第三章_培養(yǎng)基成分與配制

1、l一、培養(yǎng)基成分一、培養(yǎng)基成分l二、培養(yǎng)基的種類二、培養(yǎng)基的種類l三、培養(yǎng)基的選擇三、培養(yǎng)基的選擇l四、培養(yǎng)基的制備四、培養(yǎng)基的制備l一、培養(yǎng)基成分一、培養(yǎng)基成分l 1. 1.無機營養(yǎng)無機營養(yǎng)l 無機元素在植物生活中非常重要：無機元素在植物生活中非常重要：l 鎂是葉綠素分子的一部分鎂是葉綠素分子的一部分; ;l 鈣是細胞壁的組分之一鈣是細胞壁的組分之一; ;l 氮是各種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)和核酸的重要組成部氮是各種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)和核酸的重要組成部分。分。l 鐵、鋅和銅是某些酶的組成部分。鐵、鋅和銅是某些酶的組成部分。l 除了除了C C、H H和和O O外，已知還有外，已知還有1212

2、種元素對于植物的生長是種元素對于植物的生長是必需的，它們是氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、銅、鉬、錳、必需的，它們是氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、銅、鉬、錳、鋅、硼。總共鋅、硼。總共1515種元素。種元素。l 其中前其中前6 6種元素需要的數(shù)量較大，因此稱之為大量元素種元素需要的數(shù)量較大，因此稱之為大量元素或主要元素?；蛑饕亍 后后6 6種元素需要的數(shù)量較小，因此稱為微量元素或次要種元素需要的數(shù)量較小，因此稱為微量元素或次要元素。元素。l 按照國際植物生理協(xié)會的建議：按照國際植物生理協(xié)會的建議：l 植物所需要的濃度大于植物所需要的濃度大于0.5mmol0.5mmolL L的元素為大量元素的元素

3、為大量元素; ;l 植物所需要的濃度小于植物所需要的濃度小于0.5mmol0.5mmolL L的元素為微量元素。的元素為微量元素。l l 實質(zhì)上，對于整株植物生長有重要作用的這實質(zhì)上，對于整株植物生長有重要作用的這1515種元素，對于組織培養(yǎng)來說也是必需的。各種種元素，對于組織培養(yǎng)來說也是必需的。各種常用培養(yǎng)基之間在組分上的主要差別，即在于各常用培養(yǎng)基之間在組分上的主要差別，即在于各種鹽或離子數(shù)量上的不同。由質(zhì)上來看，各種植種鹽或離子數(shù)量上的不同。由質(zhì)上來看，各種植物組織所需要的無機營養(yǎng)是相當(dāng)一致的。物組織所需要的無機營養(yǎng)是相當(dāng)一致的。l 當(dāng)無機鹽在水中溶解的時候，它們發(fā)生解離，當(dāng)無機鹽在水中

4、溶解的時候，它們發(fā)生解離，形成離子。培養(yǎng)基中的活性因子即是這些離子，形成離子。培養(yǎng)基中的活性因子即是這些離子，而不是它們的化合物。一種類型的離子可由一種而不是它們的化合物。一種類型的離子可由一種以上的鹽提供。以上的鹽提供。l l WhiteWhite培養(yǎng)基是最早的植物組織培養(yǎng)基之一，其中包培養(yǎng)基是最早的植物組織培養(yǎng)基之一，其中包含了所有必需的營養(yǎng)成分，被廣泛用于根的培養(yǎng)。不過，含了所有必需的營養(yǎng)成分，被廣泛用于根的培養(yǎng)。不過，很多研究者的經(jīng)驗表明，要想使愈傷組織能令人滿意地生很多研究者的經(jīng)驗表明，要想使愈傷組織能令人滿意地生長，這個培養(yǎng)基中的無機成分在數(shù)量上是不足的。早期采長，這個培養(yǎng)基中的無

5、機成分在數(shù)量上是不足的。早期采用的克服這種缺陷的辦法是在培養(yǎng)基中加入某些復(fù)雜的混用的克服這種缺陷的辦法是在培養(yǎng)基中加入某些復(fù)雜的混合物，如酵母浸出物、水解酪蛋白、椰子汁和氨基酸等。合物，如酵母浸出物、水解酪蛋白、椰子汁和氨基酸等。為了改進合成培養(yǎng)基，后來的研究者通過增加各種無機鹽為了改進合成培養(yǎng)基，后來的研究者通過增加各種無機鹽的濃度，特別是鉀和氮的濃度，成功地取代了那些復(fù)雜的的濃度，特別是鉀和氮的濃度，成功地取代了那些復(fù)雜的混合物。和混合物。和WhiteWhite培養(yǎng)基比較，在現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的各種培培養(yǎng)基比較，在現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的各種培養(yǎng)基中，多數(shù)都含有濃度較高的無機鹽。養(yǎng)基中，多數(shù)都含有濃度較高

6、的無機鹽。HellerHeller（19531953）在其培養(yǎng)基中加入了鋁和鎳，但這兩種元素的必要性并未在其培養(yǎng)基中加入了鋁和鎳，但這兩種元素的必要性并未得到證明，因此已被后來的研究者所省略。鈉、氯化物和得到證明，因此已被后來的研究者所省略。鈉、氯化物和碘化物的必要性迄今也還沒有得到證明。碘化物的必要性迄今也還沒有得到證明。 l 在在WhiteWhite（19431943）原來的培養(yǎng)基中，鐵是以）原來的培養(yǎng)基中，鐵是以FeFe(SO(SO) )的的形式加入的，但形式加入的，但StreetStreet及其合作者在根培養(yǎng)中以及其合作者在根培養(yǎng)中以FeCIFeCI代替了代替了FeFe(SO(SO)

7、) ，這是因為在，這是因為在FeFe(SO(SO) )中含有中含有MnMn和某些其他金和某些其他金屬離子雜質(zhì)。然而，屬離子雜質(zhì)。然而， FeCIFeCI看來也并不是一個完全令人滿意看來也并不是一個完全令人滿意的鐵鹽。以這種形式存在的鐵只有在的鐵鹽。以這種形式存在的鐵只有在PH5. 2PH5. 2左右時才能被組左右時才能被組織所利用。已知在根培養(yǎng)中，接種后一周之內(nèi)培養(yǎng)基的織所利用。已知在根培養(yǎng)中，接種后一周之內(nèi)培養(yǎng)基的PHPH值值即會由原來的即會由原來的4.94.95.05.0上升到上升到58586.06.0，于是根開始表現(xiàn)缺，于是根開始表現(xiàn)缺鐵癥狀。為了解決這個問題，現(xiàn)在在多數(shù)培養(yǎng)基中鐵是以一

8、鐵癥狀。為了解決這個問題，現(xiàn)在在多數(shù)培養(yǎng)基中鐵是以一種螫合形式，即種螫合形式，即 Fe EDTAFe EDTA（EDTAEDTA乙二胺四乙酸）的形式提乙二胺四乙酸）的形式提供的。以這種形式提供的鐵直到供的。以這種形式提供的鐵直到PH7.6PH7.68.08.0仍然可以被植物仍然可以被植物組織所利用。附帶說一下，與根不同，愈傷組織培養(yǎng)物直到組織所利用。附帶說一下，與根不同，愈傷組織培養(yǎng)物直到PHPH為為6. 06. 0時仍可利用時仍可利用FeCIFeCI ，這是因為愈傷組織能分泌自然，這是因為愈傷組織能分泌自然的鰲合劑，而螫合劑可與鐵相結(jié)合。的鰲合劑，而螫合劑可與鐵相結(jié)合。Fe EDTAFe E

9、DTA可使用可使用FeSOFeSO7H7H2 2O O對和對和NaNa2 2EDTAEDTA進行制備，或者，如果可能的話，從進行制備，或者，如果可能的話，從市場上直接購買市場上直接購買NaFeEDTANaFeEDTA。l l 在培養(yǎng)基中無機氮的供應(yīng)可以有兩種形式，在培養(yǎng)基中無機氮的供應(yīng)可以有兩種形式，一種是硝酸鹽；另一種是銨鹽。當(dāng)做為唯一的一種是硝酸鹽；另一種是銨鹽。當(dāng)做為唯一的氮源時，硝酸鹽的作用要比銨鹽好得多，但在氮源時，硝酸鹽的作用要比銨鹽好得多，但在單獨使用硝酸鹽時，培養(yǎng)基的單獨使用硝酸鹽時，培養(yǎng)基的PHPH會向堿性方向會向堿性方向漂移。若與硝酸鹽一起加入少量銨鹽，則會阻漂移。若與硝酸

10、鹽一起加入少量銨鹽，則會阻止這種漂移。因此，有好幾種培養(yǎng)基都既含有止這種漂移。因此，有好幾種培養(yǎng)基都既含有硝酸鹽，也含有銨鹽。硝酸鹽，也含有銨鹽。l l 當(dāng)某些營養(yǎng)元素的供應(yīng)不足時，愈傷組織所表當(dāng)某些營養(yǎng)元素的供應(yīng)不足時，愈傷組織所表現(xiàn)出來的癥狀如下：現(xiàn)出來的癥狀如下：l 氮氮某些組織（五葉地錦）表現(xiàn)出一種很引某些組織（五葉地錦）表現(xiàn)出一種很引人注目的花色素苷的顏色；不能形成導(dǎo)管；人注目的花色素苷的顏色；不能形成導(dǎo)管；l 氮、鉀或磷氮、鉀或磷細胞過度生長，形成層組織減細胞過度生長，形成層組織減退；退；l 硫硫非常明顯地褪綠；非常明顯地褪綠；l 鐵鐵細胞分裂停止；細胞分裂停止；l 硼硼細胞分裂停

11、滯，細胞伸長；細胞分裂停滯，細胞伸長；l 錳或鉬錳或鉬影響細胞伸長。影響細胞伸長。l2. 2. 有機營養(yǎng)成分有機營養(yǎng)成分l(1)(1)含氮物質(zhì)含氮物質(zhì)l 大多數(shù)培養(yǎng)的細胞都能合成所有必需的維生素，大多數(shù)培養(yǎng)的細胞都能合成所有必需的維生素，只是數(shù)量上顯然不足。為了能使組織很好地生長，在只是數(shù)量上顯然不足。為了能使組織很好地生長，在培養(yǎng)基中常常必須補加一種或一種以上的維生素和氨培養(yǎng)基中常常必須補加一種或一種以上的維生素和氨基酸。其中硫胺素（維生素基酸。其中硫胺素（維生素B B）一般認為是一種必）一般認為是一種必需的成分。在其他各種維生素中，已知尤其是吡哆醇需的成分。在其他各種維生素中，已知尤其是吡

12、哆醇（維生素（維生素B6B6），煙酸（維生素），煙酸（維生素B B），泛酸鈣（維生），泛酸鈣（維生素素B B）和肌醇也都能改善培養(yǎng)的植物組織的生長狀）和肌醇也都能改善培養(yǎng)的植物組織的生長狀況。各種維生素皆溶于水，唯葉酸例外，先要用少量況。各種維生素皆溶于水，唯葉酸例外，先要用少量稀氨水溶解，然后加蒸餾水定容稀氨水溶解，然后加蒸餾水定容。l l 為了促進某些愈傷組織和器官的生長，還為了促進某些愈傷組織和器官的生長，還常使用很多種化學(xué)成分不明的復(fù)雜的營養(yǎng)混合常使用很多種化學(xué)成分不明的復(fù)雜的營養(yǎng)混合物，如物，如水解酪蛋白（水解酪蛋白（CHCH），椰子汁（），椰子汁（CMCM），玉），玉米胚乳，麥芽浸

13、出物（米胚乳，麥芽浸出物（MEME），番茄汁（），番茄汁（TJTJ）和）和酵母浸出物（酵母浸出物（YEYE）等。不過，只要可能，應(yīng)盡等。不過，只要可能，應(yīng)盡量避免使用這些天然物質(zhì)。這些物質(zhì)（特別是量避免使用這些天然物質(zhì)。這些物質(zhì)（特別是果實提取物）在樣品間的差異將會影響實驗結(jié)果實提取物）在樣品間的差異將會影響實驗結(jié)果的可重復(fù)性。這是因為，這類提取物所含的果的可重復(fù)性。這是因為，這類提取物所含的生長促進成分的質(zhì)和量常因組織的年齡和供體生長促進成分的質(zhì)和量常因組織的年齡和供體植株的品種而變化。此外，只用一種氨基酸也植株的品種而變化。此外，只用一種氨基酸也可能有效地取代這些天然物質(zhì)。可能有效地取代這

14、些天然物質(zhì)。l(2)(2)碳源碳源l Haberlandt（1902）曾試圖培養(yǎng)綠色的葉肉細胞，這可能是出自綠色細胞對營養(yǎng)的要求比較簡單的想法，但這種想法在實驗中并未得到證實?，F(xiàn)在我們知道，作為一個規(guī)律，起初是綠色的組織在培養(yǎng)中會逐漸失去它們的葉綠素，而只依賴于外界碳源生活。即使是那些在培養(yǎng)期間由于某些突然變化或被置于特殊條件之下而獲得了色素的組織，也不是碳素自養(yǎng)的。如果在培養(yǎng)基中加入一種合適的碳源，就是在培養(yǎng)中已經(jīng)充分分化了的綠色幼莖也會生長得更好。由此看來，在培養(yǎng)基中加入一種可被利用的碳源是十分必要的。l l 最常用的碳源是蔗糖，濃度一般為最常用的碳源是蔗糖，濃度一般為2 25 5。已知葡

15、。已知葡萄糖和果糖也能使某些組織生長得很好，萄糖和果糖也能使某些組織生長得很好，BallBall（19531953，19551955）證實，對于紅杉屬植物（）證實，對于紅杉屬植物（SequoiaSequoia）愈傷組織的生長）愈傷組織的生長來說，經(jīng)過高壓滅菌的蔗糖優(yōu)于過濾滅菌的蔗糖，看來高來說，經(jīng)過高壓滅菌的蔗糖優(yōu)于過濾滅菌的蔗糖，看來高壓滅菌能使蔗糖水解成為更能被有效利用的糖，如果糖。壓滅菌能使蔗糖水解成為更能被有效利用的糖，如果糖。 l 一般來說，以蔗糖做碳源時，離體的雙子葉植物的根一般來說，以蔗糖做碳源時，離體的雙子葉植物的根生長得最好。而以右旋糖（葡萄糖）做碳源時，單子葉植生長得最好。

16、而以右旋糖（葡萄糖）做碳源時，單子葉植物的根生長得最好。矮生蘋果（物的根生長得最好。矮生蘋果（Mains pumilaMains pumila，品種，品種MclntoshMclntosh）的組織培養(yǎng)物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡）的組織培養(yǎng)物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡萄糖做碳源時都長得很好。萄糖做碳源時都長得很好。l 已知植物能夠利用的某些其他形式的碳源有麥芽糖、已知植物能夠利用的某些其他形式的碳源有麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖。紅杉屬植物和玉米胚乳的組織培半乳糖、甘露糖和乳糖。紅杉屬植物和玉米胚乳的組織培養(yǎng)物甚至可以代謝作為唯一碳源的淀粉。養(yǎng)物甚至可以代謝作為唯一碳源的淀粉。 l3. 3.

17、 植物生長物質(zhì)植物生長物質(zhì)l 除了營養(yǎng)物質(zhì)以外，為了促進組織和器除了營養(yǎng)物質(zhì)以外，為了促進組織和器官的生長，通常還有必要在培養(yǎng)基中加入一官的生長，通常還有必要在培養(yǎng)基中加入一種或一種以上的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。如生長素、種或一種以上的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。如生長素、細胞分裂素或赤霉素。細胞分裂素或赤霉素。l(1) (1) 生長素生長素l 在自然界中，生長素影響到莖和節(jié)間的伸長、在自然界中，生長素影響到莖和節(jié)間的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等現(xiàn)象。在組向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等現(xiàn)象。在組織培養(yǎng)中，生長素被用于誘導(dǎo)細胞的分裂和根的織培養(yǎng)中，生長素被用于誘導(dǎo)細胞的分裂和根的分化。在組織培養(yǎng)中常用的生長

18、素有：分化。在組織培養(yǎng)中常用的生長素有：IAAIAA、IBAIBA、NAA.NAA.、NOANOA（萘氧乙酸）、（萘氧乙酸）、P PCPACPA（對氯苯氧乙（對氯苯氧乙酸）、酸）、2,4-D2,4-D（二氯苯氧乙酸）和（二氯苯氧乙酸）和2,4,52,4,5T T（三（三氯苯氧乙酸）。其中氯苯氧乙酸）。其中IBAIBA和和NAANAA廣泛用于生根，并廣泛用于生根，并能與細胞分裂素互作促進莖的增殖。能與細胞分裂素互作促進莖的增殖。2,4-D2,4-D和和2,42,4，5 5T T對于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長非常有效。生長對于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長非常有效。生長素一般溶于素一般溶于9595酒精或酒精或0.

19、 lmol0. lmolL L的的aOHaOH中，中，以后者的溶解效果更好。以后者的溶解效果更好。l生長素活性:2,4-DNAAIAA 2,4-D 的活性經(jīng)IAA高8-12倍, 2,4-D在植物體內(nèi)比較穩(wěn)定,而IAA極不穩(wěn)定。l(2) (2) 細胞分裂素細胞分裂素l 細胞分裂素影響細胞分裂、頂端優(yōu)勢的變細胞分裂素影響細胞分裂、頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化等。在培養(yǎng)基中加入細胞分裂素化和莖的分化等。在培養(yǎng)基中加入細胞分裂素的目的，主要是為促進細胞分裂和由愈傷組織的目的，主要是為促進細胞分裂和由愈傷組織或器官上分化不定芽。由于這類化合物有助于或器官上分化不定芽。由于這類化合物有助于使腋芽由頂端優(yōu)勢的抑

20、制下解放出來，因此也使腋芽由頂端優(yōu)勢的抑制下解放出來，因此也可用于莖的增殖。比較常用的細胞分裂素有：可用于莖的增殖。比較常用的細胞分裂素有：BAPBAP（芐氨基瞟呤），（芐氨基瞟呤），6 6BABA（芐基腺瞟呤），（芐基腺瞟呤），2 2iPiP（異戊烯氨基膘呤）和（異戊烯氨基膘呤）和(KT)(KT)激動素（呋喃激動素（呋喃氨基嘌呤）。細胞分裂素一般溶于氨基嘌呤）。細胞分裂素一般溶于0.50.5或或lmollmolL L的的HCIHCI或稀的或稀的NaOHNaOH中。中。l細胞分裂素的活性：ZTBAKT腺嘌呤.ZT的活性比KT高10倍,KT的活性比腺嘌呤3萬倍.l l4. 4. 瓊脂瓊脂l 如果

21、使用液體培養(yǎng)基進行靜止培養(yǎng)，組織將會沉沒并如果使用液體培養(yǎng)基進行靜止培養(yǎng)，組織將會沉沒并因缺氧而死亡。為了避免這種情況，可用瓊脂使培養(yǎng)基凝因缺氧而死亡。為了避免這種情況，可用瓊脂使培養(yǎng)基凝膠化，然后把組織置于培養(yǎng)基表面。瓊脂是一種由海藻得膠化，然后把組織置于培養(yǎng)基表面。瓊脂是一種由海藻得來的多糖類物質(zhì)，一般的使用濃度是來的多糖類物質(zhì)，一般的使用濃度是0.70.71 1，若濃度，若濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)就難于擴散到培養(yǎng)太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)就難于擴散到培養(yǎng)的組織中去。由于在這種半固體培養(yǎng)基上所建立的培養(yǎng)物的組織中去。由于在這種半固體培養(yǎng)基上所建立的培養(yǎng)物便于保存，而且

22、對于多種目的的實驗來說都能得到令人滿便于保存，而且對于多種目的的實驗來說都能得到令人滿意的結(jié)果，因此瓊脂固化培養(yǎng)基得到了廣泛的應(yīng)用。但瓊意的結(jié)果，因此瓊脂固化培養(yǎng)基得到了廣泛的應(yīng)用。但瓊脂并非是培養(yǎng)基中的一種必需成分。脂并非是培養(yǎng)基中的一種必需成分。 l 單細胞和細胞聚合體可以在含有無機和有機營養(yǎng)以及單細胞和細胞聚合體可以在含有無機和有機營養(yǎng)以及激素的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)。不過，在懸浮培養(yǎng)中激素的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)。不過，在懸浮培養(yǎng)中必須定時通氣，其方法或是由培養(yǎng)基底部鼓入無菌空氣，必須定時通氣，其方法或是由培養(yǎng)基底部鼓入無菌空氣，或是不斷輕輕搖動。在原生質(zhì)體培養(yǎng)中，如果采用淺層液或

23、是不斷輕輕搖動。在原生質(zhì)體培養(yǎng)中，如果采用淺層液體培養(yǎng)基或小滴液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，則可保持靜止，不體培養(yǎng)基或小滴液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，則可保持靜止，不必通氣。必通氣。 5.5.P H P H 值值 在滅菌之前PH值一般都是調(diào)節(jié)到5.0-6.0之間，一般來說，當(dāng)PH值高于6時，培養(yǎng)基會變硬，低于5時，瓊脂不能很好地凝固。 6. 6. 其他成分其他成分 （1）活性炭： 在培養(yǎng)基中加入活性炭（AC）主主要是為了吸附植物的有害分泌物，但活性炭對物質(zhì)吸附的選擇性很低，它同時也吸附某些植物必需的化合物?；钚蕴康挠昧恳话銥?.5%-3% 。注意：在高壓滅菌之前加入活性會降低培養(yǎng)基的PH值，合使培養(yǎng)基不易凝固。

24、 （2）硝酸銀： 離體培養(yǎng)的植物組織會產(chǎn)生和散發(fā)乙烯，而乙烯在培養(yǎng)容器中和積累會影響培養(yǎng)物的生長和分化，AgNO3中的Ag+通過競爭性地結(jié)合于細胞膜上的乙烯受體蛋白，從而可起到抑制乙烯活性的作用。培養(yǎng)基中加AgNO3能促進愈傷組織器官發(fā)生或體細胞胚胎發(fā)生，并能使某些原來再生困難的物種分化出再生植株。 AgNO3對于克服試管苗玻璃化及早衰和落葉等也有明顯效果。 由于低濃度AgNO3能引起細胞壞死，而這種壞死、細胞會產(chǎn)生一定數(shù)量的乙烯，所以AgNO3不一定總能阻止乙烯的積累。AgNO3的使用濃度一般為110mg/l。使用過濾滅菌。 （3）抗生素： 培養(yǎng)基中添加抗生素的主要目的，是防止由外植體內(nèi)生菌

25、造成的污染。 注意：不同抗生素抑制不同菌種，因此要有針對性選擇抗生素；有時必須幾種抗生素結(jié)合使用才能取得較好的效果；抗生素的使用對植物的生長有一定的抑制作用；在停用抗生素后，污染率往往顯著上升。 常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、土霉素等，用量一般為520mg/L。大部分要求過濾滅菌。l二、培養(yǎng)基的種類二、培養(yǎng)基的種類l 長期以來長期以來, ,根據(jù)組織培養(yǎng)的不同目的和選根據(jù)組織培養(yǎng)的不同目的和選用的不同材料用的不同材料, ,科學(xué)工作者們設(shè)計了許多不同科學(xué)工作者們設(shè)計了許多不同種類的培養(yǎng)培養(yǎng)基基，最常見的培養(yǎng)基為種類的培養(yǎng)培養(yǎng)基基，最常見的培養(yǎng)基為MSMS培培養(yǎng)基（見表養(yǎng)基（見表3-13-1）。）。

26、lMS培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：Murashige和和Skoog于于1962年為煙草細胞年為煙草細胞培養(yǎng)設(shè)計的，其特點是無機鹽和離子濃度較高，是較培養(yǎng)設(shè)計的，其特點是無機鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要數(shù)量和比例合適，能滿足植物細胞的營養(yǎng)和生理需要,因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。 l 表表3-1 MS3-1 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 l 大量元素大量元素 (mg/L) 微量

27、元素微量元素 (mg/L)l（NH4NO3）.1650 KI . .0.83l（KNO3）.1900 H3BO3 . 6.2l（CaCI22H2O）.440 MnSO4 4H2O 22.3l（MgSO47H2O）.370 ZnSO4 7H2O 8.6l（KH2PO4）.170 Na2MoO4 2H2O .0.25l維生素維生素 CuSO4 5H2O . 0.025l肌醇肌醇.100 CoCl2 6H2O .0.025l煙酸煙酸.0.5 FeSO4 7H2O .27.8l鹽酸硫銨素鹽酸硫銨素.0.1 Na EDTA.37.3l鹽酸吡哆素鹽酸吡哆素 0.5 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)l有機附加物有機

28、附加物 KIN. 0.0410l甘氨酸甘氨酸.2.0 2，4-D. 1-30l蔗糖蔗糖.30g/L pH 5.7l 植物組織培養(yǎng)能否取得成功,營養(yǎng)培養(yǎng)基的種類是一個很關(guān)鍵的問題。比較常用的培養(yǎng)基及其成分見表3-2。l表表3-2 3-2 常用的培養(yǎng)基及其成分常用的培養(yǎng)基及其成分l三、培養(yǎng)基的選擇三、培養(yǎng)基的選擇l1. 1. 培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基選擇的原則l(1) (1) 目的性強：目的性強：要針對不同的培養(yǎng)目的如初要針對不同的培養(yǎng)目的如初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，分別選擇最適合代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)，分別選擇最適合的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基; ;l(2) (2) 成本低廉：成本低廉：要考慮到工廠化

29、生產(chǎn)時的運要考慮到工廠化生產(chǎn)時的運營成本，以總體運營效益來評價一種培養(yǎng)基的優(yōu)營成本，以總體運營效益來評價一種培養(yǎng)基的優(yōu)劣。劣。l (3) (3) 方便可行：方便可行：試劑容易選購，培養(yǎng)基的試劑容易選購，培養(yǎng)基的制備操作簡單易行。制備操作簡單易行。l2.2.培養(yǎng)基篩選的方法培養(yǎng)基篩選的方法l (1) (1) 選擇基本培養(yǎng)基選擇基本培養(yǎng)基: :l 在建立一個新的實驗體系時，為了能研制在建立一個新的實驗體系時，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，一般最好先由一種已被出一種適合的培養(yǎng)基，一般最好先由一種已被廣泛采用的基本培養(yǎng)基（如廣泛采用的基本培養(yǎng)基（如MSMS或或B B）開始。）開始。l(2) (2) 選

30、擇最佳激素組合選擇最佳激素組合: : l 在植物組織培養(yǎng)基中最常改動的因子是生長在植物組織培養(yǎng)基中最常改動的因子是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，尤其是生長素和細胞分裂素。調(diào)節(jié)物質(zhì)，尤其是生長素和細胞分裂素。l 開始時，可以選擇一種基本培養(yǎng)基，以及不開始時，可以選擇一種基本培養(yǎng)基，以及不同激素組合，比如說，各有同激素組合，比如說，各有5 5種不同濃度（種不同濃度（0 0，0.50.5，2.52.5，5 5，10mol10molL L）的某種生長素（例如）的某種生長素（例如NAANAA）和某種細胞分裂素（例如和某種細胞分裂素（例如BAPBAP）。這兩種激素）。這兩種激素5 5種種濃度的所有可能組合，即構(gòu)成了一個具

31、有濃度的所有可能組合，即構(gòu)成了一個具有2525項處項處理的實驗（表理的實驗（表3 34 4）。由這）。由這2525項處理中選出最好項處理中選出最好的一個，然后在保持濃度不變的情況下，再試驗的一個，然后在保持濃度不變的情況下，再試驗其他種類的生長素和細胞分裂素。其他種類的生長素和細胞分裂素。l 注意注意: :當(dāng)改變細胞分裂素的種類時，保持生長當(dāng)改變細胞分裂素的種類時，保持生長素不變，反之亦然。素不變，反之亦然。l(3) (3) 選擇適宜的鹽分濃度選擇適宜的鹽分濃度: : l 高濃度鹽分培養(yǎng)基對若干實驗體系來說都已證明效果很好，但有某些培養(yǎng)物在低濃度鹽分培養(yǎng)基上生長得更好，因此就還有必要試驗一下在

32、保持生長調(diào)節(jié)物質(zhì)最佳組合不變的情況下，1 12 2和和1 14 4水平的基本培養(yǎng)基鹽分的效果。l(4) (4) 確定適宜的蔗糖濃度確定適宜的蔗糖濃度: : l 在保持其他成分不變的情況下，設(shè)在保持其他成分不變的情況下，設(shè)計一個蔗糖濃度梯度（計一個蔗糖濃度梯度（2 26 6以至更以至更高），一篩選出最適宜的蔗糖濃度。高），一篩選出最適宜的蔗糖濃度。l 通過以上這些實驗，常常就足以研通過以上這些實驗，常常就足以研制出一種適合的培養(yǎng)基。不過，為了對制出一種適合的培養(yǎng)基。不過，為了對這種培養(yǎng)基做進一步的改良還有很多其這種培養(yǎng)基做進一步的改良還有很多其他可能性值得探討。他可能性值得探討。l(5) (5)

33、 廣譜實驗法廣譜實驗法: : l 為了能給一個新的實驗體系選出一種適合的培養(yǎng)基，為了能給一個新的實驗體系選出一種適合的培養(yǎng)基，De De Fos-sardFos-sard等（等（19741974）介紹了一種）介紹了一種“廣譜實驗法廣譜實驗法”。和上面介。和上面介紹的方法相比，這個方法是比較復(fù)雜的。然而，如果利用簡紹的方法相比，這個方法是比較復(fù)雜的。然而，如果利用簡單的方法解決不了問題，就有必要用這個方法試驗一下。單的方法解決不了問題，就有必要用這個方法試驗一下。l 1) 1) 在這個廣譜實驗法中，把培養(yǎng)基中的所有組分分為在這個廣譜實驗法中，把培養(yǎng)基中的所有組分分為4 4大類：無機鹽、生長素、細

34、胞分裂素、有機營養(yǎng)物質(zhì)（蔗糖、大類：無機鹽、生長素、細胞分裂素、有機營養(yǎng)物質(zhì)（蔗糖、氨基酸和肌醇等）。氨基酸和肌醇等）。l 2) 2) 對每一類物質(zhì)再選定對每一類物質(zhì)再選定3 3個濃度，即低（個濃度，即低（L L），中（），中（M M）和高（和高（H H）（見表）（見表3-43-4）。）。4 4類物質(zhì)各類物質(zhì)各3 3種濃度的各種不同組合種濃度的各種不同組合即構(gòu)成了一項包括即構(gòu)成了一項包括8181個處理的實驗。個處理的實驗。l 3) 3) 在這在這8181個處理中最好的一個可用個字母表示。例個處理中最好的一個可用個字母表示。例如，一個包含中等濃度無機鹽、低濃度生長素、中等濃度細如，一個包含中等濃

35、度無機鹽、低濃度生長素、中等濃度細胞分裂素和高濃度有機營養(yǎng)物質(zhì)的處理即可表示為胞分裂素和高濃度有機營養(yǎng)物質(zhì)的處理即可表示為MLMHMLMH。順。順序是無機鹽序是無機鹽- -生長素生長素- -細胞分裂素細胞分裂素- -有機營養(yǎng)。有機營養(yǎng)。l 4) 4) 達到這個階段以后，即可再試驗不同類型的生長素達到這個階段以后，即可再試驗不同類型的生長素和細胞分裂素，以找到它們的最好類型。和細胞分裂素，以找到它們的最好類型。表表3-5 3-5 廣譜實驗法中，各類物質(zhì)的成分和濃度廣譜實驗法中，各類物質(zhì)的成分和濃度l四、培養(yǎng)基的制備四、培養(yǎng)基的制備l 1. 1. 干粉直接配制干粉直接配制: :l 現(xiàn)在配制培養(yǎng)基的

36、最簡單的方法是用市售培養(yǎng)現(xiàn)在配制培養(yǎng)基的最簡單的方法是用市售培養(yǎng)基干粉，其中含有無機鹽、維生素和氨基酸。把這基干粉，其中含有無機鹽、維生素和氨基酸。把這種干粉溶解在蒸餾水里（要比培養(yǎng)基的最終容積少種干粉溶解在蒸餾水里（要比培養(yǎng)基的最終容積少1010），加上蔗糖、瓊脂和其他必要的補加物，最），加上蔗糖、瓊脂和其他必要的補加物，最后再加入蒸餾水使之達到最終的容積。調(diào)節(jié)后再加入蒸餾水使之達到最終的容積。調(diào)節(jié)PHPH，高，高壓滅菌，于是制成所需要的培養(yǎng)基。在有些國家有壓滅菌，于是制成所需要的培養(yǎng)基。在有些國家有廠家制作和銷售這種干粉培養(yǎng)基，我國市場上目前廠家制作和銷售這種干粉培養(yǎng)基，我國市場上目前尚無

37、供應(yīng)。干粉培養(yǎng)基可用于常規(guī)的實驗?zāi)康?，如尚無供應(yīng)。干粉培養(yǎng)基可用于常規(guī)的實驗?zāi)康?，如植物的快速繁殖等，在這類實驗中所需的培養(yǎng)基成植物的快速繁殖等，在這類實驗中所需的培養(yǎng)基成分是早已完全確定了的。在這種情況下，使用干粉分是早已完全確定了的。在這種情況下，使用干粉培養(yǎng)基就可以節(jié)省時間和金錢培養(yǎng)基就可以節(jié)省時間和金錢。l2. 2. 儲備母液配制儲備母液配制: : (1) (1) 濃縮貯備液的濃縮倍數(shù)：濃縮貯備液的濃縮倍數(shù)： 1) 1) 大量元素（濃縮大量元素（濃縮2020倍）；倍）；l2) 2) 微量元素（濃縮微量元素（濃縮200200倍）；倍）；l3) 3) 鐵鹽（濃縮鐵鹽（濃縮200200倍）；

38、倍）； 4) 4) 除蔗糖之外的有機物質(zhì)（濃縮除蔗糖之外的有機物質(zhì)（濃縮200200倍）。倍）。l5) 5) 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)( (濃度濃度: mg/ml, : mg/ml, 分別配制分別配制) )（2 2）濃縮貯備液配制方法：）濃縮貯備液配制方法：l 以培養(yǎng)及為例，其貯備液的配置如表以培養(yǎng)及為例，其貯備液的配置如表3-63-6所示。所示。l表表3-6 MS3-6 MS貯備液的配制貯備液的配制l（3 3）濃縮貯備液配制時注意問題：）濃縮貯備液配制時注意問題：l 1) 1) 在制備這在制備這4 4種貯備液的時候，應(yīng)使每種成分分別溶種貯備液的時候，應(yīng)使每種成分分別溶解，一粒不剩，然后再把它

39、們彼此混合解，一粒不剩，然后再把它們彼此混合; ;l 2) 2) 各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的貯備液應(yīng)當(dāng)分別配制，如果它各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的貯備液應(yīng)當(dāng)分別配制，如果它們是不溶于水的，則應(yīng)先把它們?nèi)芙庠诤苌倭康倪m當(dāng)溶劑們是不溶于水的，則應(yīng)先把它們?nèi)芙庠诤苌倭康倪m當(dāng)溶劑中（見第中（見第3 32.32.3節(jié)），然后再加蒸溜水到最終容積。節(jié)），然后再加蒸溜水到最終容積。l 3) 3) 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度取決于所要求的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度取決于所要求的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的水平，其貯備液的強度可以是水平，其貯備液的強度可以是mmolmmolL L，也可以是，也可以是10mmol10mmolL L。l 4) 4) 所

40、有貯備液都應(yīng)貯存于適當(dāng)?shù)乃芰掀炕虿Ａ恐校匈A備液都應(yīng)貯存于適當(dāng)?shù)乃芰掀炕虿Ａ恐?，置冰箱中保存。鐵鹽貯備液須貯存于琥珀色玻璃瓶中，在置冰箱中保存。鐵鹽貯備液須貯存于琥珀色玻璃瓶中，在貯備椰子汁（液體胚乳）的時候，要先把由果實中采集到貯備椰子汁（液體胚乳）的時候，要先把由果實中采集到的汁液加熱煮沸以除去其中的蛋白質(zhì)，過濾，然后置塑料的汁液加熱煮沸以除去其中的蛋白質(zhì)，過濾，然后置塑料瓶中貯存于一瓶中貯存于一2020的低溫冰箱內(nèi)。的低溫冰箱內(nèi)。l 5) 5) 作為一項規(guī)則，在使用這些貯備液之前必須輕輕搖作為一項規(guī)則，在使用這些貯備液之前必須輕輕搖動瓶子，如果發(fā)現(xiàn)其中有沉淀懸浮物或微生物污染，必須

41、動瓶子，如果發(fā)現(xiàn)其中有沉淀懸浮物或微生物污染，必須立即將其淘汰。立即將其淘汰。l 6) 6) 在制備貯備液和培養(yǎng)基的時候，應(yīng)當(dāng)使用蒸餾水或在制備貯備液和培養(yǎng)基的時候，應(yīng)當(dāng)使用蒸餾水或無離子水，以及高純度的化學(xué)試劑。無離子水，以及高純度的化學(xué)試劑。l（4 4）常用固體培養(yǎng)基的配制步驟）常用固體培養(yǎng)基的配制步驟( (以以1L1L為例為例) )：l 1 1）稱出規(guī)定數(shù)量的瓊脂）稱出規(guī)定數(shù)量的瓊脂(7-10g)(7-10g)和蔗糖和蔗糖20-40g)20-40g)，加水直到培養(yǎng)基最終容積的加水直到培養(yǎng)基最終容積的1/2-3/4(500-700ml)1/2-3/4(500-700ml)，在恒溫水浴中加熱

42、使之溶解在恒溫水浴中加熱使之溶解, ,也可直接加熱或放入也可直接加熱或放入微波爐加熱溶解。在配制液體培養(yǎng)基時則無須加熱，微波爐加熱溶解。在配制液體培養(yǎng)基時則無須加熱，因為蔗糖甚至在微溫的水中也能溶解。因為蔗糖甚至在微溫的水中也能溶解。l 2 2）分別加入一定量的各種貯備液）分別加入一定量的各種貯備液: : 大量元素大量元素50ml; 50ml; 微量元素微量元素5ml;5ml;鐵鹽鐵鹽5ml;5ml;有機營養(yǎng)有機營養(yǎng)5ml;5ml;生長調(diào)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他的特殊補加物適量。如果由于特殊原節(jié)物質(zhì)和其他的特殊補加物適量。如果由于特殊原因有必要在高壓滅菌之后再加入維生素和生長素，因有必要在高壓滅菌之

43、后再加入維生素和生長素，那么在調(diào)節(jié)了那么在調(diào)節(jié)了PHPH值之后，可使這些物質(zhì)的溶液通過值之后，可使這些物質(zhì)的溶液通過孔徑為孔徑為0 022220 .45m0 .45m的微孔濾器消毒。的微孔濾器消毒。l l 3 3）加蒸餾水直至培養(yǎng)基的最終容積。）加蒸餾水直至培養(yǎng)基的最終容積。l 4 4）充分混合之后，用）充分混合之后，用0.l mol0.l molL NaOH L NaOH 和和0.1mol0.1molL HCI L HCI 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PHPH到到5.8-6.0, PH5.8-6.0, PH過過低低, ,不易凝固不易凝固, ,過高培養(yǎng)基變硬。過高培養(yǎng)基變硬。l 5 5）把培養(yǎng)基分裝到所選用的培養(yǎng)容器中，每個）