探究性實(shí)驗(yàn)實(shí)施

1、探究性實(shí)驗(yàn)實(shí)施探究性實(shí)驗(yàn)課程的目的是為了能充分調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)主動性、積極性和創(chuàng)造性，并把所學(xué)得的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)知識綜合地應(yīng)用于課題的立項(xiàng)、設(shè)計(jì)、實(shí)施、結(jié)果分析和論文撰寫。 探究性實(shí)驗(yàn)根據(jù)其實(shí)驗(yàn)自行設(shè)計(jì)程度和時間跨度可分為平臺性擴(kuò)展設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)二類。第一節(jié) 自行設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)自行設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)是指在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生通過在一段時間內(nèi)對文獻(xiàn)進(jìn)行復(fù)習(xí)與查閱，尋找同學(xué)感興趣的研究內(nèi)容，自行設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案，完成實(shí)驗(yàn)操作、觀察和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果、實(shí)驗(yàn)課題匯報等全過程。自行設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)持續(xù)時間較長，約二個學(xué)期。在自行設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生可以充分地利用實(shí)驗(yàn)室或教研室提供的電生理學(xué)、血流動力學(xué)、呼吸力學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分

2、子生物學(xué)等儀器設(shè)備。同時，進(jìn)一步培養(yǎng)了學(xué)生的開拓與創(chuàng)新精神，養(yǎng)成良好的科學(xué)精神和嚴(yán)謹(jǐn)務(wù)實(shí)的科學(xué)作風(fēng)。一、文獻(xiàn)查閱、綜述寫作（一）文獻(xiàn)查閱（1）以實(shí)驗(yàn)小組為單位，根據(jù)已學(xué)的基礎(chǔ)知識和近期將要學(xué)習(xí)的知識，利用圖書館專業(yè)期刊及 Internet網(wǎng)查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料，提出各自感興趣的研究方向和內(nèi)容。（2）在教師的指導(dǎo)下，經(jīng)過小組集體醞釀、討論，凝練一個共同的研究目標(biāo)與內(nèi)容。（二）綜述寫作（1）圍繞一個共同的研究目標(biāo)與內(nèi)容，通過小組內(nèi)成員的答辯與討論產(chǎn)生綜述寫作的主筆同學(xué)，并合理分配每個同學(xué)在查閱文獻(xiàn)與綜述寫作中的任務(wù)。（2）通過文獻(xiàn)查閱，了解本研究內(nèi)容的國內(nèi)外現(xiàn)狀，寫出實(shí)驗(yàn)課題的背景綜述或文獻(xiàn)綜述（包

3、括涉及研究所需的材料、設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)方法）。（3）在文獻(xiàn)查閱過程中，每個小組需定期進(jìn)行文獻(xiàn)閱讀匯報會（23次），加深對課題的研究方向的理解和把握，增強(qiáng)自主學(xué)習(xí)和終生學(xué)習(xí)的能力。（4）在完成背景綜述或文獻(xiàn)綜述基礎(chǔ)上，確定研究方向中的某個論點(diǎn)或熱點(diǎn)，由12個同學(xué)主筆完成發(fā)表綜述的寫作。（5）發(fā)表綜述應(yīng)嚴(yán)格按照刊物的要求進(jìn)行撰寫，力爭公開發(fā)表。二、立題與課題標(biāo)書（一）立題（1）經(jīng)過小組集體醞釀、討論，確立一個既有科學(xué)性又有一定創(chuàng)新的課題。（2）指導(dǎo)老師對課題的目的性、科學(xué)性、先進(jìn)性、創(chuàng)新性和可行性進(jìn)行初審，必要時可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案論證。（二）課題標(biāo)書（1）明確課題研究的目的、意義和研究內(nèi)容，了解國

4、內(nèi)外研究現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢。（2）制定較為清晰的研究方法、技術(shù)路線、時間接點(diǎn)和可行性分析。（3）課題組長應(yīng)組織小組成員在老師指導(dǎo)下，按照基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院大學(xué)生自然科學(xué)研究基金項(xiàng)目的要求完成課題標(biāo)書填寫任務(wù)。三、實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)（一）方案設(shè)計(jì)1方案設(shè)計(jì)原則在立題基礎(chǔ)上，依據(jù)文獻(xiàn)資料和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)真地按照規(guī)定的格式寫出實(shí)驗(yàn)操作的設(shè)計(jì)方案。設(shè)計(jì)方案的內(nèi)容應(yīng)詳細(xì)并具可操作性。2具體格式要求：（1）題目，班級、設(shè)計(jì)者。（2）立題依據(jù)（研究的目的、意義，以及欲解決的問題和國內(nèi)外研究現(xiàn)狀）。（3）實(shí)驗(yàn)動物或細(xì)胞的品系、規(guī)格和數(shù)量。（4）實(shí)驗(yàn)器材與試劑：器材名稱、型號、規(guī)格和數(shù)量；藥品或試劑的名稱、規(guī)格、劑型和使用量

5、，包括特殊儀器與藥品需要。（5）實(shí)驗(yàn)方法與操作步驟：包括實(shí)驗(yàn)的技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程安排、每個研究項(xiàng)目的具體操作過程，以及設(shè)立的觀察指標(biāo)和指標(biāo)的檢測手段。（6）實(shí)驗(yàn)日程安排與進(jìn)度的控制節(jié)點(diǎn)。（7）觀察結(jié)果的記錄表格制作。（8）預(yù)期結(jié)果。（9）可能遇到的困難、問題及解決的措施。（二）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備根據(jù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案列出實(shí)驗(yàn)所需的動物、細(xì)胞株、器械、藥品、試劑等預(yù)算清單，在實(shí)驗(yàn)前兩周提交指導(dǎo)老師。對一些特殊藥品或試劑應(yīng)列出供應(yīng)商的公司名稱。四、開題報告1由基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織開題報告，邀請相關(guān)領(lǐng)導(dǎo)和專家參加評審。2課題小組應(yīng)在組長領(lǐng)導(dǎo)下，選好主匯報人，做好多媒體匯報材料，同時小組每個成員都要積極做好準(zhǔn)備，接受其

6、他同學(xué)、專家和領(lǐng)導(dǎo)的詢問。3開題報告后，應(yīng)認(rèn)真總結(jié)，發(fā)現(xiàn)問題和修正方案。五、預(yù)實(shí)驗(yàn)、結(jié)果分析、正式實(shí)驗(yàn)（一）預(yù)實(shí)驗(yàn)（1）按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和操作步驟，認(rèn)真進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。（2）實(shí)驗(yàn)過程中，做好各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的原始記錄。（二）結(jié)果分析（1）應(yīng)及時整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)和分析預(yù)實(shí)驗(yàn)中存在的問題和改進(jìn)與調(diào)整的實(shí)驗(yàn)方案。（2）對實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)與預(yù)期結(jié)果不同時應(yīng)及時向指導(dǎo)老師進(jìn)行匯報。（3）如果指導(dǎo)老師認(rèn)為預(yù)實(shí)驗(yàn)已基本達(dá)到目的和要求時，可不再進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。（三）正式實(shí)驗(yàn)操作（1）依據(jù)修改后的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和操作流程認(rèn)真地進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。（2）做好各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的原始記錄，及時整理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。（3）對一些實(shí)驗(yàn)試劑成本昂貴、實(shí)驗(yàn)操作難度

7、較大，以及環(huán)境不允許的實(shí)驗(yàn)可由教師親自完成。六、論文撰寫1在認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理與分析后，按照醫(yī)學(xué)院校的學(xué)報格式進(jìn)行論文撰寫。2實(shí)驗(yàn)小組的每個成員按照自己對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的認(rèn)識，以及對本課題研究意義的不同思考，可獨(dú)立完成一篇論文撰寫。實(shí)驗(yàn)小組在討論后應(yīng)共同完成一篇論文撰寫。3根據(jù)老師要求時間節(jié)點(diǎn)上交論文，力爭公開發(fā)表。七、課題匯報1在指導(dǎo)老師修改下，小組每個成員共同完成多媒體制作，做好論文答辯準(zhǔn)備工作。2實(shí)驗(yàn)小組通過協(xié)商產(chǎn)生一名同學(xué)作為主答辯人，其他同學(xué)共同參與，組成論文答辯隊(duì)。3在論文答辯過程中，應(yīng)體現(xiàn)事實(shí)求實(shí)，尊重實(shí)驗(yàn)結(jié)果和良好的科學(xué)態(tài)度，以及縝密的思維模式和優(yōu)秀的表達(dá)藝術(shù)。4由指導(dǎo)老師和專家

8、組成的答辯委員會及其他同學(xué)將對研究論文匯報結(jié)果進(jìn)行提問。并由答辯委員會對整個研究課題的科學(xué)性、先進(jìn)性、創(chuàng)新性，論文撰寫、匯報的表達(dá)能力進(jìn)行綜合打分，給出最終成績。第二節(jié) 擴(kuò)展性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)多學(xué)科擴(kuò)展性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)是指由教師指定的實(shí)驗(yàn)平臺條件下，完成從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作到結(jié)果分析與論文撰寫全過程。實(shí)驗(yàn)操作過程基本在一次實(shí)驗(yàn)課內(nèi)完成，然后再安排一次以小組為團(tuán)隊(duì)的結(jié)果匯報與討論。例如，以家兔失血性休克作為自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)平臺，學(xué)生可自主設(shè)計(jì)休克實(shí)驗(yàn)方案，包括失血程度，搶救措施（藥物施加的方式），實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)的設(shè)立。設(shè)計(jì)方案經(jīng)指導(dǎo)教師同意后，在實(shí)驗(yàn)課完成實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果分析等過程，并用多媒體匯報與討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一、

9、基于家兔為實(shí)驗(yàn)對象的多學(xué)科整合性擴(kuò)展設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊圆溉閯游锛彝脼閷?shí)驗(yàn)對象，依托PowerLab實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，多參數(shù)多器官系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)同時開展，進(jìn)行多功能學(xué)科（正常生理、病理生理和藥理）的整合性實(shí)驗(yàn)。在擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)中同時采樣記錄動物的心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多系統(tǒng)參數(shù)，各系統(tǒng)參數(shù)的有機(jī)組合，輔以各種實(shí)驗(yàn)手段和措施（如人為建立病理模型，病理模型的藥物治療等），可明確所設(shè)計(jì)課題中動物的正常生理過程，病理變化和藥物治療效果。（二）實(shí)驗(yàn)原理疾病的發(fā)生必然伴隨著相應(yīng)的生理過程的變化。PowerLab實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)使多參數(shù)同步記錄的可能得以實(shí)現(xiàn)。記錄此生理參數(shù)，可直觀地反映機(jī)體從正常生理情況轉(zhuǎn)變?yōu)椴±砩淼倪^程

10、，以及反映藥物對疾病的治療情況。（三）實(shí)驗(yàn)條件1實(shí)驗(yàn)動物家兔，體重 1.52.0 kg。2藥品與器材基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中用于家兔實(shí)驗(yàn)的所有藥品和器械。（四）實(shí)驗(yàn)基本過程根據(jù)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的步驟而變化（五）討論分析（1）對實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理進(jìn)行闡釋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)與歸納。（2）對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的各種觀察指標(biāo)變化進(jìn)行分析，探討其變化的發(fā)生機(jī)制。（3）如實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，請分析其失敗的原因和提出改進(jìn)的措施。（六）時間節(jié)點(diǎn)（1）完整、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案必須在實(shí)驗(yàn)課的前一周完成，設(shè)計(jì)方案不合格者將取消實(shí)驗(yàn)資格。（2）實(shí)驗(yàn)操作時間必須控制在1天以內(nèi)。（3）一周后以小組為單位用多媒體匯報實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論分析。（七）附錄及注意事項(xiàng)1家

11、兔正常生理指標(biāo)（見第二章） 2所需參數(shù)參見相應(yīng)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。3儀器連接參見各相應(yīng)參數(shù)記錄時的實(shí)驗(yàn)。4實(shí)驗(yàn)過程不得危害人體健康和污染環(huán)境。（王紅衛(wèi)）二、基于多因素對離體心臟功能影響的擴(kuò)展性實(shí)驗(yàn)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康碾x體心臟灌注是指將動物心臟取出胸腔，連接上一個特定的灌流裝置，用相應(yīng)的緩沖液灌注其冠脈系統(tǒng)，使離體心臟在人工控制的條件下自主跳動或人工起搏下收縮與舒張。自主設(shè)計(jì)多因素對大鼠離體心臟功能影響的實(shí)驗(yàn)，并觀察心臟在不同條件下的功能變化規(guī)律。（二）實(shí)驗(yàn)原理離體心臟模型主要分為兩種：主動脈逆行灌注（Langendorff）模型和工作心臟模型(Working heart)。這種模型的主要優(yōu)點(diǎn)是不受神經(jīng)，體液

12、的調(diào)節(jié)，影響因素少，而且可控性強(qiáng)（如前負(fù)荷、后負(fù)荷、營養(yǎng)液成分、溫度等均可調(diào)節(jié)）。因此，離體心臟模型廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域生理，藥理、生化等基礎(chǔ)與臨床相關(guān)科室的研究領(lǐng)域。（三）實(shí)驗(yàn)條件1實(shí)驗(yàn)動物大白鼠，體重200300 g左右。2藥品與器材戊巴比妥鈉，Krebs-Henseleit緩沖液，主動脈插管，灌流槽，恒溫灌流裝置，微電極放大器，哺乳動物手術(shù)器械，臺氏液，PowerLab 8S主機(jī)，微操縱器，冷光源，含95% O2+5% CO2混和氣體。（四）實(shí)驗(yàn)基本過程自主設(shè)計(jì)各種不同試劑或藥物觀察對心臟功能的影響。1主動脈逆行灌注（Langendorff，逆行灌注，retrograde perfusi

13、on）（1）取大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉，舌下靜脈注射1的肝素抗凝（0.5ml/kg）（腹腔注射亦可，5000 IU/kg），開胸迅速取出心臟置于4或室溫下的Krebs-Henseleit緩沖液。（2）心臟自主收縮與舒張可排出心腔內(nèi)大部分血液，立即用兩眼科鑷持主動脈，接上主動脈插管，此管道通過一調(diào)節(jié)拴連接入可以調(diào)節(jié)灌注壓的灌注管道。（3）心尖部掛一個金屬小鉤連接生物信號轉(zhuǎn)換儀，可以測量心率，心功能。整個灌注系統(tǒng)及心臟周圍用恒溫水浴循環(huán)器維持在37左右。（4）將一與PE管連接的水囊由左房插入左心室，PE管接壓力換能器至MPA生物信號記錄系統(tǒng)，調(diào)節(jié)水囊內(nèi)壓至510 mmHg（前負(fù)

14、荷），通過水囊可以測定左室發(fā)展壓（developed pressure）及dp/dt。（5）灌流液儲槽內(nèi)常用Krebs-Henseleit液（NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO4 1.2，MgSO2 1.2，CaCl2 2.9，NaHCO3 25，Glucose 11.1，EDTA 0.5 mmol），灌注液以95的O2 和5的CO2充分飽和，使氧分壓維持在500550mmHg，二氧化碳分壓維持在3642mmHg左右，pH值左右，灌注壓一般在90cmH2O。（6）心臟恢復(fù)自主心跳后平衡灌注15min，待心臟跳動平穩(wěn)后便可開始實(shí)驗(yàn)。（7）在藥物實(shí)驗(yàn)中，可以將藥物直接加入儲槽內(nèi)，或用微電

15、腦輸液泵從主動脈根部給藥。揮發(fā)性藥物（如揮發(fā)性麻醉藥）可以使灌注液在一定濃度下飽和該藥物，再行灌注。Langendorff灌注最大的優(yōu)點(diǎn)是簡單而且相對穩(wěn)定（只要灌注壓和灌注液恰當(dāng)）。然而，它不完全符合生理，其本質(zhì)是主動脈逆行灌注，心臟是空收縮，沒有起到泵的作用，而且沒有前負(fù)荷。將一水囊置于左心室，使心臟有了一些前負(fù)荷，另外通過水囊還可以測定左室發(fā)展壓（developed pressure）及dp/dt，但這種模型心臟做功較少，在測定心肌代謝方面還很困難。這是因?yàn)樗掖笮∈枪潭ǖ?，與心室內(nèi)壁結(jié)合不會太緊密，因此，與生理狀態(tài)下的前負(fù)荷相差較遠(yuǎn)。2工作心臟模型（Working Heart，順行灌注，

16、antegrade perfusion）此模型的最大特點(diǎn)是左室有了可以調(diào)節(jié)的前負(fù)荷，這樣，心臟就能和在體模型一樣做功，而且在測量心臟能量代謝和心肌酶譜方面和在體模型接近。（1）動物及灌流液同Langendorff模型，與Langendorff模型不同的是，工作心臟模型是一種雙灌流裝置，它不僅有主動脈灌流系統(tǒng)而且還有左房灌流系統(tǒng)，主動脈流入道和流出道通過三通連接互相轉(zhuǎn)換，流出道的壓力（后負(fù)荷）可以通過管道內(nèi)液平面高度來調(diào)節(jié)。前負(fù)荷可以調(diào)節(jié)左房灌注系統(tǒng)儲槽的液面高度。（2）操作的前半部分同Langendorff模型，在實(shí)行完主動脈逆行灌注后行肺靜脈插管入左房連接左房灌流系統(tǒng)，結(jié)扎固定。（3）由心尖

17、部向左室插入一充滿營養(yǎng)液的PE管，連接換能器至生物信號轉(zhuǎn)換儀，可以測量左室內(nèi)壓變化及心率。（4）持續(xù)主動脈逆行灌流10min待心臟搏動平穩(wěn)后，關(guān)閉主動脈流入道，打開主動脈流出道，并開始心房灌流，預(yù)灌流1520min，待心跳平穩(wěn)后開始實(shí)驗(yàn)。（五）觀察項(xiàng)目自行設(shè)計(jì)多因素影響離體心臟的觀察項(xiàng)目或心功能指標(biāo)。（六）討論分析（1）對實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒃O(shè)計(jì)原理進(jìn)行闡釋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)與歸納。（2）對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的各種觀察指標(biāo)變化進(jìn)行分析，探討其變化的發(fā)生機(jī)制。（3）如實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，請分析其失敗的原因和提出改進(jìn)的措施。（七）時間節(jié)點(diǎn)（1）完整、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案必須在實(shí)驗(yàn)課的前一周完成，設(shè)計(jì)方案不合格者將取消實(shí)驗(yàn)

18、資格。（2）實(shí)驗(yàn)操作時間必須控制在1天以內(nèi)。（3）一周后以小組為單位用多媒體匯報實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論分析。（八）注意事項(xiàng)（1）主動脈懸掛結(jié)扎的位置不能太深，以免阻塞冠狀動脈入口或損傷主動脈瓣造成關(guān)閉不全。（2）在整個實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持心臟周圍溫度37左右，上下波動不超過0.5（3）灌流液事先要用氧氣充分飽和，一般為2030min。（4）灌流液經(jīng)心臟冠脈循環(huán)后由冠狀靜脈竇流入右心房及右心室，最后從肺動脈流出，因此，在操作中如果結(jié)扎了肺動脈，會出現(xiàn)右室迅速彭出的情況或?qū)ⅰ?（陳紅）三、大鼠離體主動脈血管功能的擴(kuò)展性實(shí)驗(yàn)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^離體主動脈血管張力變化記錄觀察血管的收縮功能與舒張功能。如果采用動

19、物疾病模型，如遺傳性高血壓動物可以觀察到血管內(nèi)皮或平滑肌功能損傷。（二）實(shí)驗(yàn)條件1實(shí)驗(yàn)動物大白鼠。2藥品與器材戊巴比妥鈉，Krebs-Henseleit緩沖液，克氏液，離體血管灌流槽，恒溫灌流裝置，微電極放大器，培養(yǎng)皿，哺乳動物手術(shù)器械， PowerLab 8S主機(jī)，微操縱器，冷光源，含95% O2+5% CO2混和氣體等。（三）實(shí)驗(yàn)基本過程1血管環(huán)制備（1）大鼠麻醉后開胸剪除心臟，將肺組織向前翻開剪除，用有齒鑷夾住主動脈上端并輕輕提起，在主動脈后方延胸壁向下剪開結(jié)締組織，分離主動脈，剪除有齒鑷夾持而損傷的部位。（2）將主動脈放入含有Krebs-Henseleit緩沖液的平皿，Krebs-He

20、nseleit緩沖液成份（mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，CaCl2 2.5，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.2，NaHCO3 25.0，glucose 11.0，Na2-EDTA 0.5。（3）仔細(xì)分離剪除血管外脂肪組織與疏松血管外膜，然后將血管剪成23 mm長的血管環(huán)。（4）用一不銹鋼掛鉤將血管環(huán)挑起并懸掛于張力換能器上，調(diào)整掛鉤血管環(huán)與另一固定掛鉤的距離，然后將血管環(huán)穿入另一掛鉤，調(diào)整血管環(huán)在兩掛鉤間的相對位置，掛鉤位置固定后緩慢施加前負(fù)荷（靜息張力）至2 g（扣除掛鉤重量）。（5）將掛鉤連同血管環(huán)浸入含有預(yù)平衡緩沖液（37）的血管槽，緩沖液持續(xù)通以95氧氣5

21、二氧化碳，使每一血管環(huán)在血管槽內(nèi)的位置相對一致，平衡4060min，期間每1015min更換液體一次，待血管張力穩(wěn)定后可開始實(shí)驗(yàn)。2血管收縮舒張功能檢測（1）以60 mmol/L 氯化鉀使血管環(huán)平滑肌去極化,反復(fù)重復(fù)此過程2次使血管環(huán)收縮達(dá)坪值；沖洗。（2）重新平衡血管環(huán)，再用1mmol/L苯腎上腺素預(yù)收縮血管, 待張力上升并穩(wěn)定（通常1mmol/L苯腎上腺素加入后1015min達(dá)平臺）后, 加入1mmol/L乙酰膽堿舒張血管,以檢測血管內(nèi)皮的完整性（或稱內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)）。（3）最大舒張反應(yīng)大于80 %的血管環(huán)可被認(rèn)為內(nèi)皮完整,并用于內(nèi)皮依賴性血管實(shí)驗(yàn)。（4）去血管內(nèi)膜的主動脈血管環(huán)制

22、備：以直徑與血管環(huán)相似的細(xì)綿簽穿入血管腔內(nèi)，在濕紗布上輕輕來回摩擦血管內(nèi)腔35次，或以PE10或PE50管穿入血管腔內(nèi)，將血管在濕紗布上輕輕滾動摩擦以去除血管內(nèi)膜。用苯腎上腺素預(yù)收縮血管后在用乙酰膽堿檢驗(yàn)血管舒張反應(yīng)，如血管對乙酰膽堿無舒張反應(yīng)或呈收縮反應(yīng)，說明血管去除完全。（四）觀察項(xiàng)目自行設(shè)計(jì)與確定影響主動脈血管的實(shí)驗(yàn)條件、觀察項(xiàng)目，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（五）討論分析1對實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、設(shè)計(jì)原理進(jìn)行闡釋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)與歸納。2對實(shí)驗(yàn)中不同藥物使用后的各種觀察指標(biāo)變化進(jìn)行分析，探討其變化的發(fā)生機(jī)制。3如實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，請分析其失敗的原因和提出改進(jìn)的措施。（六）時間節(jié)點(diǎn)1完整、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案必須在

23、實(shí)驗(yàn)課的前一周完成。2實(shí)驗(yàn)操作時間控制在1天以內(nèi)。3一周后以小組為單位用多媒體匯報實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論分析。（七）附錄及注意事項(xiàng)1血管收縮與舒張工具藥及其使用濃度：（1）緩沖溶液的配制1）Krebs-Henseleit緩沖溶液的配制：Krebs-Henseleit溶液為離體血管及離體心臟實(shí)驗(yàn)常用的一種緩沖溶液，按下述固定比例配制后pH值為7.4，具體配制試劑及用量（見表7-1）。表7-1Krebs-Henseleits Solution for Isolated Vessel PerfusionSalt Molecular weightmmol/lg/lg/2lg/5l1NaCl58.441186.

24、9013.834.52KCl74.554.70.350.71.753MgSO4 anhydrous120.361.20.140.280.74NaHCO384.01252.104.210.55KH2PO4136.091.20.160.320.826Glucose.H2O198.17112.184.3610.97CaCl2 anhydrous110.992.50.280.561.48EDTA-Na2372.240.50.190.380.952）高鉀收縮溶液的配制：以氯化鉀替代原KrebHenseleit中的部分氯化鉀，制成等滲透壓的緩沖溶液，用于刺激血管收縮，具體（見表7-2）。表7-2 高鉀60

25、mM收縮液Salt Molecular weightmmol/lg/lg/500ml1NaCl58.4462.63.661.832KCl74.55604.472.2353MgSO4 anhydrous120.361.20.140.074NaHCO384.01252.101.055KH2PO4136.091.20.160.086Glucose.H2O198.17112.181.097CaCl2 anhydrous110.992.50.280.148EDTA-Na2372.240.50.190.095 （陳紅）四、家兔失血性休克的擴(kuò)展性實(shí)驗(yàn)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)的目的是為了能充分調(diào)動同學(xué)的學(xué)習(xí)主動性

26、、積極性和創(chuàng)造性，尤其將所學(xué)到的生理學(xué)、藥理學(xué)、病理生理學(xué)知識應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)的自行設(shè)計(jì)。以失血性休克為動物實(shí)驗(yàn)平臺，在一定的實(shí)驗(yàn)條件和范圍內(nèi)，完成從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到親自動手操作全過程。在實(shí)驗(yàn)過程中，通過自主設(shè)計(jì)不同類型、不同程度、不同治療措施的實(shí)驗(yàn)，觀察動物的各種功能與代謝變化，分析和掌握其發(fā)生的主要原因和機(jī)制，使同學(xué)能較好地把理論課學(xué)到的基礎(chǔ)知識與動物實(shí)驗(yàn)實(shí)踐相結(jié)合，達(dá)到強(qiáng)化與提高發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的能力，以及初步掌握一些簡單的、基本的實(shí)驗(yàn)操作技能。（二）實(shí)驗(yàn)原理失血可使有效循環(huán)血量減少。失血途徑和程度不同，對機(jī)體影響也不同，少量失血可通過機(jī)體的一系列抗損傷措施，使血壓不出現(xiàn)明顯的降低；當(dāng)快速失血量過

27、多、過快時，可超出機(jī)體的抗損傷能力，導(dǎo)致休克發(fā)生。但積極藥物治療措施可有效地改善血液動力學(xué)變化和增強(qiáng)機(jī)體的抗休克能力。（三）實(shí)驗(yàn)條件自行設(shè)計(jì)不同類型失血性休克的病理模型，完成失血性休克的造病、治療和死亡的全過程，并觀察休克和抗休克時動物的血液動力學(xué)變化特點(diǎn)和機(jī)體的功能、代謝變化，分析和掌握休克發(fā)生和抗休克治療的主要機(jī)制，以及對機(jī)體的影響。1實(shí)驗(yàn)動物家兔，體重 1.52.0 kg。2實(shí)驗(yàn)藥品與器材25烏拉坦溶液，葡萄糖溶液，生理鹽水，腎上腺素，0.7%肝素。兔手術(shù)臺，電子稱，天平，i-STAT血?dú)夥治鰞x，微循環(huán)生物信號處理系統(tǒng)，手術(shù)器械，動脈插管，氣管插管，靜脈插管，注射器。（四）實(shí)驗(yàn)基本過程1

28、按照實(shí)驗(yàn)要求，以及提供的動物、實(shí)驗(yàn)器材與藥品，自主設(shè)計(jì)不同類型的失血性休克的病理模型（包括實(shí)驗(yàn)原理和觀察指標(biāo)的確立）。（1）立題：以實(shí)驗(yàn)小組為單位，根據(jù)以往學(xué)的知識和預(yù)習(xí)“休克”和相關(guān)藥理章節(jié)的內(nèi)容，或查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料，由小組集體醞釀、討論確立失血性休克實(shí)驗(yàn)方案（包括觀察指標(biāo)和抗休克措施）。但是，一定要注意動物實(shí)驗(yàn)立題的科學(xué)性、目的性和在現(xiàn)有的條件下所具有的可操作性。同時，也提倡實(shí)驗(yàn)思路的新穎和獨(dú)特性。（2）方案設(shè)計(jì)的格式與內(nèi)容：每實(shí)驗(yàn)小組在立題基礎(chǔ)上，寫出動物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的內(nèi)容應(yīng)詳細(xì)和具可操作性，具體的內(nèi)容和格式要求如下：題目；立題依據(jù)（實(shí)驗(yàn)的目的、原理）；實(shí)驗(yàn)動物品種與數(shù)量

29、；實(shí)驗(yàn)器材（型號、規(guī)格和數(shù)量）與藥品（規(guī)格、劑型和使用量），包括特殊儀器與藥品需要（器材型號、規(guī)格和數(shù)量與藥品規(guī)格、劑型和使用劑量）；實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（方法和操作步驟），以及觀察指標(biāo)；實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果記錄表格制作；預(yù)期結(jié)果；注明參閱文獻(xiàn)資料。2失血性休克的動物模型復(fù)制（見 頁）3并按實(shí)驗(yàn)的自行設(shè)計(jì)方案完成動物實(shí)驗(yàn)操作步驟和指標(biāo)觀察。（五）討論分析1對實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理進(jìn)行闡釋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)與歸納。2對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的各種觀察指標(biāo)變化進(jìn)行分析，探討其變化的發(fā)生機(jī)制。3如實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，請分析其失敗的原因和提出改進(jìn)的措施。（六）時間節(jié)點(diǎn)1完整、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案必須在實(shí)驗(yàn)課的前一周完成，設(shè)計(jì)方案不合格者將取消實(shí)驗(yàn)

30、資格。2實(shí)驗(yàn)操作時間必須控制在1天以內(nèi)。3一周后以小組為單位用多媒體匯報實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論分析。（六）附錄及注意事項(xiàng)1家兔正常生理指標(biāo)（見第二章）2實(shí)驗(yàn)過程不得危害人體健康和污染環(huán)境。五、基于家兔缺血-再灌注損傷的擴(kuò)展性實(shí)驗(yàn)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^關(guān)閉某組織器官的動脈血管造成缺血狀態(tài)，并維持一段時間后，再開放其動脈血管，恢復(fù)組織器官的動脈血供應(yīng)，造成缺血-再灌注損傷的病理過程。采取積極藥物或干預(yù)措施可有效地改善組織細(xì)胞的功能與代謝狀態(tài)和增強(qiáng)機(jī)體的抗損傷能力。（二）實(shí)驗(yàn)原理隨著臨床溶栓療法、動脈搭橋術(shù)、斷肢再植、器官移植、心臟手術(shù)等方法的不斷推廣應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)在一定條件下恢復(fù)組織器官的血液再灌注后，有部分

31、患者器官功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞不但未減輕反而加重，出現(xiàn)了缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury）。目前認(rèn)為，缺血-再灌注損傷發(fā)生的始動環(huán)節(jié)是缺血、缺氧導(dǎo)致能量代謝障礙，主要機(jī)制是自由基大量產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，以及中性粒細(xì)胞活化、無復(fù)流現(xiàn)象和高能磷酸化合物生成障礙等。因此，干預(yù)和治療缺血-再灌注損傷的發(fā)生是近十多年來研究的熱點(diǎn)之一。（三）實(shí)驗(yàn)條件以家兔缺血-再灌注損傷為自行設(shè)計(jì)性動物實(shí)驗(yàn)平臺，在一定的實(shí)驗(yàn)條件和范圍內(nèi)，自行設(shè)計(jì)不同類型組織臟器的缺血-再灌注損傷模型，同時采用不同治療措施的實(shí)驗(yàn)方案。1實(shí)驗(yàn)動物家兔，體重 1.52.0 kg。2藥品與器材25烏拉坦溶

32、液，葡萄糖溶液，生理鹽水，腎上腺素，0.7%肝素，3%戊二醛，TNF-檢測試劑盒，IL-6檢測試劑盒等。兔手術(shù)臺，電子稱，天平，生物信號處理系統(tǒng)，動物呼吸機(jī)，顯微鏡，酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、電動勻漿機(jī)、手術(shù)器械，動脈夾，動脈插管，氣管插管，注射器。（四）實(shí)驗(yàn)基本過程1按照實(shí)驗(yàn)要求，以及提供的動物、實(shí)驗(yàn)器材與藥品，自主設(shè)計(jì)不同類型缺血-再灌注損傷的病理模型（含原理和觀察指標(biāo)確立）。（1）立題：以實(shí)驗(yàn)小組為單位，根據(jù)以往學(xué)的知識和預(yù)習(xí)相關(guān)章節(jié)的內(nèi)容，或查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料，開展集體醞釀、討論確立缺血-再灌注損傷實(shí)驗(yàn)方案（包括觀察指標(biāo)和抗再灌注損傷措施）。但是，一定要注意動物實(shí)驗(yàn)立題的科學(xué)性、現(xiàn)實(shí)性和可操作

33、性，以及實(shí)驗(yàn)思路的新穎和獨(dú)特性。（2）方案設(shè)計(jì)的格式與內(nèi)容：每實(shí)驗(yàn)小組在缺血-再灌注損傷實(shí)驗(yàn)平臺的基礎(chǔ)上，依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康木幹瞥鰟游飳?shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的內(nèi)容應(yīng)詳細(xì)和具可操作性，具體的內(nèi)容和格式要求如下：題目；立題依據(jù)（實(shí)驗(yàn)的目的、原理）；實(shí)驗(yàn)動物品種與數(shù)量；實(shí)驗(yàn)器材（型號、規(guī)格和數(shù)量）與藥品（規(guī)格、劑型和使用量），包括特殊儀器與藥品需要（器材型號、規(guī)格和數(shù)量與藥品規(guī)格、劑型和使用劑量）；實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（方法和操作步驟），以及觀察指標(biāo)；實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果記錄表格制作；預(yù)期結(jié)果；注明參閱文獻(xiàn)資料。2缺血-再灌注的動物模型復(fù)制（1）心臟缺血-再灌注模型制備：1）動物分組與處理：將家兔分成A、B動物，A為缺

34、血-再灌注的對照動物，B為去甲腎上腺素預(yù)處理動物。2）用20%烏拉坦（5ml/kg）靜脈麻醉，固定于兔臺。頸部去毛，手術(shù)分離氣管和右頸總動脈，并進(jìn)行氣管插管和動脈插管。氣管插管與呼吸機(jī)連接（潮氣量50ml，吸呼比2: 1, 呼吸頻率40次/min）；動脈插管與血壓換能器連接；四肢連接心電圖導(dǎo)聯(lián)，記錄心電圖。3）剪去胸壁左側(cè)被毛，沿胸骨左緣24肋剪斷肋軟骨，打開胸腔。開胸后立即行正壓呼吸。4）用眼科剪剪開心包，暴露心臟，用止血鉗輕輕提起左心耳，于冠狀動脈左支起始部約2mm處用縫合針繞其穿一無創(chuàng)縫合線，穩(wěn)定15min。然后予A動物靜脈注射生理鹽水0.1ml/kg，B動物靜脈注射去甲腎上腺素0.1ml/kg，各持續(xù)3min。待心率基本穩(wěn)定后，墊線結(jié)扎冠脈左支，20min后松開結(jié)扎線，再灌注30min。復(fù)制模型的可靠性用連續(xù)監(jiān)測之ECG導(dǎo)聯(lián)的變化來判斷，以ST段抬高為心肌缺血存在，以深大Q波出現(xiàn)確定心肌壞死形成。（見圖7-2、7-3）圖7-2 缺血-再灌注損傷ECG導(dǎo)聯(lián)圖7-1 正常ECG導(dǎo)聯(lián)（2）肝缺血-再灌注模型制備：1）家兔術(shù)前禁食12h。2）