紅法醋酸洋紅法。但是，某些植物。但是，某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色，需采用的花粉細(xì)胞核不易著色，需采用焙花青焙花青- -鉻礬法鉻礬法，這種方法能將花粉細(xì)胞核染成這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色藍(lán)黑色。（二）花藥培養(yǎng)的基本程序是：（二）花藥培養(yǎng)

13、的基本程序是：外植體選擇消毒外植體選擇消毒剝?nèi)』ㄋ巹內(nèi)』ㄋ幗臃N接種誘導(dǎo)培誘導(dǎo)培養(yǎng)養(yǎng)植株再生植株再生q花藥的剝?nèi)。夯ㄋ幍膭內(nèi)。罕苊饣ㄋ幨艿綋p傷，因?yàn)閾p傷常會刺激花藥壁組避免花藥受到損傷，因?yàn)閾p傷常會刺激花藥壁組織的發(fā)育，形成二倍體的愈傷組織。織的發(fā)育，形成二倍體的愈傷組織。p花藥預(yù)處理花藥預(yù)處理 大量試驗(yàn)結(jié)果表明，花藥培養(yǎng)前給予一大量試驗(yàn)結(jié)果表明，花藥培養(yǎng)前給予一定的低溫處理是十分必要的。定的低溫處理是十分必要的。q 花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基：花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基： N6：高硝態(tài)氮，低銨態(tài)氮，廣泛用于禾本科植物：高硝態(tài)氮，低銨態(tài)氮，廣泛用于禾本科植物的花藥培養(yǎng)的花藥培養(yǎng) B5、MS、Whit

14、e、Nitch 等。等。 C17（王培等，（王培等，1986）：適于小麥花藥培養(yǎng)，提高）：適于小麥花藥培養(yǎng)，提高 出愈率。出愈率。激素激素：相對較低的激素水平：相對較低的激素水平蔗糖蔗糖：一般：一般2-3%，高濃度對禾谷類較有利，高濃度對禾谷類較有利 番茄花藥培養(yǎng)對蔗糖濃度的誘導(dǎo)反應(yīng)蔗糖濃度 2 3 4 6 10 13 17誘導(dǎo)頻率 5 10 12 18 25 45 8q培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件溫度和光照：溫度和光照：第三節(jié)第三節(jié) 花藥培養(yǎng)注意的問題花藥培養(yǎng)注意的問題1. 材料選擇（基因型；生理狀態(tài)；光照；花材料選擇（基因型；生理狀態(tài)；光照；花藥發(fā)育時期）藥發(fā)育時期）2. 預(yù)處理：如低溫冷藏預(yù)處理：如

15、低溫冷藏3. 材料滅菌材料滅菌4. 花粉植株誘導(dǎo)花粉植株誘導(dǎo)花藥和花粉培養(yǎng)中的白花苗花藥和花粉培養(yǎng)中的白花苗白化苗的控制白化苗的控制 花粉發(fā)育時期：花藥培養(yǎng)中，白花苗的比例隨花粉發(fā)育時期：花藥培養(yǎng)中，白花苗的比例隨接種時花粉發(fā)育時期的延遲而提高。接種時花粉發(fā)育時期的延遲而提高。培養(yǎng)基成分：高濃度的培養(yǎng)基成分：高濃度的2,4-D會使花粉愈傷組織分會使花粉愈傷組織分化出更多的白化苗化出更多的白化苗培養(yǎng)溫度：當(dāng)培養(yǎng)溫度提高時，白花苗的數(shù)目也培養(yǎng)溫度：當(dāng)培養(yǎng)溫度提高時，白花苗的數(shù)目也隨之增加。隨之增加。第四節(jié)第四節(jié) 花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)(小孢子培養(yǎng)小孢子培養(yǎng)):從花藥中分離出花粉粒從花藥中

16、分離出花粉粒,使之成為分散的或游離狀態(tài)使之成為分散的或游離狀態(tài),通過培養(yǎng)使花粉粒脫通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化分化,進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過程進(jìn)而發(fā)育成完整植株的過程.花粉培養(yǎng)技術(shù)花粉培養(yǎng)技術(shù) 1、取材時期：四分體時期到單核早期。、取材時期：四分體時期到單核早期?；ǚ叟囵B(yǎng)技術(shù)花粉培養(yǎng)技術(shù) 2、花粉的分離：、花粉的分離：1）自然散落法）自然散落法(漂浮培養(yǎng)自然釋放法漂浮培養(yǎng)自然釋放法) ： 將花藥接將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。后，收集培養(yǎng)。2）機(jī)械游離法）機(jī)械游離法 a.磁攪拌法：用磁力攪拌器低速攪拌培養(yǎng)液中的磁攪拌法：用磁力

17、攪拌器低速攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；花藥，使花粉游離出來； b.擠壓法：在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠擠壓法：在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。出后收集培養(yǎng)?；ǚ叟囵B(yǎng)技術(shù)花粉培養(yǎng)技術(shù) 3、小孢子純化：、小孢子純化： 對獲得的小孢子混合物進(jìn)對獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子花粉培養(yǎng)技術(shù)花粉培養(yǎng)技術(shù) 4、花粉的培養(yǎng)、花粉的培養(yǎng) 平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 液體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)： 花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。蕩，以利通氣。

18、雙層培養(yǎng)：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基（加入失活雙層培養(yǎng)：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基（加入失活花藥的浸提液），凝固后，在表面加入少量液體花藥的浸提液），凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基培養(yǎng)。 看護(hù)培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活看護(hù)培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。 微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)。室進(jìn)行花粉培養(yǎng)?？醋o(hù)培養(yǎng)圖解1 1、胚狀體發(fā)育途徑：、胚狀體發(fā)育途徑：小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。個階段，最后子葉展開，

19、形成花粉植株?；ǚ壑仓甑男螒B(tài)發(fā)生方式煙草花藥培養(yǎng)煙草花藥培養(yǎng)通過胚狀體途徑再生形成小植株通過胚狀體途徑再生形成小植株2 2、愈傷組織發(fā)育途徑：、愈傷組織發(fā)育途徑：小孢子分裂數(shù)次小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復(fù)途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。雜?；ǚ壑仓甑男螒B(tài)發(fā)生方式愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)的愈傷化發(fā)生途徑第五節(jié)第五節(jié) 單倍體植株的鑒定和二單倍體植株的鑒定和二倍化的方法倍化的方法1. 間接鑒定：通過觀察染色體倍性變化后而間接鑒定：通過觀察染色體倍性變化后而表現(xiàn)出的容易識別的形態(tài)特征等而初步判表現(xiàn)出的容易識別的形態(tài)特征等而初步判斷的鑒定方法。斷的鑒定方法。 植株形態(tài)特征的觀察；植株形態(tài)特征的觀察； 葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的測定；葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的測定； 花粉粒的鑒定；花粉粒的鑒定； 氣孔密