生物樣品中藥物定量分析的指導(dǎo)原則與實驗實施

1、2015.6.302015.6.30方法學(xué)確證是整個藥代動力學(xué)研究的基礎(chǔ)方法學(xué)確證是整個藥代動力學(xué)研究的基礎(chǔ)。所有所有藥代動力學(xué)研究結(jié)果，都依賴于生物樣品的測藥代動力學(xué)研究結(jié)果，都依賴于生物樣品的測定，只有可靠的方法才能得出可靠的結(jié)果定，只有可靠的方法才能得出可靠的結(jié)果。通過通過準(zhǔn)確度、精密度、特異性、靈敏度、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度、精密度、特異性、靈敏度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性穩(wěn)定性等研究建立了測定方法，得到了等研究建立了測定方法，得到了標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線后，后，在檢測過程中還應(yīng)進行在檢測過程中還應(yīng)進行方法學(xué)質(zhì)控方法學(xué)質(zhì)控，制備，制備隨行標(biāo)準(zhǔn)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線并對質(zhì)控樣品進行測定，以確保檢測方法的可并對質(zhì)控樣品

2、進行測定，以確保檢測方法的可靠性靠性。CFDACFDA關(guān)于相關(guān)生物樣品定量分析的要求關(guān)于相關(guān)生物樣品定量分析的要求化學(xué)藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則化學(xué)藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則化學(xué)藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則90129012生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則原則20052005年陸續(xù)在相年陸續(xù)在相關(guān)研究中頒布關(guān)研究中頒布中國藥典中國藥典20152015年版四部年版四部國外相關(guān)指導(dǎo)原則國外相關(guān)指導(dǎo)原

3、則FDAFDA：Guidance for Industry Bioanalytical Guidance for Industry Bioanalytical Method ValidationMethod ValidationEMEAEMEA：Guideline on bioanalytical method Guideline on bioanalytical method validationvalidation20132013年修訂版本年修訂版本20122012年版本年版本CFDACFDA1.1. 范圍范圍2.2. 生物分析生物分析方法驗證方法驗證2.1 2.1 分析方法的完整驗證分析

4、方法的完整驗證2.1.1 2.1.1 選擇性選擇性2.1.2 2.1.2 殘留殘留2.1.3 2.1.3 定量下限定量下限2.1.4 2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線2.1.5 2.1.5 準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度2.1.6 2.1.6 精密度精密度2.1.7 2.1.7 稀釋可靠性稀釋可靠性2.1.8 2.1.8 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)2.1.9 2.1.9 穩(wěn)定性穩(wěn)定性2.2 2.2 部分驗證部分驗證2.3 2.3 交叉驗證交叉驗證3. 3. 試驗樣品分析試驗樣品分析3.1 3.1 分析批分析批3.2 3.2 分析批的接受標(biāo)準(zhǔn)分析批的接受標(biāo)準(zhǔn)3.3 3.3 校正范圍校正范圍3.4 3.4 試驗樣品的重新分析和報

5、告值選擇試驗樣品的重新分析和報告值選擇3.5 3.5 完整性完整性3.6 3.6 用于評價方法重現(xiàn)性的試驗樣品再分析用于評價方法重現(xiàn)性的試驗樣品再分析EMEAEMEA2.1.1 2.1.1 選擇性選擇性2.1.2 2.1.2 殘留殘留2.1.3 2.1.3 定量下限定量下限2.1.4 2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線2.1.5 2.1.5 準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度2.1.6 2.1.6 精密度精密度2.1.7 2.1.7 稀釋稀釋可靠性可靠性2.1.8 2.1.8 基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)2.1.9 2.1.9 穩(wěn)定性穩(wěn)定性FDAFDA1. 1. 范圍范圍測定對象確定測定對象確定生物基質(zhì)中的藥物濃度。生物基質(zhì)中的藥物

6、濃度。適合于非臨床或臨床試驗樣品實際分析的基本要求。適合于非臨床或臨床試驗樣品實際分析的基本要求。規(guī)定規(guī)定部分驗證部分驗證或或交叉驗證交叉驗證的適用范圍。的適用范圍。2.1 2.1 完整驗證完整驗證每個物種和每種基質(zhì)進行完整驗證。每個物種和每種基質(zhì)進行完整驗證。難以獲得相同基質(zhì)，可以采用適當(dāng)基質(zhì)替代并給出難以獲得相同基質(zhì)，可以采用適當(dāng)基質(zhì)替代并給出理由。理由。完整完整驗證包括：驗證包括：選擇性、定量下限、響應(yīng)函數(shù)和校選擇性、定量下限、響應(yīng)函數(shù)和校正范圍、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、分析物的穩(wěn)正范圍、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、分析物的穩(wěn)定性。定性。對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

7、的溶液溶液+ +空白生物基質(zhì)空白生物基質(zhì)= =校正標(biāo)樣色譜法需要使用色譜法需要使用內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需要提供：對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需要提供： 分析分析證書、儲存條件、失效日期、批號。證書、儲存條件、失效日期、批號。內(nèi)標(biāo)：內(nèi)標(biāo)： 證明可適用，即無干擾。證明可適用，即無干擾。質(zhì)譜分析推薦使用質(zhì)譜分析推薦使用同位素內(nèi)標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)區(qū)分目標(biāo)區(qū)分目標(biāo)分析物分析物和和內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)與基質(zhì)的與基質(zhì)的內(nèi)源性組分內(nèi)源性組分或樣品或樣品中中其他組分（代謝產(chǎn)物或共同服用的其他藥物）其他組分（代謝產(chǎn)物或共同服用的其他藥物）。6 6個不同來源的空白基質(zhì)分別分析。個不同來源的空白基質(zhì)分別分析。如如有干擾有干擾，則干擾的峰面積小于，則干

8、擾的峰面積小于LLOQLLOQ的峰面積的的峰面積的20%20%，小于內(nèi)標(biāo)峰面積的，小于內(nèi)標(biāo)峰面積的5%5%，可以接受。，可以接受。在新藥研究中需要按照要求在報告上提供相應(yīng)數(shù)在新藥研究中需要按照要求在報告上提供相應(yīng)數(shù)量的典型色譜圖量的典型色譜圖J. Wen et al. / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43 (2007) 655658如果待測組分是內(nèi)源性成分？如果待測組分是內(nèi)源性成分？Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 11511159樣品處理用的水及流動相中不含有

9、樣品處理用的水及流動相中不含有I I空白生物樣品中的空白生物樣品中的I I屬屬于內(nèi)源性物質(zhì)于內(nèi)源性物質(zhì)空白生物樣品標(biāo)準(zhǔn)添空白生物樣品標(biāo)準(zhǔn)添加加I I依舊可以測定依舊可以測定n如果待測組分是內(nèi)源性成分？如果待測組分是內(nèi)源性成分？添加添加LLOQLLOQ濃度濃度添加添加MQCMQC濃度濃度實測樣品實測樣品1. 1. 證明處理溶劑（包括流動相）中證明處理溶劑（包括流動相）中未有需要測定的成分未有需要測定的成分2. 2. 證明內(nèi)源性成分存在測定成分證明內(nèi)源性成分存在測定成分3. LLOQ3. LLOQ添加圖譜顯示添加測定成添加圖譜顯示添加測定成分后，峰面積增加，并輔以數(shù)據(jù)說分后，峰面積增加，并輔以數(shù)據(jù)

10、說明（標(biāo)準(zhǔn)曲線）明（標(biāo)準(zhǔn)曲線）Lijun Cui et al./ Biomed. Chromatogr. 2009; 23: 11511159如果存在外源性非測定成分影響？（例如中西藥合并給藥）如果存在外源性非測定成分影響？（例如中西藥合并給藥）C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 854 (2007) 4856空白血漿空白血漿苯丙胺鹽酸偽麻黃堿苯海拉明空白血漿空白血漿+ +生姜提取物生姜提取物充分考察同時給藥的成分是否會影充分考察同時給藥的成分是否會影響待測成分的專一檢測響待測成分的專一檢測C. Wang et al. / J. Chromatogr. B 85

11、4 (2007) 48560.5ng/ml0.5ng/ml1.0ng/ml1.0ng/ml4.10 ng/ml4.10 ng/ml14.05 ng/ml14.05 ng/ml空白血漿空白血漿+ +標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品給藥速效抗暈?zāi)z囊后給藥速效抗暈?zāi)z囊后24h24h血樣濃度血樣濃度前一前一針進樣的殘留對后一針進樣的干擾。針進樣的殘留對后一針進樣的干擾。一般多發(fā)生在高濃度進樣后。一般多發(fā)生在高濃度進樣后。先進一針工作曲線的最高濃度，再緊接著進一針空先進一針工作曲線的最高濃度，再緊接著進一針空白，觀察是否有干擾，干擾峰面積白，觀察是否有干擾，干擾峰面積小于小于LLOQLLOQ的峰的峰面積的面積的20%2

12、0%，小于內(nèi)標(biāo)峰面積的，小于內(nèi)標(biāo)峰面積的5%5%，可以接受，可以接受。如干擾，需要消除。如干擾，需要消除。犬血漿中的鹽犬血漿中的鹽酸克倫特羅的酸克倫特羅的測定測定A.空白樣品；空白樣品；B.B. 0.1 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)血漿；血漿；C.進樣進樣10 ng/ml標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品后進準(zhǔn)血漿樣品后進樣的空白樣品樣的空白樣品 殘留殘留洗針的溶劑、次數(shù)；提取溶劑；復(fù)溶比例等重新優(yōu)化能夠被可靠定量的樣品中分析物的最低濃度，具有能夠被可靠定量的樣品中分析物的最低濃度，具有可接受的準(zhǔn)確度和精密度?？山邮艿臏?zhǔn)確度和精密度。是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點。是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點。應(yīng)該滿足預(yù)期的濃度與實驗?zāi)康?。?yīng)該滿足預(yù)期的濃度與

13、實驗?zāi)康摹?zhǔn)確度應(yīng)準(zhǔn)確度應(yīng)在標(biāo)示值的在標(biāo)示值的+/-20+/-20% %范圍范圍內(nèi)。內(nèi)。變異系數(shù)不得超過變異系數(shù)不得超過20%20%。指定濃度范圍內(nèi)評價儀器對分析物的響應(yīng)程度。指定濃度范圍內(nèi)評價儀器對分析物的響應(yīng)程度。制備各個濃度的校正標(biāo)樣制備各個濃度的校正標(biāo)樣基質(zhì)相同?；|(zhì)相同。每個分析批都應(yīng)該有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個分析批都應(yīng)該有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。6 6個校正濃度水平個校正濃度水平+ +空白樣品空白樣品+ +零濃度樣品零濃度樣品（空白（空白+ +內(nèi)標(biāo)）內(nèi)標(biāo)）驗證中需要評價驗證中需要評價3 3條標(biāo)準(zhǔn)曲線。條標(biāo)準(zhǔn)曲線?；鼗厮銤舛葢?yīng)該在標(biāo)示值的算濃度應(yīng)該在標(biāo)示值的+/-15%+/-15%，LLOQ+/-

14、20%LLOQ+/-20%之內(nèi)之內(nèi)回算濃度偏差回算濃度偏差= =【（實測值標(biāo)示值）（實測值標(biāo)示值）/ /標(biāo)示值標(biāo)示值】X100%X100%繪制工作曲線評價干擾當(dāng)線性范圍較寬當(dāng)線性范圍較寬的時候，推薦采的時候，推薦采用用加權(quán)的方法加權(quán)的方法對對標(biāo)準(zhǔn)曲線進行計標(biāo)準(zhǔn)曲線進行計算，以使低濃度算，以使低濃度點計算得比較準(zhǔn)點計算得比較準(zhǔn)確確。即。即低濃度點低濃度點滿足回算的要求。滿足回算的要求。權(quán)重濃度峰面積比11/x1/x2100.102139.7 117.7 103.6 200.139112.9 102.3 97.6 500.24192.6 88.7 89.5 1000.44393.3 91.7 94

15、.8 2000.86295.3 95.0 99.2 5002.284104.3 104.7 110.1 10004.30999.2 99.8 105.2 INTERCEPT0.04190.051780.06014 SLOPE0.0043010.0042650.00404R20.99910.99910.9942準(zhǔn)確度是指在確定的分析條件下，測得的生物樣品準(zhǔn)確度是指在確定的分析條件下，測得的生物樣品濃度與真實濃度的接近濃度與真實濃度的接近程度。程度。校正標(biāo)樣校正標(biāo)樣繪制工作曲線。繪制工作曲線。質(zhì)控質(zhì)控樣品樣品評估準(zhǔn)確度。評估準(zhǔn)確度。用用4 4個濃度評價個濃度評價 定量定量下限下限 低濃度低濃度QC

16、QCLLOQLLOQ的的3 3倍以內(nèi)倍以內(nèi) 中中濃度濃度QCQC標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度 高濃度高濃度QCQC標(biāo)準(zhǔn)曲線上限的標(biāo)準(zhǔn)曲線上限的75%75%二者需要分別配制，二者需要分別配制，即儲備液不相同即儲備液不相同+/-20%+/-20%+/-15%+/-15%批批內(nèi)準(zhǔn)確度：內(nèi)準(zhǔn)確度：1 1個分析批進行驗證個分析批進行驗證，每個濃度至少，每個濃度至少5 5個樣品。個樣品。批批間準(zhǔn)確度：間準(zhǔn)確度：3 3個個分析批進行驗證，且至少進行分析批進行驗證，且至少進行兩兩天天，每個濃度至少，每個濃度至少5 5個樣品。個樣品。分析物重復(fù)測定的接近程度。分析物重復(fù)測定的接近程度。測量測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏

17、差（變異系數(shù)）。值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）。采用與準(zhǔn)確度驗證相同的分析批結(jié)果進行計算。采用與準(zhǔn)確度驗證相同的分析批結(jié)果進行計算。4 4個濃度驗證。個濃度驗證。定量定量下限變異系數(shù)不超過下限變異系數(shù)不超過20%20%。其余濃度點不超過其余濃度點不超過15%15%。判斷樣品稀釋后是否會影響定量的準(zhǔn)確度和精密度。判斷樣品稀釋后是否會影響定量的準(zhǔn)確度和精密度。配制高于定量上限濃度的樣品。配制高于定量上限濃度的樣品。用空白基質(zhì)稀釋該樣品。用空白基質(zhì)稀釋該樣品。每個稀釋因子至少測定每個稀釋因子至少測定5 5個數(shù)據(jù)，其準(zhǔn)確度和精密個數(shù)據(jù)，其準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)在度應(yīng)在+/-15%+/-15%之內(nèi)。之內(nèi)。質(zhì)譜方

18、法應(yīng)該考察基質(zhì)效應(yīng)。質(zhì)譜方法應(yīng)該考察基質(zhì)效應(yīng)。采用至少采用至少6 6批來自不同供體的基質(zhì)，不可以合并基批來自不同供體的基質(zhì)，不可以合并基質(zhì)。質(zhì)。選擇高、低兩個質(zhì)控濃度進行。選擇高、低兩個質(zhì)控濃度進行。求求算不同濃度的基質(zhì)因子。算不同濃度的基質(zhì)因子。計算計算內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子= =分析物基質(zhì)因子分析物基質(zhì)因子/ /內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)基質(zhì)因子基質(zhì)因子變異系數(shù)變異系數(shù)15%15%空白血漿沉淀蛋白空白血漿沉淀蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度濃度C純凈溶液純凈溶液濃度濃度CQC血漿沉淀蛋白血漿沉淀蛋白濃度濃度CSet 1Set 2Set 3最終進樣檢測濃度相同最終進樣檢測濃度相同 基質(zhì)因子基質(zhì)因子 10

19、0%Set 2Set 1選擇結(jié)構(gòu)類似的化選擇結(jié)構(gòu)類似的化合物為內(nèi)標(biāo)可以很合物為內(nèi)標(biāo)可以很好的消除基質(zhì)效應(yīng)好的消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，應(yīng)用峰面的影響，應(yīng)用峰面積比值進行定量，積比值進行定量，其基質(zhì)效應(yīng)約為其基質(zhì)效應(yīng)約為100%100%分析物基質(zhì)分析物基質(zhì)因子因子內(nèi)標(biāo)基質(zhì)內(nèi)標(biāo)基質(zhì)因子因子內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子因子選擇低濃度和高濃度質(zhì)控樣品進行驗證。選擇低濃度和高濃度質(zhì)控樣品進行驗證。預(yù)處理后或者在相應(yīng)條件儲存后立即分析得到該條預(yù)處理后或者在相應(yīng)條件儲存后立即分析得到該條件下數(shù)據(jù)。件下數(shù)據(jù)。制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，求算上述質(zhì)控樣品的濃度，與制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，求算上述質(zhì)控樣品的濃度，與標(biāo)示濃度比較，均

20、值應(yīng)與標(biāo)示濃度的偏差在標(biāo)示濃度比較，均值應(yīng)與標(biāo)示濃度的偏差在+/-+/-15%15%之內(nèi)。之內(nèi)。【不是比較色譜峰面積不是比較色譜峰面積】穩(wěn)定性的考察穩(wěn)定性的考察時間尺度時間尺度應(yīng)該不小于試驗樣品的儲存時間及應(yīng)該不小于試驗樣品的儲存時間及相應(yīng)條件下的處理方式或時間。相應(yīng)條件下的處理方式或時間。分析物和內(nèi)標(biāo)的儲備液和工作溶液的穩(wěn)定性。分析物和內(nèi)標(biāo)的儲備液和工作溶液的穩(wěn)定性?；|(zhì)中分析物冷凍和融化穩(wěn)定性?；|(zhì)中分析物冷凍和融化穩(wěn)定性?；|(zhì)中分析物在冰箱儲存的長期穩(wěn)定性?；|(zhì)中分析物在冰箱儲存的長期穩(wěn)定性。處理處理過的樣品在室溫下或在試驗過程儲存條件下的穩(wěn)定性。過的樣品在室溫下或在試驗過程儲存條件下的

21、穩(wěn)定性。處理處理過的樣品在自動進樣器溫度下的穩(wěn)定性。過的樣品在自動進樣器溫度下的穩(wěn)定性。儲存儲存前預(yù)處理的基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性。前預(yù)處理的基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性。儲備液穩(wěn)定性儲備液穩(wěn)定性：4 4度冰箱或者度冰箱或者-20-20度冰箱度冰箱長期冷凍穩(wěn)定性長期冷凍穩(wěn)定性：-20-20度或者度或者-80-80度冰箱度冰箱凍融穩(wěn)定性凍融穩(wěn)定性：3 3個凍融循環(huán)（冷凍個凍融循環(huán)（冷凍8h8h以上）以上）自動進樣器穩(wěn)定性自動進樣器穩(wěn)定性：預(yù)處理后放置自動進樣器上，：預(yù)處理后放置自動進樣器上，時間長短與分析批有關(guān)時間長短與分析批有關(guān)室溫穩(wěn)定性室溫穩(wěn)定性：室溫放置的穩(wěn)定性，與前處理一個分：室溫放置的穩(wěn)定性，與前

22、處理一個分析批有關(guān)析批有關(guān)采血后全血穩(wěn)定性采血后全血穩(wěn)定性：與藥物是否易降解有關(guān)：與藥物是否易降解有關(guān)分析方法的轉(zhuǎn)移分析方法的轉(zhuǎn)移儀器的改變儀器的改變校正濃度范圍的改變校正濃度范圍的改變樣品體積的改變樣品體積的改變改變基質(zhì)或者物種改變基質(zhì)或者物種改變抗凝劑改變抗凝劑改變樣品處理步驟改變樣品處理步驟改變儲存條件改變儲存條件CFDACFDA：并未給出如何部分驗證，：并未給出如何部分驗證，究竟應(yīng)該選擇哪些部分驗證，因究竟應(yīng)該選擇哪些部分驗證，因此需要自行判斷并說明理由。此需要自行判斷并說明理由。EMEAEMEA：部分驗證可以少到測定：部分驗證可以少到測定批間精密度和準(zhǔn)確度，也可以至批間精密度和準(zhǔn)確度

23、，也可以至幾乎全部驗證內(nèi)容。幾乎全部驗證內(nèi)容。應(yīng)用不同的方法從一項或多項試驗獲得數(shù)據(jù)，或者應(yīng)用不同的方法從一項或多項試驗獲得數(shù)據(jù)，或者應(yīng)用同一方法從不同試驗地點獲得數(shù)據(jù)時，需要互應(yīng)用同一方法從不同試驗地點獲得數(shù)據(jù)時，需要互相比較數(shù)據(jù)，應(yīng)該進行分析方法的交叉驗證。相比較數(shù)據(jù)，應(yīng)該進行分析方法的交叉驗證。同一同一份質(zhì)控或者試驗樣品被兩種分析方法測定，評份質(zhì)控或者試驗樣品被兩種分析方法測定，評價均值的差異。價均值的差異。質(zhì)控質(zhì)控樣品：樣品：+/-15%+/-15%以內(nèi)以內(nèi)試驗樣品：試驗樣品：+/-20%+/-20%以內(nèi)以內(nèi)3.1 3.1 分析批分析批空白樣品空白樣品零濃度樣品零濃度樣品校正標(biāo)樣校正標(biāo)

24、樣至少至少6 6個（與驗證相同）個（與驗證相同）質(zhì)控樣品質(zhì)控樣品低、中、高低、中、高3 3個濃度，各個濃度，各2 2份（不少于份（不少于試驗樣品總數(shù)的試驗樣品總數(shù)的5%5%）- -分散處理分散處理試驗樣品試驗樣品校正標(biāo)樣：校正標(biāo)樣： 回算濃度偏差在標(biāo)示值的回算濃度偏差在標(biāo)示值的+/-15%+/-15%以內(nèi)。以內(nèi)。 定量定量下限下限+/-20%+/-20%以內(nèi)以內(nèi) 不不少于少于6 6個標(biāo)樣符合上述要求。校正標(biāo)樣越多，需要個標(biāo)樣符合上述要求。校正標(biāo)樣越多，需要75%75%的標(biāo)樣的標(biāo)樣符合符合質(zhì)控樣品：質(zhì)控樣品： 準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度+/-15%+/-15%以內(nèi)以內(nèi) 67%67%的質(zhì)控樣品符合的質(zhì)控樣品符合

25、 不不符合的應(yīng)該不在同一個濃度水平符合的應(yīng)該不在同一個濃度水平如不符合，重新測試。如不符合，重新測試。試驗樣品分析濃度范圍比驗證時候工作曲線試驗樣品分析濃度范圍比驗證時候工作曲線窄窄 調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍和質(zhì)控樣品濃度調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍和質(zhì)控樣品濃度 或者加入新的質(zhì)控樣品濃度或者加入新的質(zhì)控樣品濃度試驗樣品分析試驗樣品分析濃度濃度高高于定量上限于定量上限 延伸標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，增加額外濃度的質(zhì)延伸標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，增加額外濃度的質(zhì)控控樣品樣品 或者改變試驗樣品濃度（稀釋）或者改變試驗樣品濃度（稀釋）至少應(yīng)該有2個質(zhì)控樣品濃度落在試驗樣品的濃度范圍內(nèi)改變標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要改變標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要重新進行方法學(xué)驗證（部分

26、驗證）重新進行方法學(xué)驗證（部分驗證）事先制定事先制定SOPSOP確定重新分析的理由和選擇報告值的確定重新分析的理由和選擇報告值的標(biāo)準(zhǔn)，并在報告中提供重新分析的樣品數(shù)目及比例。標(biāo)準(zhǔn)，并在報告中提供重新分析的樣品數(shù)目及比例。主要理由：主要理由： 校正標(biāo)校正標(biāo)樣或質(zhì)控樣品不合格樣或質(zhì)控樣品不合格 內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)與校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)差異顯著內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)與校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標(biāo)響應(yīng)差異顯著 儀器功能異?；蛘哌M樣不當(dāng)儀器功能異常或者進樣不當(dāng) 高于定量上限或者低于定量下限高于定量上限或者低于定量下限 空白或安慰劑樣品中測到分析物空白或安慰劑樣品中測到分析物 色譜圖難看色譜圖難看不接受由于藥不接受由于藥

27、動學(xué)行為不佳動學(xué)行為不佳而重新分析的而重新分析的理由理由在在SOPSOP中應(yīng)該對中應(yīng)該對色色譜的譜的積分和重新積分積分和重新積分進行規(guī)定。進行規(guī)定。任何偏移任何偏移SOPSOP的色譜積分都應(yīng)該在報告中討論。的色譜積分都應(yīng)該在報告中討論。色色譜積分參數(shù)、重新積分參數(shù)、初始積分結(jié)果和調(diào)譜積分參數(shù)、重新積分參數(shù)、初始積分結(jié)果和調(diào)整后的積分結(jié)果都需要在實驗室存檔，并備查。整后的積分結(jié)果都需要在實驗室存檔，并備查。在過了若干天后，對試驗樣品在另外一個分析批進在過了若干天后，對試驗樣品在另外一個分析批進行重新分析，行重新分析，評價實際樣品測定的準(zhǔn)確度。評價實際樣品測定的準(zhǔn)確度。一般重新分析一般重新分析10

28、%10%的樣品。的樣品。如果樣品總數(shù)超出如果樣品總數(shù)超出10001000，則超出部分重新分析，則超出部分重新分析5%5%。建議選擇消除相和建議選擇消除相和CmaxCmax附近的樣品再分析。附近的樣品再分析。評價指標(biāo)評價指標(biāo)= =（重新測定濃度（重新測定濃度- -初始濃度）初始濃度）/（重新測（重新測定濃度定濃度+ +初始濃度）初始濃度）/2/2* *100%100%至少至少67%67%的復(fù)測樣品的結(jié)果在的復(fù)測樣品的結(jié)果在+/-20%+/-20%之內(nèi)。之內(nèi)。以下情況需要再分析：以下情況需要再分析： 毒代動力學(xué)，每個物種毒代動力學(xué)，每個物種1 1次次 關(guān)鍵性的生物等效性試驗關(guān)鍵性的生物等效性試驗

29、首次用于人體或者患者的藥物試驗首次用于人體或者患者的藥物試驗 首次用于肝腎功能不全患者的藥物試驗首次用于肝腎功能不全患者的藥物試驗全部源數(shù)據(jù)應(yīng)該以其原始格式保存，并根據(jù)要求提全部源數(shù)據(jù)應(yīng)該以其原始格式保存，并根據(jù)要求提供。供。應(yīng)記錄任何對驗證計劃的偏離。應(yīng)記錄任何對驗證計劃的偏離。方法驗證報告方法驗證報告樣品分析報告樣品分析報告實驗室內(nèi)部研究一般順序：實驗室內(nèi)部研究一般順序：1. 方法的建立和優(yōu)化方法的建立和優(yōu)化2. 預(yù)實驗的樣品測試預(yù)實驗的樣品測試3. 制定方法學(xué)研究的方案并實施制定方法學(xué)研究的方案并實施儲備液，工作溶液，系列工作溶液及生物樣品溶液的配制儲備液，工作溶液，系列工作溶液及生物樣

30、品溶液的配制選擇性考察、基質(zhì)效應(yīng)考察選擇性考察、基質(zhì)效應(yīng)考察3個分析批次的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度與準(zhǔn)確度考察個分析批次的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度與準(zhǔn)確度考察穩(wěn)定性考察穩(wěn)定性考察其他可能的考察其他可能的考察4. 藥代動力學(xué)實驗、取樣及樣品保存藥代動力學(xué)實驗、取樣及樣品保存5. 樣品測試樣品測試+隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線及隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線及QC樣品樣品6. 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析+復(fù)測復(fù)測7. 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理+出具報告出具報告文獻查閱了解相關(guān)內(nèi)容文獻查閱了解相關(guān)內(nèi)容1 1. .了解分析對象的理化性質(zhì)，酸堿性、溶解性、穩(wěn)定性、了解分析對象的理化性質(zhì)，酸堿性、溶解性、穩(wěn)定性、光學(xué)性質(zhì)等。光學(xué)性質(zhì)等。2.2.了解藥物的代謝途徑、產(chǎn)物和動

31、力學(xué)性質(zhì)，如吸收、了解藥物的代謝途徑、產(chǎn)物和動力學(xué)性質(zhì)，如吸收、分布、代謝、排泄、結(jié)合等。分布、代謝、排泄、結(jié)合等。3.3.取樣對象：體液，如血、尿等；組織，如肝、腦、膽、取樣對象：體液，如血、尿等；組織，如肝、腦、膽、毛發(fā)等；細胞等等毛發(fā)等；細胞等等4.4.分析的目的：代謝途徑和產(chǎn)物，藥動學(xué)研究，臨床藥分析的目的：代謝途徑和產(chǎn)物，藥動學(xué)研究，臨床藥物監(jiān)測等。物監(jiān)測等。 HPLCHPLCHPLC-MS/MSHPLC-MS/MS分析物的特點分析物的特點內(nèi)標(biāo)的選擇內(nèi)標(biāo)的選擇標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣分析確定基本色譜條件標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣分析確定基本色譜條件根據(jù)可能的最低濃度確定體外樣品能夠測定到的最根據(jù)可能的最低濃度

32、確定體外樣品能夠測定到的最低濃度低濃度綜合考慮前處理的方法綜合考慮前處理的方法液液萃?。焊蓛簟⒖梢愿患郎y成分液液萃?。焊蓛?、可以富集待測成分蛋白蛋白沉淀：快速、適合濃度較高的生物樣品沉淀：快速、適合濃度較高的生物樣品固相固相萃?。杭兓Ч?、可以富集、適合多成分前萃?。杭兓Ч?、可以富集、適合多成分前處理（多成分的化合物結(jié)構(gòu)、性質(zhì)差異較大）處理（多成分的化合物結(jié)構(gòu)、性質(zhì)差異較大）用校正樣品評價選擇性和可能的用校正樣品評價選擇性和可能的LLOQLLOQ評價絕對回收率評價絕對回收率【新的指導(dǎo)原則未提及新的指導(dǎo)原則未提及】預(yù)實驗預(yù)實驗一般大鼠選擇一般大鼠選擇4646只，犬選擇只，犬選擇2 2只只

33、按照實際試驗的要求進行給藥取血按照實際試驗的要求進行給藥取血采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線測定血藥濃度采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線測定血藥濃度根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，制定分析方根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，制定分析方法學(xué)驗證的具體內(nèi)容法學(xué)驗證的具體內(nèi)容一般在預(yù)實驗之后一般在預(yù)實驗之后進行基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度進行基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度、精密度的精密度的考察考察（第一天（第一天/ /第二天第二天/ /第三天）第三天）分析批次分析批次11 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線1 1，LLOQLLOQ5 5，LQCLQC5 5，MQCMQC5 5，HQCHQC5 5分析批次分析批次22 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線2 2， LLOQ LLOQ5 5，LQCLQC5 5，MQCMQC5 5，HQCHQC5 5 分析批次分析批次33 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線3 3， LLOQ LLOQ5 5， LQCLQC5 5，MQCMQC5 5，HQCHQC5 53 3個分析批獲得個分析批獲得3 3條條