肝細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案

1、原代培養(yǎng)肝細(xì)胞是肝細(xì)胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。長期以來, 國內(nèi)外眾多學(xué)者對肝細(xì)胞分離方法 、培養(yǎng)條件進(jìn)行了大量的研究 , 但要獲得高活率、功能好的肝細(xì)胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分離肝細(xì)胞 ,包括機(jī)械法( 如勻漿法) 及螯合法。機(jī)械法對肝細(xì)胞損傷大, 細(xì)胞活率低; 螯合法是用可結(jié)合 Ca2+ 、M g2 +的螯合劑(如枸櫞酸鹽或 EDTA) 分離肝細(xì)胞,但螯合劑單獨(dú)使用效果不好 ,常需與酶法結(jié)合使用。后期逐漸改為酶消化法分離肝細(xì)胞 ,包括膠原酶消化法、胰蛋白酶消化法 。后者對酶濃度及作用時(shí)間要求十分嚴(yán)格, 且由于胰蛋白酶是一種強(qiáng)蛋白質(zhì)消化酶, 對肝細(xì)胞膜破壞嚴(yán)重 , 因而易造成肝

2、細(xì)胞死亡 , 導(dǎo)致分離失敗。膠原酶消化法對肝細(xì)胞損傷較小 , 雖然肝細(xì)胞膜在消化過程中也會(huì)受到損害, 但經(jīng)培養(yǎng)后可完全修復(fù) 。膠原酶在消化肝的同時(shí)解除了細(xì)胞間接觸抑制或活化了潛在的蛋白激酶、生長因子或受體, 使肝細(xì)胞能逐漸適應(yīng)消化分離過程中所發(fā)生的細(xì)胞內(nèi) 、外環(huán)境及細(xì)胞間的各種改變 。這些改變對離體肝細(xì)胞修復(fù)、生長及其功能有重要的促進(jìn)作用 ,有利于肝細(xì)胞的培養(yǎng)。這種適應(yīng)性改變恰恰是機(jī)械分離法所沒有的。因此 ,要獲取理想的肝細(xì)胞,酶消化這一重要環(huán)節(jié)不可缺少。Seglen 二步灌注法為經(jīng)典的膠原酶消化法,但所需設(shè)備較復(fù)雜 ,膠原酶消耗量大 。本研究在其基礎(chǔ)上略加改進(jìn)。作者認(rèn)為 ,采用膠原酶消化法

3、,膠原酶的用量、作用時(shí)間及作用條件是分離成功與否的關(guān)鍵 。膠原酶的濃度過高 ,作用時(shí)間難以控制 ; 濃度過低 ,則作用時(shí)間過長、細(xì)胞活率降低。事先用無Ca2 +、M g2+的灌注液進(jìn)行預(yù)灌注, 去除 Ca2+依賴性粘附因子 ,使橋粒斷裂; 然后用含 Ca2+的膠原酶消化 ,膠原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +濃度下 ,用濃度為 500 mg/ L 的膠原酶 37 條件下消化 15 min 最佳。在進(jìn)行肝細(xì)胞洗滌、離心、重懸等純化操作時(shí) ,溫度需保持在 0 4 。肝細(xì)胞分離時(shí), pH 值宜維持在 7 . 4 左右, 不低于 7 . 2 ,最高不超過 7 . 6 ,

4、 否則將對肝細(xì)胞造成很大損傷。在肝灌注液中加入適量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以維持細(xì)胞代謝和液體滲透壓, 提高肝細(xì)胞成活率 。此外,門靜脈插管應(yīng)迅速置入,灌注速度必須保持一致。培養(yǎng)板預(yù)處理及培養(yǎng)液選擇 采用鋪過膠原的新培養(yǎng)板與沒有鋪過膠原的新培養(yǎng)板 ,鋪過膠原的老培養(yǎng)板培養(yǎng)肝細(xì)胞比較 , 發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞在鋪過膠原的新培養(yǎng)板中長勢更好 。新的培養(yǎng)板使用 Sigm a公司提供的膠原鋪膠 ,置于 37恒溫箱中過夜后使用。過去選擇含 8%胎牛血清的 W E作培養(yǎng)基 ,效果不錯(cuò) , 但 WE價(jià)格昂貴 ,我們試著采用含 10%胎牛血清的 RPM 1640培養(yǎng)基 , 并在其中加入胰島素 , 地塞米松等生長因

5、子 , 肝細(xì)胞生長好 。肝細(xì)胞的接種密度對其以后的生長狀況有很大的影響 : 密度太小 ,細(xì)胞不易生長 ; 密度太大 , 肝細(xì)胞增殖受到抑制 , 培養(yǎng)板中缺少足夠的空間供細(xì)胞伸展 。當(dāng)細(xì)胞密度為 5×105 / m l左右時(shí) ,試劑及儀器 主要試劑 : 胰島素、高血糖素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、地塞米松、型膠原酶 、錐蟲藍(lán)等購自美國 Sig ma 公司。鼠尾膠為自行配制 。Williams E 培養(yǎng)液 、胎牛血清購自美國 Gibco 公司 。BT01-100 蠕動(dòng)泵( 保定格蘭蠕動(dòng)泵有限公司)、Sorvall 低溫離心機(jī)( 美國 Kendro 公司), CL-800 全自動(dòng)生化分化儀(

6、 日本島津), XD-101 倒置顯微鏡( 南京光學(xué)顯微鏡公司)。 Heraeus CO 2孵箱( 美國 Kendro公司), KT-902 潔凈室( 無錫康達(dá)凈化空調(diào)設(shè)備廠)。實(shí)驗(yàn)步驟：一、原代大鼠肝細(xì)胞的分離1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Spragure- Dawley （ SD ） 大鼠購自瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。雄性，清潔級，體重 150200g，812 周齡。分籠飼養(yǎng)，喂飼標(biāo)準(zhǔn)的大鼠飼料，隨意飲水，保持室溫 20 25 。2.主要儀器設(shè)備: 倒置相差顯微鏡（）；自動(dòng)平衡微型離心機(jī)：LDZ4- 0.8 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；套管針（）；超凈工作臺(tái)（）；電子分析天平（）；外科手術(shù)器械（）3.主要試劑及藥品：

7、 型膠原酶（）；RPMI1640培養(yǎng)基（）；胎牛血清（）；臺(tái)盼藍(lán)（）；Percoll分離液（）；PBS緩沖液（）；青霉素（80萬U）及鏈霉素（100萬U）（）胰島素、高血糖素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、地塞米松4.具體實(shí)驗(yàn)步驟： SD 大鼠，氯胺酮80 mg/kg 腹腔內(nèi)麻醉同時(shí)腹腔內(nèi)注射 1 000 U 肝素鈉注射液抗凝固定大鼠仰臥位于超凈工作臺(tái)上 （用前紫外燈照射超凈臺(tái)半小時(shí)），剪去胸腹部體毛，碘伏胸腹部皮膚消毒后，帶無菌手套，鋪洞巾，取腹部正中切口，可見鮮紅的肝臟，暴露出門靜脈和肝下下腔靜脈，用彎頭鉗子鈍性分離門靜脈和下腔靜脈，并在各靜脈下放置1 根 4 零細(xì)線，暫不結(jié)扎，用套管針以約 1

8、5°角在門靜脈遠(yuǎn)端向近端平行刺入 （注意針頭刺入在距離門靜脈 3 個(gè)分支處 0.5 cm，刺入過深勢必影響灌注效果）細(xì)線結(jié)扎后以封閉門靜脈遠(yuǎn)端，再退出金屬針心，并將套管針連接一次輸液器一端，另一端接上輸液瓶 （預(yù)熱灌流液的輸液瓶用保溫套保持溫度以避免溫度下降過快以影響酶的消化活性）輸液瓶高度距離灌流大鼠肝臟 120 cm打開輸液器輸鈕將預(yù)熱至 37 無鈣灌流液 200mL 經(jīng)一次性輸液管道及連接其末端的套管針流入門靜脈，控制流速約 20 mL/min；另一套管針頭立即插入肝下下腔靜脈，細(xì)線結(jié)扎固定以防針頭由下腔靜脈內(nèi)脫出并退出金屬針心，讓血液和灌流液從下腔靜脈流出，用無菌平皿接流出液

9、，保持流出端無菌，同時(shí)打開胸腔結(jié)扎肝上下腔靜脈，數(shù)分鐘后肝臟逐漸腫脹變淡黃色直到下腔靜脈流出液顏色接近無鈣灌流液約 510 min，改輸預(yù)熱至 37 的 0.05%型膠原酶灌流液 100 mL繼續(xù)灌流，更換流出端的平皿，以回收膠原酶以循環(huán)使用，控制約 10 mL/min灌流持續(xù)約 510min， 0.05%型膠原酶灌流過程中，取一根無菌濕棉簽輕輕壓迫肝臟表面，以判斷肝臟消化的程度，待壓迫肝臟后不再回縮表面出現(xiàn)滲出、肝包膜下組織呈龜背狀裂隙時(shí)判斷肝臟已被消化充分，可以終止灌流。離斷肝臟血管、韌帶及系膜，將肝臟完整取下 （注意不要碰破胃腸組織，避免造成污染），置于無菌平皿。用眼科鑷鈍性撕裂肝組織，

10、4 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基終止IV型膠原酶的消化作用，裝入無菌 100 mL 三角燒瓶置搖床上，100 r/min，搖 10 min，所得的肝細(xì)胞懸液經(jīng)三層無菌紗布過濾，以除去一些大的細(xì)胞團(tuán)塊及被膜組織，再裝入 50 mL 離心管，500 r/min，離 心 3 min，棄上清，以4RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸，反復(fù)離心 3 次，以除去血細(xì)胞、肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及一些細(xì)胞碎片和少量的結(jié)締組織。離心之后得到的肝細(xì)胞沉淀以含 4 RPMI1640 完全培養(yǎng)基對細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸，用吸管輕輕反復(fù)吹打肝細(xì)胞懸液使肝細(xì)胞重懸均勻后即制備成肝細(xì)胞懸液。二、原代大鼠肝細(xì)胞的純化 取無菌的 50 mL離心

11、管置管架上，用彎頭吸管沿管壁小心地將肝細(xì)胞懸液和 75%Percoll 分離液按 1:1 鋪層，底層為 75%Percoll 分離液肝細(xì)胞懸液鋪加于上層，盡量減少震蕩， 4 ， 800 r/min， 10 min離心后，離心管液體分四層，頂層為死細(xì)胞，第二層為混合肝細(xì)胞，第三層為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，底層為分離液取第三層肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞用于重懸制成肝細(xì)胞懸液外，另吸取第二層混合肝細(xì)胞，加 PBS 液稀釋，再次小心依次按 1:1:1 分鋪底層 50% Percoll、中層 25% Percoll、頂層混合肝細(xì)胞懸液，盡量減少震蕩， 4 ， 800 r/min， 10min 離心，底層沉淀為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，吸除上層液，用完全培養(yǎng)基重懸底層沉淀的肝細(xì)胞制成肝細(xì)胞懸液取肝細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻后 1 min 內(nèi)滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。三、肝細(xì)胞原代培養(yǎng)詳細(xì)步驟RPMI1640完全培養(yǎng)基( 100 mL·L 1胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)基、青霉素105 U·L 1、鏈霉素100 mg·L 1和胰島素160 U·L 1 ) 調(diào)整肝細(xì)胞懸液細(xì)胞密度，按每孔1 × 106 個(gè)細(xì)胞接種于鋪有肝細(xì)胞懸液的6 孔培養(yǎng)板中，在37 、5