碩士論文答辯華中科技大學(xué)

1、斑馬魚核糖體蛋白斑馬魚核糖體蛋白RPL5和和RPL11缺陷致使再生障缺陷致使再生障礙性貧血樣病征的分子機(jī)制研究礙性貧血樣病征的分子機(jī)制研究答辯人答辯人：學(xué) 科 專 業(yè)學(xué) 科 專 業(yè)：指 導(dǎo) 教 師指 導(dǎo) 教 師：2014.1.6華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院人類基因組研究中心華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院人類基因組研究中心u提綱提綱u研究背景研究背景u實驗流程實驗流程u結(jié)果與討論結(jié)果與討論u小結(jié)與展望小結(jié)與展望u致謝致謝研究背景研究背景n再生障礙性貧血（再生障礙性貧血（Diamond-Blackfan anemia, DBA）n骨髓是人體最重要的造血器官，骨髓造血干細(xì)胞及造血微環(huán)境的損害必然會

2、引發(fā)造血功能不足的相關(guān)病征，嚴(yán)重威脅著人類健康。DBA是一種臨床主要表現(xiàn)為貧血的遺傳性骨髓衰竭綜合征貧血的遺傳性骨髓衰竭綜合征，通常在嬰兒期或兒童早期出現(xiàn)病征；主要來自于紅細(xì)胞發(fā)育以及正常血小板和骨髓系紅細(xì)胞發(fā)育以及正常血小板和骨髓系統(tǒng)如造血干細(xì)胞統(tǒng)如造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell, HSC）不足。Alter BP, Young NS. The bone marrow failure syndromes. Hematology of infancy and childhood, 1998, 1: 237-335.n在英國和荷蘭的研究發(fā)現(xiàn)，每一百萬新生兒就有4-5名患

3、病，同時也有證據(jù)顯示該病具有顯性遺傳性，潛在發(fā)病率可能在12-25。Ball S, McGuckin C, Jenkins G, Gordon-Smith E. Diamond-Blackfan anaemia in the UK: analysis of 80 cases from a 20-year birth cohort. British journal of haematology ,1996, 94(4): 645-653.n核糖體蛋白缺陷與核糖體蛋白缺陷與DBAn核糖體是細(xì)胞中最古老的分子機(jī)器，為生命活動必須。核糖體由不同的核糖體蛋白RPs和rRNA分別組成核糖體大、小亞基，直至

4、大、小裝配形成完整的核糖體。Wool IG. The structure and function of eukaryotic ribosomes. Annual review of biochemistry, 1979, 48(1): 719-754.Wool IG, Chan Y-L, Glck A. Structure and evolution of mammalian ribosomal proteins. Biochemistry and Cell Biology, 1995, 73(11-12): 933-947.n首次發(fā)現(xiàn)的由于核糖體蛋白（RPS19）結(jié)構(gòu)缺陷致使DBA，且是最

5、頻繁的突變核糖體蛋白基因，占大約25%的DBA患者。隨著研究的不斷深入，越來越多的基因突變編碼編碼的核糖體亞單位，如小型核糖體蛋白RPS19, RPS24, RPS17, RPS7, RPS10, RPS26以及大型核糖體蛋白RPL5, RPL11, RPL35等已被證明會導(dǎo)致DBA。Draptchinskaia N, Gustavsson P, Andersson B, et al. The gene encoding ribosomal protein S19 is mutated in Diamond-Blackfan anaemia. Nature genetics, 1999, 21

6、(2): 169-175.Dianzani I, Loreni F. Diamond-Blackfan anemia: a ribosomal puzzle. Haematologica, 2008, 93(11): 1601-1604.np53途徑與途徑與RPS異常異常nP53蛋白家族參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，作為抑癌基因?qū)?xì)胞的生長分化起重要作用。機(jī)體內(nèi)機(jī)體內(nèi)MDM2蛋白通過與蛋白通過與P53蛋白相互作用維持著較低的蛋白相互作用維持著較低的恒定水平。恒定水平。Vogelstein B, Lane D. Surfing the p53 network. Nature, 2000, 408(6810)

7、: 307-310.Ryan KM, Phillips AC, Vousden KH. Regulation and function of the p53 tumor suppressor protein. Current opinion in cell biology, 2001, 13(3): 332-337.n研究證實RPs包括rRNA的合成與核糖體亞基組裝的異常都會影響成熟核糖體的形成，并且通過核仁應(yīng)力的調(diào)節(jié)啟動p53途徑。Azuma M, Toyama R, Laver E, et al. Perturbation of rRNA synthesis in the bap28 mu

8、tation leads to apoptosis mediated by p53 in the zebrafish central nervous system. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(19): 13309-13316. Zhang Y, Lu H. Signaling to p53: ribosomal proteins find their way. Cancer cell, 2009, 16(5): 369-377.細(xì)胞損傷，外細(xì)胞損傷，外界壓力等界壓力等p53途徑會被激活途徑會被激活細(xì)胞周期阻滯細(xì)胞周期阻滯細(xì)胞衰老凋亡細(xì)

9、胞衰老凋亡MDM2蛋白蛋白催化催化P53蛋白泛素化蛋白泛素化P53蛋白的下調(diào)蛋白的下調(diào)反式激活反式激活阻礙阻礙P53蛋白蛋白對其反式激活對其反式激活核仁應(yīng)核仁應(yīng)作用作用異常核糖體蛋白異常核糖體蛋白與與MDM2結(jié)合結(jié)合P53蛋白蛋白抑制抑制抑制抑制抑制抑制nPI3K通路和通路和MAPKs通路與血液生成通路與血液生成n有絲分裂原活化激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族參與機(jī)體內(nèi)多種信號機(jī)制，其中 MEK/ERK 和 PI3K/AKT信號通路在多種生長因子、激素、細(xì)胞因子的刺激（如造血細(xì)胞因子）（如造血細(xì)胞因子）下，最終分別通過磷酸化活化的ERK和AKT，激活或抑制其下游靶各種蛋白，

10、進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。n研究表明，造血細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子以及通過與細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞相互作用協(xié)調(diào)控制骨髓微環(huán)境中的造血作用。這些刺激引起的細(xì)胞內(nèi)信號事件整合，通過MEK/ERK 和 PI3K/AKT信號通路，從而調(diào)節(jié)各種血細(xì)胞的增殖、存活、分化以及其遷移至骨髓。nArai A, Jin A, et al. SDF-1 synergistically enhances IL-3-induced activation of the Raf-1/MEK/Erk signaling pathway through activation of Rac and its ef

11、fector Pak kinases to promote hematopoiesis and chemotaxis. Cellular signalling, 2005, 17(4): 497-506.nHammerman PS, Fox CJ, Birnbaum MJ, et al. Pim and Akt oncogenes are independent regulators of hematopoietic cell growth and survival. Blood, 2005, 105(11):4477-4483.nShelton JG, Steelman LS, Lee JT

12、, et al. Effects of the RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT signal transduction pathways on the abrogation of cytokine-dependence and prevention of apoptosis in hematopoietic cells. Oncogene, 2003, 22(16): 2478-2492.n以斑馬魚為模型的以斑馬魚為模型的DBA研究研究n斑馬魚作為模式生物，與哺乳類相比，其重要器官發(fā)生中的許多關(guān)鍵作用分子以及重要事件在進(jìn)化和功能方面都有很強(qiáng)的保守性。尤其實在胚胎發(fā)育，血液發(fā)生

13、直至引發(fā)DBA病征的研究中得到廣泛應(yīng)用。Jing L, Zon LI. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Disease Models & Mechanisms, 2011, 4(4): 433-438.n在RPS19異常會通過激活p53途徑引發(fā)人類紅系始祖細(xì)胞的發(fā)育缺陷；nRPS29基因異常通過p53途徑阻礙造血干細(xì)胞以及紅系祖細(xì)胞的形成；n在RPS7基因抑制的斑馬魚模型中，p53途徑被激活，從而引發(fā)下游靶基因反應(yīng)和生物事件包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的發(fā)生，以相同方法同時下調(diào)p53基因可以部分回補(bǔ)

14、該異常表型。Dutt S, Narla A, et al. Haploinsufficiency for ribosomal protein genes causes selective activation of p53 in human erythroid progenitor cells. Blood, 2011, 117(9): 2567-2576.Taylor AM, Humphries JM, et al. Hematopoietic defects in rps29 mutant zebrafish depend upon p53 activation. Experimental

15、 Hematology, 2012, 40(3): 228-237.Duan J, Ba Q, Wang Z, et al. Knockdown of ribosomal protein S7 causes developmental abnormalities via p53 dependent and independent pathways in zebrafish. The international journal of biochemistry & cell biology, 2011, 43(8): 1218-1227.n有關(guān)有關(guān)RPL5和和RPL11異常與異常與DBA的

16、研究的研究n近期有大量臨床數(shù)據(jù)分析顯示，DBA患者中有10.1%的RPL5基因突變和6.5%的RPL11基因突變，并且在該患者中沒有發(fā)現(xiàn)RPS19或是RPS24基因突變。 Gazda HT, Sheen MR, Barras N, et al. Mutations of the genes for ribosomal proteins L5 and L11 are a common cause of Diamond-Blackfan anemia. In: Blood, 2007. AMER SOC HEMATOLOGY 1900 M STREET. NW SUITE 200, WASHING

17、TON, DC 20036 USA: 130A-131A.Cmejla R, Cmejlova J, Handrkova H, et al. Identification of mutations in the ribosomal protein L5 (RPL5) and ribosomal protein L11 (RPL11) genes in Czech patients with Diamond Blackfan anemia. Human mutation, 2009, 30(3): 321-327.n通過基因型及表型分析發(fā)現(xiàn)，大約有20%的患者篩查出帶有RPL5或者RPL11編碼

18、基因突變。Quarello P, Garelli E, Carando A, et al. Diamond-Blackfan anemia: genotype-phenotype correlations in Italian patients with RPL5 and RPL11 mutations. Haematologica, 2010, 95(2): 206-213.nRPL5和RPL11異常與p53途徑關(guān)系密切Marechal V, Elenbaas B, Piette J , et al. The ribosomal L5 protein is associated with m

19、dm-2 and mdm-2-p53 complexes. Molecular and cellular biology, 1994, 14(11): 7414-7420.Zhang Y, Wolf GW, Bhat K, , et al. Ribosomal protein L11 negatively regulates oncoprotein MDM2 and mediates a p53-dependent ribosomal-stress checkpoint pathway. Molecular and cellular biology, 2003, 23(23): 8902-89

20、12.注射注射RPL5 MO和和RPL11 MO獲取獲取RPL5 和和RPL11 缺陷的缺陷的斑馬魚胚胎模型斑馬魚胚胎模型檢驗 RPL5 MO和RPL11 MO功效RPL5和和RPL11缺陷的缺陷的斑馬魚生物信息學(xué)分析斑馬魚生物信息學(xué)分析不同物種的RPL5和RPL11序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析RPL5 和RPL11 缺陷的斑馬魚全基因組RNA-Seq數(shù)據(jù)分析RPL5 和和RPL11 缺陷對缺陷對血液生發(fā)的影響血液生發(fā)的影響O-染色，蘇丹黑B-染色血液相關(guān)探針的胚胎整體原位雜交p53途徑與斑馬魚中途徑與斑馬魚中RPL5和和RPL11缺陷致缺陷致使的造血功能不足使的造血功能不足RPL5 MOp53

21、 MO共注射組和RPL11 MOp53 MO共注射組O-染色，蘇丹黑B-染色血液相關(guān)探針的胚胎整體原位雜交RT-PCR分析定量血液相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)PI3K通路和通路和MAPKs通路與通路與RPL5和和RPL11缺陷致使的造血缺陷致使的造血功能不足功能不足蛋白質(zhì)免疫印跡初步檢測其中pERK和pAKT蛋白表達(dá)量變化實驗流程實驗流程結(jié)果與討論結(jié)果與討論有報道，DBA病征病征還表現(xiàn)為生長阻滯和先天性畸形生長阻滯和先天性畸形，尤其是在顱面、上肢、心臟、泌尿系統(tǒng)中出現(xiàn)缺陷。Gazda HT, Sheen MR, et al. Ribosomal protein L5 and L11 mutations

22、are associated with cleft palate and abnormal thumbs in Diamond-Blackfan anemia patients. The American Journal of Human Genetics, 2008, 83(6): 769-780.10hpf時期的RPL11 MO注射的胚注射的胚胎出現(xiàn)外包明顯減慢胎出現(xiàn)外包明顯減慢，甚至往后的發(fā)育過程中，到尾牙期無法外包，或者外包30%后停止，直至死亡（如圖4 G）；48hpf時期的胚胎，RPL5 MO注射的胚胎出現(xiàn)腹部的尾鰭少量減少，背部、尾部下垂，卵黃偏大等輕度畸形（如圖4 E,F）；4

23、8hpf時期RPL11 MO注射組有約注射組有約20%的胚胎出現(xiàn)較嚴(yán)重畸形的胚胎出現(xiàn)較嚴(yán)重畸形，胚胎腹部尾鰭完全缺失，且尾部卷曲，頭部縮小，卵黃增大明顯。nRPL5 和和RPL11 缺陷對斑馬魚胚胎形態(tài)特征的影響缺陷對斑馬魚胚胎形態(tài)特征的影響n檢驗檢驗 RPL5 MO和和RPL11 MO功效功效n檢驗檢驗 RPL5和和RPL11 Morpholino功效的重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果功效的重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果經(jīng)PCR產(chǎn)生一個與RPL5和RPL11基因各自mRNA 5 非編碼區(qū)（UTR區(qū)）片段，其中包括相應(yīng)的MO靶區(qū)和部分RPL5和RPL11基因非編碼和編碼序列相對應(yīng)的cDNA片斷，并將該片段定向克隆進(jìn)載體

24、pEGFP-N1多克隆位點(diǎn)，載體中EGFP序列的序列的ATG起始密碼起始密碼子被去除子被去除，以使插入片段與EGFP序列形成融合表達(dá)分子融合表達(dá)分子。Waldo GS, Standish BM, Berendzen J, et al. Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein. Nature biotechnology, 1999, 17(7): 691-695Wood AW, Schlueter PJ. Targeted knockdown of insulin-like growth factor binding

25、 protein-2 disrupts cardiovascular development in zebrafish embryos. Molecular Endocrinology, 2005, 19(4): 1024-1034.n共注射檢驗共注射檢驗RPL5和和RPL11 Morpholino功效功效RPL targeted morpholino-pEGFP-N1+Control MO注射組發(fā)出較明顯的綠色熒光（如圖A,C,E,G），說明該質(zhì)粒在胚胎正常表達(dá)綠色熒光蛋白，而RPL targeted morpholino-pEGFP-N1+RPL11 MO注射組幾乎沒有綠色熒光注射組幾乎沒

26、有綠色熒光。證實注射的RPL5 MO和和RPL11 MO能與能與斑馬魚細(xì)胞中斑馬魚細(xì)胞中RPL5 和和RPL11對應(yīng)的對應(yīng)的mRNA起始密碼子區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合起始密碼子區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合nRPL5和和RPL11缺陷的斑馬魚生物信息學(xué)分析缺陷的斑馬魚生物信息學(xué)分析n不同物種的不同物種的RPL5和和RPL11序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析R P L 5 和RPL11蛋白前前136個氨基酸個氨基酸序列序列z指斑馬魚指斑馬魚 zebrafish/Danio rerio； h 指人類指人類Homo sapiens；m指小家屬指小家屬M(fèi)us musculus；g指原雞指原雞Gallus gal

27、lus；x指爪蟾指爪蟾Xenopus laevis；d指果蠅指果蠅Drosophila melanogaster；a指擬南芥指擬南芥Arabidopsis thaliana氨基酸序氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析化樹分析updownsumRPL11 MO vs. Control51122173RPL5 MO vs. Control102203305nRPL5 和和RPL11 缺陷的斑馬魚全基因組缺陷的斑馬魚全基因組RNA-Seq數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析cirh1a, nat10, noc2l, dkc1, abce1, tars, polr1b, ahsa1, pwp2h, pdcd11, nol6,

28、 aatf等重要節(jié)點(diǎn)基因表等重要節(jié)點(diǎn)基因表達(dá)異常達(dá)異常RPL5RPL11鐵代謝以及亞鐵血紅素鐵代謝以及亞鐵血紅素合成不足合成不足血紅蛋白合成障礙血紅蛋白合成障礙血液生發(fā)障礙血液生發(fā)障礙血液生發(fā)相血液生發(fā)相關(guān)信號通路關(guān)信號通路造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞生成障礙生成障礙alas2, tfa, and tfr1b等等基因表達(dá)異?；虮磉_(dá)異常nRPL5 和和RPL11 缺陷對血液生發(fā)的影響缺陷對血液生發(fā)的影響u RPL11和和RPL5缺陷的斑馬魚體與對照組缺陷的斑馬魚體與對照組O-染色染色Chen AT, Zon LI. Zebrafish blood stem cells. Journal of cell

29、ular biochemistry, 2009, 108(1): 35-42.u 血液相關(guān)探針的原位雜交血液相關(guān)探針的原位雜交u RPL5和和RPL11缺陷的斑馬魚體與對照組蘇丹黑缺陷的斑馬魚體與對照組蘇丹黑B-染色染色u 探針制備所需質(zhì)粒線性化產(chǎn)物回收電泳以及合成的探針制備所需質(zhì)粒線性化產(chǎn)物回收電泳以及合成的RNA探針回收后電泳探針回收后電泳6s時期的對照組和時期的對照組和RPL5缺陷的斑馬魚體缺陷的斑馬魚體gata1,scl,pu1變化變化u 24hpf時期的對照組和時期的對照組和RPL5和和RPL11缺陷的斑馬魚體缺陷的斑馬魚體gata1, scl, pu1變化變化u 36hpf和和48

30、hpf時期時期的對照組和的對照組和RPL5和和RPL11缺陷的斑馬魚缺陷的斑馬魚體體c-myb, runx1變化變化u 36hpf和和48hpf時期時期的對照組和的對照組和RPL5和和RPL11缺陷的斑馬魚缺陷的斑馬魚體體c-myb, runx1變化變化np53途徑與斑馬魚中途徑與斑馬魚中RPL5和和RPL11缺陷缺陷 致使的造血功能不足致使的造血功能不足u 對照組，對照組，RPL缺陷的斑馬魚體和缺陷的斑馬魚體和RPL MOp53 MO共注射組共注射組O-染色染色u 對 照 組 ，對 照 組 ，RPL缺陷的斑缺陷的斑馬魚體和馬魚體和RPL MOp53 MO共注射組蘇丹共注射組蘇丹黑黑B-染色染

31、色u 6s時期的對照組，時期的對照組，RPL 缺陷的斑馬魚體和缺陷的斑馬魚體和RPL MOp53 MO共注射組共注射組gata1,scl,pu1表達(dá)變化表達(dá)變化 u 36hpf和和48hpf時期的對時期的對照組，照組，RPL缺陷缺陷的斑馬魚體和的斑馬魚體和RPL MOp53 MO共注射組共注射組runx1, c-myb變變化化 u 血液相關(guān)探針的胚胎整體原位雜交血液相關(guān)探針的胚胎整體原位雜交RT-PCR分析定量血液相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)分析定量血液相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)c-myb，runx1：標(biāo)記造血干細(xì)胞；mpx：標(biāo)記髓系造血細(xì)胞，尤其是粒系（成熟的嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞）；ikzf1：標(biāo)記淋系造血細(xì)胞始祖細(xì)胞（T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞形成）；efnb2a：標(biāo)記動脈早期形成；Spi1：標(biāo)記髓系（粒系細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)