北科大微生物實驗1、細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和染色

1、 實實 驗驗 一一細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和染色細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和染色目的要求目的要求觀察細菌菌落的特征。觀察細菌菌落的特征。掌握簡單染色法和革蘭氏染色法的原理掌握簡單染色法和革蘭氏染色法的原理及操作步驟。及操作步驟。在油鏡下觀察細菌個體的形態(tài)在油鏡下觀察細菌個體的形態(tài)。了解幾種細菌的特殊染色方法，包括芽了解幾種細菌的特殊染色方法，包括芽孢、莢膜及鞭毛染色。孢、莢膜及鞭毛染色。 了解環(huán)境微生物的檢查。了解環(huán)境微生物的檢查。安全事項安全事項微生物微生物酒精燈酒精燈滅菌鍋滅菌鍋玻璃器皿玻璃器皿超凈臺（超凈臺（紫外線紫外線）電器（電器（電爐、微波爐電爐、微波爐） 奧林帕斯奧林帕斯(OLYMPUS)雙筒生

2、物顯微鏡雙筒生物顯微鏡鏡筒鏡筒物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡轉(zhuǎn)換器載物臺載物臺載物臺調(diào)節(jié)鈕載物臺調(diào)節(jié)鈕粗調(diào)節(jié)器粗調(diào)節(jié)器細調(diào)節(jié)器細調(diào)節(jié)器電源電源光強調(diào)節(jié)鈕光強調(diào)節(jié)鈕孔徑光闌孔徑光闌視場光闌視場光闌雙筒目鏡雙筒目鏡攝像頭攝像頭物鏡物鏡鏡座鏡座鏡臂鏡臂熒光發(fā)射裝置熒光發(fā)射裝置奧林帕斯生物顯微鏡的使用方法奧林帕斯生物顯微鏡的使用方法 接通電源。接通電源。 打開主開關。打開主開關。 轉(zhuǎn)動光強調(diào)節(jié)鈕，轉(zhuǎn)動光強調(diào)節(jié)鈕，使亮度適中使亮度適中。 把標本固定在載物臺上。把標本固定在載物臺上。 用低倍物鏡，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)和微調(diào)用低倍物鏡，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)和微調(diào)來進行對焦。來進行對焦。 調(diào)節(jié)雙目鏡筒間距和視度差。調(diào)節(jié)雙目鏡筒間距和視度差。 再適當

3、調(diào)節(jié)照明度。再適當調(diào)節(jié)照明度。 使焦點正確地對準標本。使焦點正確地對準標本。 調(diào)節(jié)孔徑光闌。調(diào)節(jié)孔徑光闌。 依次用低、中、高倍鏡觀察依次用低、中、高倍鏡觀察。油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，下降載物臺，在標本中央滴一滴香柏油，下降載物臺，在標本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，再細調(diào)至看使油鏡鏡頭浸入香柏油中，再細調(diào)至看清物象為止。清物象為止。換片：另換新片，必須從第換片：另換新片，必須從第9條開始操條開始操作。作。 觀察完畢，下降載物臺，取下載物臺上觀察完畢，下降載物臺，取下載物臺上的載玻片，將的載玻片，將4的目鏡對準載物臺，的目鏡對準載物臺，

4、再用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后用擦再用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙沾取少量乙醇鏡紙沾取少量乙醇/水擦去殘留的油，水擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的乙醇最后用擦鏡紙擦去殘留的乙醇/水。水。用畢復原：先將電壓調(diào)節(jié)旋鈕復原，用畢復原：先將電壓調(diào)節(jié)旋鈕復原，關關閉主開關，切斷電源閉主開關，切斷電源。顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項 不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件, ,以免損壞。以免損壞。 鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。 觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。

5、當觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以目視目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。免壓碎玻片或損傷鏡面。 光強要適中，太亮不僅損傷燈泡壽命，也對眼睛有一定的傷光強要適中，太亮不僅損傷燈泡壽命，也對眼睛有一定的傷害，并且無法進行圖像采集。害，并且無法進行圖像采集。 觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成能夠用兩眼觀察的習慣，使兩眼同觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成能夠用兩眼觀察的習慣，使兩眼同時聚焦。時聚焦。 觀察臨時制片時，不要讓玻片中的水分流到載物臺上，更不觀察臨時制片時，不要讓玻片中的水分流到載物臺上，更不能使酸、堿及

6、其它化學藥品與顯微鏡接觸。能使酸、堿及其它化學藥品與顯微鏡接觸。油鏡使用的原理油鏡使用的原理 油鏡，即油浸接物鏡。油鏡，即油浸接物鏡。 當光線由反光鏡通過玻片與當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。低了視野的照明度。 若中間的介質(zhì)是一層油（若中間的介質(zhì)是一層油（其其折射率與玻片的相近折射率與玻片的相近），則），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進光量，從而使物像更野的進光量，從而使物像更加清晰。加清晰?；驹砘驹?(一一)

7、 簡單染色法原理簡單染色法原理(二二) 革蘭氏染色法原理革蘭氏染色法原理(三三) 抗酸染色原理抗酸染色原理(四四) 芽孢染色原理芽孢染色原理(五五) 莢膜染色原理莢膜染色原理(六六) 鞭毛染色原理鞭毛染色原理 染色劑和染色原理染色劑和染色原理微生物染色常用染料如下表：微生物染色常用染料如下表：實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容（簡單染色的方法和步驟）（簡單染色的方法和步驟）涂片涂片自然自然干燥干燥微火固定微火固定染色染色l min沖洗沖洗吸干吸干鏡檢鏡檢實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容（革蘭氏染色的方法（革蘭氏染色的方法和步驟）和步驟）涂片，干燥、固定涂片，干燥、固定草酸銨結(jié)晶紫染液染色草酸銨結(jié)晶紫染液染色lmin，用，用水沖

8、洗水沖洗用革氏碘液媒染用革氏碘液媒染lmin，用水沖去，用水沖去碘液碘液用用95乙醇脫色乙醇脫色10-30s，至乙醇，至乙醇液不呈現(xiàn)紫色液不呈現(xiàn)紫色蕃紅染液復染蕃紅染液復染lmin，用水沖洗，用水沖洗吸干并鏡檢吸干并鏡檢實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容（了解了解抗酸染色的方法和步驟）抗酸染色的方法和步驟）1制片制片 將少量草分枝桿菌制成菌懸液，將少量草分枝桿菌制成菌懸液，80恒溫水浴恒溫水浴3h殺死菌體。殺死菌體。取菌懸液涂片，自然干燥。取菌懸液涂片，自然干燥。2染色染色 滴加石炭酸復紅染液滴加石炭酸復紅染液2滴，覆蓋涂片，在微火上加熱至有蒸滴，覆蓋涂片，在微火上加熱至有蒸氣出現(xiàn)，不斷補充染液，加熱氣出現(xiàn)，不

9、斷補充染液，加熱810min，棄染液。，棄染液。3脫色脫色 用用3鹽酸乙醇液脫色，至乙醇液呈淡紅色或無色。鹽酸乙醇液脫色，至乙醇液呈淡紅色或無色。4水洗水洗 滴加蒸餾水洗去鹽酸乙醇。滴加蒸餾水洗去鹽酸乙醇。5復染復染 加美藍染液染加美藍染液染lmin。6水洗后自然干燥、鏡檢水洗后自然干燥、鏡檢 草分枝桿菌呈現(xiàn)紅色。若用非抗酸性菌作為對照，則菌體草分枝桿菌呈現(xiàn)紅色。若用非抗酸性菌作為對照，則菌體被染成藍色。被染成藍色?？顾崛旧砜顾崛旧?分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多,其其中主要成分為分枝菌酸中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性此物具有抗酸性,染色時染色時與石炭酸復紅結(jié)合

10、牢固與石炭酸復紅結(jié)合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色能抵抗酸性乙醇的脫色作用作用,因此抗酸菌能保持復紅的顏色因此抗酸菌能保持復紅的顏色,達到染色目達到染色目的。的。步驟步驟:萋納石炭酸復紅染色萋納石炭酸復紅染色,加溫促使菌體著加溫促使菌體著色色;3%鹽酸乙醇脫色鹽酸乙醇脫色;呂氏美藍復染呂氏美藍復染,未脫色細未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌菌呈紅色為抗酸性細菌,脫色經(jīng)復染呈藍色的細脫色經(jīng)復染呈藍色的細菌為非抗酸性細菌菌為非抗酸性細菌。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容（了解了解芽孢染色的方法和步驟）芽孢染色的方法和步驟） 孔雀綠染色法：取一干凈載片，在載片中央加一小滴孔雀綠染色法：取一干凈載片，在載片中央加一小滴水，按無

11、菌操作取巨大芽孢桿菌菌體少許混合均勻，水，按無菌操作取巨大芽孢桿菌菌體少許混合均勻，制成涂片，風干固定后，在涂菌處滴加制成涂片，風干固定后，在涂菌處滴加7.6的孔雀綠的孔雀綠飽和水溶液，間斷加熱染色飽和水溶液，間斷加熱染色10min后后(注意添加染液勿注意添加染液勿使涂片干燥使涂片干燥)，用水沖洗。再用，用水沖洗。再用0.5蕃紅液染色蕃紅液染色lmin，水洗，自然干燥后鏡檢。芽孢被染上綠色，營養(yǎng)體呈水洗，自然干燥后鏡檢。芽孢被染上綠色，營養(yǎng)體呈現(xiàn)紅色。現(xiàn)紅色。原理是芽胞壁較厚，通透性低而不易著原理是芽胞壁較厚，通透性低而不易著色，但芽胞一旦著色就很難被脫色。因色，但芽胞一旦著色就很難被脫色。因

12、此，先用著色能力強的染液（如孔雀綠此，先用著色能力強的染液（如孔雀綠或石炭酸復紅）在加熱條件下染色，使或石炭酸復紅）在加熱條件下染色，使染料既可進入菌體也可進入芽胞，水洗染料既可進入菌體也可進入芽胞，水洗脫色時菌體中的染料被洗脫，而芽胞中脫色時菌體中的染料被洗脫，而芽胞中的染料仍保留。再用對比度大的復染劑的染料仍保留。再用對比度大的復染劑染色后，菌體染上復染劑顏色，而芽胞染色后，菌體染上復染劑顏色，而芽胞仍為原來的顏色，這樣兩者區(qū)別開來。仍為原來的顏色，這樣兩者區(qū)別開來。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容（了解了解莢膜染色的方法和步驟）莢膜染色的方法和步驟）1 1制片制片 加一滴加一滴6 6葡萄糖水溶液于載片一

13、端，挑取少量膠質(zhì)芽孢葡萄糖水溶液于載片一端，挑取少量膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合，再加一滴黑色素充分混勻。用推片法制片，桿菌與其混合，再加一滴黑色素充分混勻。用推片法制片，將菌液鋪成薄層，自然干燥。將菌液鋪成薄層，自然干燥。2 2固定固定 滴加滴加l l2 2滴無水乙醇覆蓋涂片，固定滴無水乙醇覆蓋涂片，固定lminlmin，自然干燥。，自然干燥。3 3染色，沖洗染色，沖洗 滴加結(jié)晶紫，染色滴加結(jié)晶紫，染色2min2min，用水輕輕沖洗，干燥后鏡檢。，用水輕輕沖洗，干燥后鏡檢。 有莢膜的菌、菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無有莢膜的菌、菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無色透明圈。無莢膜的菌，由于

14、干燥菌體收縮，菌體四周也可色透明圈。無莢膜的菌，由于干燥菌體收縮，菌體四周也可能出現(xiàn)一圈狹窄的不著色環(huán)，但這不是莢膜，莢膜不著色的能出現(xiàn)一圈狹窄的不著色環(huán)，但這不是莢膜，莢膜不著色的部分寬。部分寬。莢膜是包圍在細菌細胞外的一層黏液狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)，莢膜是包圍在細菌細胞外的一層黏液狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)，其成分為多糖、糖蛋白或多肽其成分為多糖、糖蛋白或多肽。由于莢膜與染料的親和。由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可溶于水、易在用水沖洗時被除力弱、不易著色；而且可溶于水、易在用水沖洗時被除去。所以通常用負染色法染色，使菌體和背景著色，而去。所以通常用負染色法染色，使菌體和背景著色，而莢膜不著色，在菌體

15、周圍形成一透明圈。由于莢膜含水莢膜不著色，在菌體周圍形成一透明圈。由于莢膜含水量高，制片時通常不用熱固定，以免變形影響觀察。量高，制片時通常不用熱固定，以免變形影響觀察。1、實驗材料、實驗材料莢膜染色液。莢膜染色液。菌種。有莢膜的細菌。菌種。有莢膜的細菌。其他。玻片、接種環(huán)、吸管等。其他。玻片、接種環(huán)、吸管等。2、注意事項、注意事項莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。玻片必須潔凈無油跡，以免涂片時混合液不能均勻散玻片必須潔凈無油跡，以免涂片時混合液不能均勻散開。開。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容（了解了解鞭毛染色的方法和步驟）鞭毛染色的方法和步驟）1

16、1載片的清洗載片的清洗：將載片洗凈浸泡在：將載片洗凈浸泡在95乙醇中備用。乙醇中備用。2 2實驗菌種的準備實驗菌種的準備：將枯草芽孢桿菌在新制備的肉膏蛋白胨斜：將枯草芽孢桿菌在新制備的肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上面培養(yǎng)基上(斜面下部要有少量冷凝水斜面下部要有少量冷凝水)，連續(xù)移種，連續(xù)移種34次，每次，每次培養(yǎng)次培養(yǎng)1218h，最后一次培養(yǎng)，最后一次培養(yǎng)1216h。3 3制片制片：擦干載片，在載片一端加一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑?。翰粮奢d片，在載片一端加一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取少許菌苔底部有水部分的菌體少許菌苔底部有水部分的菌體(注意不要挑出培養(yǎng)基注意不要挑出培養(yǎng)基)，將接種，將接種環(huán)懸放在水滴中片刻，

17、將載片稍傾斜，使菌液隨水滴緩緩流環(huán)懸放在水滴中片刻，將載片稍傾斜，使菌液隨水滴緩緩流到另一端，可再返轉(zhuǎn)一次使菌液流經(jīng)面積擴大，然后放平，到另一端，可再返轉(zhuǎn)一次使菌液流經(jīng)面積擴大，然后放平，自然干燥。自然干燥。4 4染色染色（利夫森氏染色法）利夫森氏染色法） ：用蠟筆將涂菌區(qū)圈起，滴加染液，用蠟筆將涂菌區(qū)圈起，滴加染液，過數(shù)分鐘后，當染液的過數(shù)分鐘后，當染液的1/2以上區(qū)域表面出現(xiàn)金屬光澤膜時，以上區(qū)域表面出現(xiàn)金屬光澤膜時，用水輕輕將金屬膜及染液沖洗干凈，自然干燥。用水輕輕將金屬膜及染液沖洗干凈，自然干燥。鏡檢鏡檢時應在涂片上按順序進行觀察，經(jīng)常是在部分涂片鏡檢鏡檢時應在涂片上按順序進行觀察，經(jīng)

18、常是在部分涂片區(qū)的菌體染出鞭毛，菌體及鞭毛均為紅色。區(qū)的菌體染出鞭毛，菌體及鞭毛均為紅色。鞭毛是細菌的運動鞭毛是細菌的運動“器官器官”，細菌是否具有鞭毛，以及鞭毛的數(shù)目和附著于細菌，細菌是否具有鞭毛，以及鞭毛的數(shù)目和附著于細菌的位置是細菌的一項重要形態(tài)特征。細菌的鞭毛很纖細。除了很少數(shù)形成鞭毛束的位置是細菌的一項重要形態(tài)特征。細菌的鞭毛很纖細。除了很少數(shù)形成鞭毛束（由許多根鞭毛構(gòu)成）的細菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛的存在外，多數(shù)（由許多根鞭毛構(gòu)成）的細菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛的存在外，多數(shù)細菌的鞭毛均不能用光學顯微鏡直接觀察到。要用普通光學顯微鏡觀察細菌的鞭細菌的鞭毛均不能用光學顯

19、微鏡直接觀察到。要用普通光學顯微鏡觀察細菌的鞭毛，必須用鞭毛染色法。毛，必須用鞭毛染色法。鞭毛染色的基本原理是在染色前先用媒染劑處理，使它沉積在鞭毛上，使鞭鞭毛染色的基本原理是在染色前先用媒染劑處理，使它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。毛直徑加粗，然后再進行染色。1、實驗材料、實驗材料鞭毛染色液。鞭毛染色液。菌種。有鞭毛的細菌。菌種。有鞭毛的細菌。其他。玻片、接種環(huán)、吸管等。其他。玻片、接種環(huán)、吸管等。2、注意事項、注意事項良好的培養(yǎng)物是鞭毛染色成功的基本條件，不宜用陳舊培養(yǎng)物作鞭毛染色的菌良好的培養(yǎng)物是鞭毛染色成功的基本條件，不宜用陳舊培養(yǎng)物作鞭毛染色的菌種材料，因為老齡細菌鞭

20、毛容易脫落。種材料，因為老齡細菌鞭毛容易脫落。玻片應光滑、潔凈，不可帶油跡。不潔凈的載玻片可經(jīng)含適量洗衣粉的水中玻片應光滑、潔凈，不可帶油跡。不潔凈的載玻片可經(jīng)含適量洗衣粉的水中煮沸約煮沸約20min，取出后用清水充分洗凈，瀝干水后置，取出后用清水充分洗凈，瀝干水后置95%酒精中處理，用時取酒精中處理，用時取出在火焰上燒去酒精及可能殘留的油跡。出在火焰上燒去酒精及可能殘留的油跡。挑取菌時，盡可能不帶培養(yǎng)基。挑取菌時，盡可能不帶培養(yǎng)基。配制合格的染色劑（尤其是配制合格的染色劑（尤其是B液液）、充分洗去）、充分洗去A液再加液再加B液、掌握好液、掌握好B液的染液的染色時間均是鞭毛染色成敗的關鍵。色時

21、間均是鞭毛染色成敗的關鍵。實驗材料實驗材料 (一一)菌種菌種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。(二二)染液染液 簡單染色：草酸銨結(jié)晶紫染液。簡單染色：草酸銨結(jié)晶紫染液。 革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶紫染液、革氏碘液、革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶紫染液、革氏碘液、95乙醇、蕃紅染液。乙醇、蕃紅染液。實驗材料實驗材料 (三三)標本標本細菌三型、四聯(lián)球菌、莢膜、芽孢。細菌三型、四聯(lián)球菌、莢膜、芽孢。(四四)其他物品其他物品無菌水、顯微鏡、載片、蓋玻片、酒精燈、無菌水、顯微鏡、載片、蓋玻片、酒精燈、吸水紙、香柏油、擦鏡紙、接種環(huán)。吸水紙、香柏油、擦鏡紙、接種環(huán)。肉膏蛋

22、白胨培養(yǎng)基平板。肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容 (一一) 成片觀察成片觀察(1)觀察細菌三型涂片，比較球菌、桿菌和觀察細菌三型涂片，比較球菌、桿菌和螺旋菌的形態(tài)。螺旋菌的形態(tài)。(2)觀察四聯(lián)球菌的形態(tài)及觀察四聯(lián)球菌的形態(tài)及排列排列方式。方式。(3)觀察觀察蘇云金芽孢桿菌的芽孢，褐球固氮蘇云金芽孢桿菌的芽孢，褐球固氮菌的莢膜的形態(tài)。菌的莢膜的形態(tài)。實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容 (二二)觀察平板上的細菌菌落，識別大腸桿觀察平板上的細菌菌落，識別大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的菌落特征。的菌落特征。注意菌落的形狀、高度、大小、顏色，注意菌落的形狀、高度、大小、顏色，是否濕潤、光澤、透明度、邊緣狀況是否濕潤、光澤