分子生物學(xué)第09章DNA分子標(biāo)記技術(shù)

1、9.1 基于基于 Southern 雜交技術(shù)的分子標(biāo)記雜交技術(shù)的分子標(biāo)記9.2 隨機(jī)（或半隨機(jī)）引物分子標(biāo)記技術(shù)隨機(jī)（或半隨機(jī)）引物分子標(biāo)記技術(shù)9.3 序列標(biāo)志位點(diǎn)技術(shù)序列標(biāo)志位點(diǎn)技術(shù)9.4 分子標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域分子標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域9 DNA分子標(biāo)記技術(shù)DNA分子標(biāo)記的定義 DNA分子標(biāo)記就是在同一物種不同個體間分子標(biāo)記就是在同一物種不同個體間DNA序列上的差異，某一特定的差異可以通過實序列上的差異，某一特定的差異可以通過實驗的方法檢測出來，測出來的特定差異就是特定驗的方法檢測出來，測出來的特定差異就是特定的的DNA分子標(biāo)記。利用不同的實驗方法可以得到分子標(biāo)記。利用不同的實驗方法可以得到許許多多的

2、許許多多的DNA分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記，這些DNA分子標(biāo)記分子標(biāo)記表明了這些個體間遺傳物質(zhì)上的差異。表明了這些個體間遺傳物質(zhì)上的差異。 遺傳標(biāo)記的發(fā)展形態(tài)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（染色體多態(tài)性）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（染色體多態(tài)性） 蛋白質(zhì)標(biāo)記（同工酶，分子標(biāo)記）蛋白質(zhì)標(biāo)記（同工酶，分子標(biāo)記） DNA 標(biāo)記（分子標(biāo)記）標(biāo)記（分子標(biāo)記）RFLP 分析 RFLP（restriction fragment length poly-morphism）稱為限制性片段長度多態(tài)性。當(dāng)用）稱為限制性片段長度多態(tài)性。當(dāng)用某種限制性內(nèi)切酶處理不同生物個體來源的某種限制性內(nèi)切酶處理不同生物個體來源的DNA時，由于個體間時，由于

3、個體間DNA序列的差異，所產(chǎn)生的切割序列的差異，所產(chǎn)生的切割片段長度和數(shù)量可能不同，利用凝膠電泳可以將片段長度和數(shù)量可能不同，利用凝膠電泳可以將這些片段分離并觀察到差異，這種差異就是這些片段分離并觀察到差異，這種差異就是RFLP。RFLP 分析 RFLP產(chǎn)生的差異帶可以作為分子標(biāo)記，用于產(chǎn)生的差異帶可以作為分子標(biāo)記，用于遺傳學(xué)的研究。遺傳學(xué)的研究。 當(dāng)一個生物有多條染色體，且當(dāng)一個生物有多條染色體，且DNA分子很大分子很大時，用一種限制性內(nèi)切酶切割出的時，用一種限制性內(nèi)切酶切割出的DNA片段太多，片段太多，電泳后的條帶無法分辨。電泳后的條帶無法分辨。 使用某一特定序列的標(biāo)記探針，與電泳分離的使

4、用某一特定序列的標(biāo)記探針，與電泳分離的片段進(jìn)行片段進(jìn)行Southern雜交，再顯示出雜交帶，可以大雜交，再顯示出雜交帶，可以大大減少被觀察條帶的數(shù)目，便于不同生物個體間的大減少被觀察條帶的數(shù)目，便于不同生物個體間的比較和找出差異帶。比較和找出差異帶。RFLP 分析 換不同的限制性內(nèi)切酶切割，配合不同換不同的限制性內(nèi)切酶切割，配合不同的標(biāo)記探針，可以得到數(shù)目多得驚人的條帶，的標(biāo)記探針，可以得到數(shù)目多得驚人的條帶，從而找到很多的分子標(biāo)記。這些分子標(biāo)記與從而找到很多的分子標(biāo)記。這些分子標(biāo)記與表型標(biāo)記一樣，可以用于遺傳學(xué)的研究。但表型標(biāo)記一樣，可以用于遺傳學(xué)的研究。但分子標(biāo)記沒有顯隱性之分，都是共顯性

5、的。分子標(biāo)記沒有顯隱性之分，都是共顯性的。采用一種探針作 6 個栽培品種的RFLP分析RFLP所用探針的來源 RFLP分析的效率依賴于選擇合適的探針。分析的效率依賴于選擇合適的探針。由于用能探測重復(fù)序列的探針探測出的片段太由于用能探測重復(fù)序列的探針探測出的片段太多，難以比較，所以探針一般來自單拷貝或低多，難以比較，所以探針一般來自單拷貝或低重復(fù)序列。常用的重復(fù)序列。常用的RFLP探針主要來源于隨機(jī)基探針主要來源于隨機(jī)基因組克隆和因組克隆和cDNA克隆?？寺　FLP所用探針的來源 由于基因組由于基因組DNA中甲基化一般很少在表達(dá)中甲基化一般很少在表達(dá)基因中發(fā)生，故用對甲基化敏感的限制酶切，基因

6、中發(fā)生，故用對甲基化敏感的限制酶切，可得到長度為可得到長度為12kb的的DNA片段，它們是單拷片段，它們是單拷貝或低重復(fù)序列，用這些片段制成文庫，即可貝或低重復(fù)序列，用這些片段制成文庫，即可用作用作RFLP探針。探針。 如果用如果用cDNA克隆作探針，最好制備來自克隆作探針，最好制備來自生物整體生物整體mRNA的的cDNA文庫。文庫。RFLP標(biāo)記的共顯性什么是多態(tài)性 多態(tài)性是在不同個體之間比較得到多態(tài)性是在不同個體之間比較得到的差異帶，來自于一個個體本身的長短的差異帶，來自于一個個體本身的長短不等的片段不是多態(tài)性。不等的片段不是多態(tài)性。RFLP 標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)1. RFLP標(biāo)記無表型效應(yīng)，不受環(huán)境

7、條件和發(fā)育階標(biāo)記無表型效應(yīng)，不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。因此可在特征性狀遠(yuǎn)未出現(xiàn)之前就可段的影響。因此可在特征性狀遠(yuǎn)未出現(xiàn)之前就可以知道其基因型。以知道其基因型。2. RFLP標(biāo)記在等位之間是共顯性的，因此不受雜標(biāo)記在等位之間是共顯性的，因此不受雜交方式的影響。不管是正交、反交、回交，總是交方式的影響。不管是正交、反交、回交，總是在在F1代中含有兩親本各一組染色體的片段之和。代中含有兩親本各一組染色體的片段之和。3. 用不同探針可以探測出不同的用不同探針可以探測出不同的RFLP標(biāo)記，標(biāo)記標(biāo)記，標(biāo)記的密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過以性狀為基礎(chǔ)的圖譜。的密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過以性狀為基礎(chǔ)的圖譜。RFLP 的不足 雖然雖然R

8、FLP分子標(biāo)記有這些優(yōu)點(diǎn)，但實驗步驟分子標(biāo)記有這些優(yōu)點(diǎn)，但實驗步驟較多，費(fèi)工費(fèi)時，費(fèi)用也高，使其應(yīng)用受到一定較多，費(fèi)工費(fèi)時，費(fèi)用也高，使其應(yīng)用受到一定的限制。的限制。 要使要使RFLP在指導(dǎo)遺傳育種中在指導(dǎo)遺傳育種中發(fā)揮作用，還必發(fā)揮作用，還必須將須將RFLP與已知性狀聯(lián)系起來，僅有與已知性狀聯(lián)系起來，僅有RFLP標(biāo)記標(biāo)記圖使用價值不大。圖使用價值不大。可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（VNTRs） 在真核生物基因組中有小衛(wèi)星和微衛(wèi)星序列存在真核生物基因組中有小衛(wèi)星和微衛(wèi)星序列存在，它們是短序列（核心序列）高度重復(fù)的序列，在，它們是短序列（核心序列）高度重復(fù)的序列，在不同生物個體間，某一座位上的核心序列重復(fù)的

9、在不同生物個體間，某一座位上的核心序列重復(fù)的次數(shù)有很大差異，并且這些重復(fù)序列有多座位性，次數(shù)有很大差異，并且這些重復(fù)序列有多座位性，因此形成了高度的多態(tài)性。用某種高度重復(fù)序列的因此形成了高度的多態(tài)性。用某種高度重復(fù)序列的核心序列作探針，測定其核心序列作探針，測定其RFLP，得到電泳后的雜交，得到電泳后的雜交圖譜，這種圖譜稱為指紋圖譜，可以用來鑒別個體、圖譜，這種圖譜稱為指紋圖譜，可以用來鑒別個體、親子鑒定等。親子鑒定等。VNTR一例The cause of the variation between individual genomes at microsatellites or minisa

10、tellites is that individual alleles have different numbers of the repeating unit.For example, one minisatellite has a repeat length of 64 bp, and is found in the population with the following distribution: 7% 18 repeats 11% 16 repeats 43% 14 repeats 36% 13 repeats 4% 10 repeatsVNTR差異帶的檢測父母子女間VNTR的檢測

11、結(jié)果VNTR應(yīng)用舉例 用用33.15（探針名）進(jìn)行白種人的（探針名）進(jìn)行白種人的DNA指紋分指紋分析時，兩個無血緣關(guān)系的個體具有相同析時，兩個無血緣關(guān)系的個體具有相同DNA指紋指紋圖譜的概率為圖譜的概率為31011，而當(dāng)把，而當(dāng)把33.15和和33.6兩個兩個探針取得的結(jié)果綜合分析時，兩個個體指紋圖譜探針取得的結(jié)果綜合分析時，兩個個體指紋圖譜相同的概率更是降低到相同的概率更是降低到51019。 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD） RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）稱為隨機(jī)擴(kuò)增）稱為隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性。它是利用隨多態(tài)性。它是利用隨機(jī)引物（通常為機(jī)引物（

12、通常為10個核苷酸）對不同生物個體基個核苷酸）對不同生物個體基因組因組DNA進(jìn)行進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，溴化乙錠染色，顯示出擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。不同溴化乙錠染色，顯示出擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。不同個體間差異的條帶可以作為分子標(biāo)記。個體間差異的條帶可以作為分子標(biāo)記。兩個不同油菜品系的RAPDRAPD的特點(diǎn)雖然對具體的一個引物而言其檢測雖然對具體的一個引物而言其檢測DNA多態(tài)性的位多態(tài)性的位點(diǎn)是有限的，但是當(dāng)采用一組引物時，檢測區(qū)域幾乎點(diǎn)是有限的，但是當(dāng)采用一組引物時，檢測區(qū)域幾乎可以覆蓋整個基因組，從而得到整個基因組可以覆蓋整個基因組，從而得到整個基因組DNA的多的

13、多態(tài)性。態(tài)性。RAPD的特點(diǎn)是操作簡便迅速，不需要標(biāo)記探針。只的特點(diǎn)是操作簡便迅速，不需要標(biāo)記探針。只要有一套隨機(jī)引物就能對任何物種進(jìn)行要有一套隨機(jī)引物就能對任何物種進(jìn)行RAPD操作。操作。RAPD標(biāo)記也必須與表型相聯(lián)系才能發(fā)揮指導(dǎo)遺傳育標(biāo)記也必須與表型相聯(lián)系才能發(fā)揮指導(dǎo)遺傳育種的作用。種的作用。MAAP技術(shù)比較 DAF AP-PCR RAPD引物長度引物長度(nt) 515 2034 910引物濃度引物濃度(mmol/L) 330 3 0.3典型擴(kuò)增產(chǎn)物條帶典型擴(kuò)增產(chǎn)物條帶 10100 350 110分辨率分辨率 高高 中等中等 低低分離膠分離膠 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺

14、瓊脂糖瓊脂糖顯色顯色 銀染銀染 放射性標(biāo)記放射性標(biāo)記 溴化乙錠染色溴化乙錠染色嚴(yán)謹(jǐn)度嚴(yán)謹(jǐn)度 低或高低或高 低和高低和高 低低(Multiple arbitrary amplicon profiling)DAF：DNA amplification fingerprinting AP-PCR：arbitrarily primed polymerase chain reaction MAAP結(jié)果比較AFLP AFLP（amplified fragment length polymor-phism, 擴(kuò)增酶切片段多態(tài)性）又稱為擴(kuò)增酶切片段多態(tài)性）又稱為SAP（Specific amplified po

15、lymorphism, 專一擴(kuò)增多態(tài)專一擴(kuò)增多態(tài)性），它結(jié)合了性），它結(jié)合了RFLP和和PCR二者的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過酶二者的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過酶切和用特異引物擴(kuò)增，檢測切和用特異引物擴(kuò)增，檢測DNA的多態(tài)性。由于的多態(tài)性。由于退火溫度高，結(jié)果重復(fù)性好，具有退火溫度高，結(jié)果重復(fù)性好，具有RAPD無法比擬無法比擬的優(yōu)越性。它是一種高效的分子標(biāo)記，可用來構(gòu)的優(yōu)越性。它是一種高效的分子標(biāo)記，可用來構(gòu)建高密度的遺傳圖譜。建高密度的遺傳圖譜。 AFLP 指紋技術(shù) 先用兩種限制性內(nèi)切酶（先用兩種限制性內(nèi)切酶（A和和B）對基因組）對基因組DNA切割，得到兩個粘性末端為切割，得到兩個粘性末端為AA、AB、BB三三種片段。將種

16、片段。將A和和B兩種接頭加到這些片段的兩端，再兩種接頭加到這些片段的兩端，再用相應(yīng)的用相應(yīng)的A和和B引物對這些片段進(jìn)行引物對這些片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有擴(kuò)增，只有AB片段可以被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳檢測其多態(tài)片段可以被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳檢測其多態(tài)性。性。 通過換用不同的限制酶及不同的引物，可以控通過換用不同的限制酶及不同的引物，可以控制擴(kuò)增條帶的數(shù)目，檢測不同的分子標(biāo)記。制擴(kuò)增條帶的數(shù)目，檢測不同的分子標(biāo)記。圖圖95 AFLP 指紋技指紋技術(shù)術(shù)用于AFLP的人工接頭和引物舉例 EcoR適配器：適配器： CORE ENZ 5-CTCGTAGACTGCGTACC -GAATTC- CAT CTGA

17、CGCAT GGTTAA-5 -CTTAAG- EcoR端端 引物：引物： CORE ENZ EXT 5-GACTGCGTACCAATTCNNN 用于AFLP的人工接頭和引物舉例 Mse適配器：適配器： CORE ENZ 5-GACGATGAGTCCTGAG -TTAA- TACTCAGGACTCAT-5 -AATT- Mse端引物：端引物： CORE ENZ EXT 5-GATGAGTCCTGAGTAANNNAFLP對酶切位點(diǎn)的要求 AFLP一般采用雙酶切，一個酶切點(diǎn)多（識別一般采用雙酶切，一個酶切點(diǎn)多（識別4堿基），另一個酶切點(diǎn)少（識別堿基），另一個酶切點(diǎn)少（識別6堿基）。切點(diǎn)多堿基）。切

18、點(diǎn)多的酶產(chǎn)生較小的片段，切點(diǎn)少的酶能夠減少可擴(kuò)增的酶產(chǎn)生較小的片段，切點(diǎn)少的酶能夠減少可擴(kuò)增片段的數(shù)目。這兩種酶都必須產(chǎn)生粘性末端。如果片段的數(shù)目。這兩種酶都必須產(chǎn)生粘性末端。如果用用EcoR（識別（識別6堿基）和堿基）和Mse（識別（識別4堿基）組堿基）組合，則產(chǎn)生的酶切片段有三種：即合，則產(chǎn)生的酶切片段有三種：即Mse/ Mse、EcoR/ Mse、EcoR/ EcoR。如果按酶切位。如果按酶切位點(diǎn)隨機(jī)分布來算（點(diǎn)隨機(jī)分布來算（256，4096），），Mse/ Mse片片段占段占90%以上，以上，EcoR/ Mse片段為片段為EcoR酶切酶切位點(diǎn)數(shù)的兩倍，而位點(diǎn)數(shù)的兩倍，而EcoR/ Ec

19、oR幾乎沒有。幾乎沒有。 AFLP對引物的要求 引物分為三個部分，分別為引物分為三個部分，分別為CORE、ENZ、EXT，其中，其中CORE與人工接頭中的與人工接頭中的CORE互補(bǔ)，互補(bǔ)，ENZ與粘性末端序列互補(bǔ)，與粘性末端序列互補(bǔ)，EXT為選擇性堿基。為選擇性堿基。引物一般引物一般16到到25個堿基，引物個堿基，引物3端的選擇性堿基每端的選擇性堿基每增加增加1個，譜帶數(shù)減少。而選擇性堿基個，譜帶數(shù)減少。而選擇性堿基GC含量越高，含量越高，產(chǎn)生的譜帶數(shù)越少，所以通過調(diào)整選擇性堿基的數(shù)產(chǎn)生的譜帶數(shù)越少，所以通過調(diào)整選擇性堿基的數(shù)目和種類，就能靈活地調(diào)節(jié)擴(kuò)增譜帶數(shù)。隨著選擇目和種類，就能靈活地調(diào)節(jié)

20、擴(kuò)增譜帶數(shù)。隨著選擇性堿基的增加，引物與模板的錯配率也相應(yīng)增加，性堿基的增加，引物與模板的錯配率也相應(yīng)增加，為了控制錯配率，選擇性堿基一般為為了控制錯配率，選擇性堿基一般為13個。個。 AFLP的PCR擴(kuò)增 對于較復(fù)雜的基因組來說，對于較復(fù)雜的基因組來說，AFLP的的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增可分兩步進(jìn)行，第一步預(yù)擴(kuò)增一般采用可分兩步進(jìn)行，第一步預(yù)擴(kuò)增一般采用2種只帶種只帶1個個選擇性堿基的引物，引物不被標(biāo)記，擴(kuò)增后稀釋選擇性堿基的引物，引物不被標(biāo)記，擴(kuò)增后稀釋10倍，取少量作為第二次擴(kuò)增的模板，這樣既為第二倍，取少量作為第二次擴(kuò)增的模板，這樣既為第二步擴(kuò)增提供了充足的模板，又對模板起到了選擇性步擴(kuò)增提供

21、了充足的模板，又對模板起到了選擇性純化的作用，第二次擴(kuò)增采用帶有純化的作用，第二次擴(kuò)增采用帶有23個選擇性堿個選擇性堿基的引物，引物被標(biāo)記，這樣可以提高擴(kuò)增的特異基的引物，引物被標(biāo)記，這樣可以提高擴(kuò)增的特異性。性。 用EcoRI和MseI引物只擴(kuò)增EcoRI-MseI片段 ABC ABC ABC ABC引物組合引物組合： EcoRI+C / MseI+AC： EcoRI+C / MseI+CA： EcoRI+T / MseI+AG： EcoRI+T / MseI+ATA：標(biāo)記：標(biāo)記 EcoRI 引物引物B：標(biāo)記：標(biāo)記 MseI 引物引物C：標(biāo)記：標(biāo)記 MseI 引物，但不加引物，但不加 Eco

22、RI 引物引物只擴(kuò)增EcoRI-MseI片段的原因(i) The MseI primer has a lower annealing temperature than the EcoRI primer, making amplification of MseI-MseI fragments less efficient compared with EcoRI-MseI fragments under the conditions used. We have indeed observed stronger amplification of MseI-MseI fragments using l

23、onger or alternative MseI primers and adapters. 只擴(kuò)增EcoRI-MseI片段的原因(ii) The MseI-MseI fragments have an inverted repeat at the ends, due to the fact that they are amplified by a single primer. Therefore, a stem-loop structure may be formed by base-pairing of the ends of the fragments. which will comp

24、ete with primer annealing. This is also confirmed by the observation that only larger fragments were amplified in AFLP reactions when only the MseI primer was added. Formation of a stem-loop structure will be more difficult in these larger fragments. 引物5端以G開頭的原因 An important feature of the AFLP prim

25、ers is that all primers start with a 5 guanine (G) residue. We have found that a 5 G-residue in the unlabeled primer is crucial to prevent the phenomenon of double bands. The double bands appeared to result from incomplete addition of an extra nucleotide to the synthesized strands. This terminal tra

26、nsferase activity of the Taq polymerase is quite strong. We conclude from our results that this terminal transferase activity is most strong (almost 100% of the synthesized strands) when the 3 nucleotide of the synthesized strand is a cytidine (C). 引物3端選擇性堿基數(shù)目對擴(kuò)增特異性的影響 ABCD ABCD ABCD引物組合引物組合： EcoRI+

27、A / MseI+CTCA： EcoRI+A / MseI+CTGC： EcoRI+T / MseI+CTCAA： MseI 引物帶引物帶1個選擇性堿基個選擇性堿基B： MseI 引物帶引物帶2個選擇性堿基個選擇性堿基C： MseI 引物帶引物帶3個選擇性堿基個選擇性堿基D： MseI 引物帶引物帶4個選擇性堿基個選擇性堿基序列標(biāo)志位點(diǎn)技術(shù) 序列標(biāo)志位點(diǎn)（序列標(biāo)志位點(diǎn)（sequence tag sites，STS）技術(shù)）技術(shù)是一類基于特定引物序列形成的，利用是一類基于特定引物序列形成的，利用PCR技術(shù)進(jìn)技術(shù)進(jìn)行的分子標(biāo)記技術(shù)。行的分子標(biāo)記技術(shù)。 SSR是是序列標(biāo)志位點(diǎn)技術(shù)中的一種，它以某一序列

28、標(biāo)志位點(diǎn)技術(shù)中的一種，它以某一微衛(wèi)星座位兩側(cè)的單一序列設(shè)計引物，擴(kuò)增這個微微衛(wèi)星座位兩側(cè)的單一序列設(shè)計引物，擴(kuò)增這個微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列，然后電泳檢測產(chǎn)物的大小。由于衛(wèi)星位點(diǎn)的序列，然后電泳檢測產(chǎn)物的大小。由于在不同生物個體中這個座位核心序列的重復(fù)次數(shù)可在不同生物個體中這個座位核心序列的重復(fù)次數(shù)可能不同，同一個體的兩條染色體的這個座位核心序能不同，同一個體的兩條染色體的這個座位核心序列的重復(fù)次數(shù)也可能不同（雜合體），這個座位有列的重復(fù)次數(shù)也可能不同（雜合體），這個座位有許多不同長度的等位許多不同長度的等位“基因基因”（復(fù)等位（復(fù)等位“基因基因”）。）。SSR就是檢測不同個體間等位就是檢測不同個體間

29、等位“基因基因”在長度上的在長度上的差異。差異。圖圖96 微衛(wèi)星序列長度多態(tài)性測定微衛(wèi)星序列長度多態(tài)性測定圖圖97 大豆大豆ATT5 SSR位點(diǎn)位點(diǎn)14個等位基因的大小個等位基因的大小單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism , SNP ) SNP是指基因組內(nèi)是指基因組內(nèi)DNA某一特定位置的核苷酸存某一特定位置的核苷酸存在置換、插入、缺失等變化，而且其中最少有一種等在置換、插入、缺失等變化，而且其中最少有一種等位基因在群體中突變頻率不小于位基因在群體中突變頻率不小于1 %。 SNP 一般以替一般以替換為主，顛換與轉(zhuǎn)換之比為換為主，顛換與轉(zhuǎn)換之比

30、為1 :2。轉(zhuǎn)換（轉(zhuǎn)換（transition）：用另一種嘌呤堿基代替原有的嘌）：用另一種嘌呤堿基代替原有的嘌呤堿基，或用另一種嘧啶堿基代替原有的嘧啶堿基。呤堿基，或用另一種嘧啶堿基代替原有的嘧啶堿基。顛換（顛換（transversion）：嘌呤堿基被嘧啶堿基所替代或）：嘌呤堿基被嘧啶堿基所替代或嘧啶堿基被嘌呤堿基所替代。嘧啶堿基被嘌呤堿基所替代。SNP的研究狀況的研究狀況 目前人類基因組研究中目前人類基因組研究中SNP的研究最為廣泛。大的研究最為廣泛。大多數(shù)多數(shù)SNP對蛋白質(zhì)無直接的影響，因為絕大多數(shù)的對蛋白質(zhì)無直接的影響，因為絕大多數(shù)的SNP位于非編碼區(qū)。目前已有的人類基因組位于非編碼區(qū)。目

31、前已有的人類基因組SNP圖譜圖譜中共有中共有142萬個萬個SNP，但只有約，但只有約4. 23%的的SNP位于外顯位于外顯子內(nèi)。子內(nèi)。 除此，在果蠅、雞、犬類、豬、綿羊、牛等動物除此，在果蠅、雞、犬類、豬、綿羊、牛等動物上也開展了上也開展了SNP研究。在植物中展開研究。在植物中展開SNP廣泛研究的廣泛研究的種類則較少，近幾年僅在玉米、大麥、小麥、番茄、種類則較少，近幾年僅在玉米、大麥、小麥、番茄、水稻等農(nóng)作物上開展了此項工作。水稻等農(nóng)作物上開展了此項工作。 編碼區(qū)內(nèi)編碼區(qū)內(nèi)SNP的意義的意義 在基因組在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此因此SNP既有可

32、能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（coding SNP，cSNP）比較少，因為在外顯子）比較少，因為在外顯子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)的研究更受關(guān)注。注。 SNP的影響的影響 從對生物的遺傳性狀的影響上來看，從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可又可分為分為2種：種： 一種是同義一種是同義cSNP（synonymous cS

33、NP），即），即cSNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同。同。 另一種是非同義另一種是非同義cSNP（non-synonymous cSNP），），指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為中約有一半為非同義非同義cSNP。SNP用作遺傳標(biāo)

34、記的優(yōu)點(diǎn)用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn) SNP用作遺傳標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：用作遺傳標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。群中其等位基因頻率都可估計出來。（2）它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。）它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。（3）與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，）與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，SNP是高度是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的cSNP，而串聯(lián)重復(fù)，而串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)的高突變率容易引起對人群的遺傳分的微衛(wèi)星位點(diǎn)的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。析出現(xiàn)困難。SN

35、P用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)（4）部分位于基因內(nèi)部的）部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會直接影響產(chǎn)可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。（5）易于進(jìn)行自動化、規(guī)?；治?，縮短了研究）易于進(jìn)行自動化、規(guī)?；治?，縮短了研究時間。由于時間。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中選中SNPs往往只需往往只需+/-的分析，而不用分析片段的的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發(fā)展自動化技術(shù)篩選或檢測長度，這就利于發(fā)展自動化技

36、術(shù)篩選或檢測SNPs。檢測單核苷酸差異的方法檢測單核苷酸差異的方法單鏈構(gòu)象多態(tài)性（單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Single St rand Conformation Polymorphism，SSCP） DNA片段雙鏈變性成單鏈后，在非變性條件下片段雙鏈變性成單鏈后，在非變性條件下會折疊成不同的空間構(gòu)象，單鏈這種構(gòu)象會因個別會折疊成不同的空間構(gòu)象，單鏈這種構(gòu)象會因個別核苷酸置換而改變，長度相同或相近的單鏈在電泳核苷酸置換而改變，長度相同或相近的單鏈在電泳時由于構(gòu)象不同而具不同遷移率，從而顯示出多態(tài)時由于構(gòu)象不同而具不同遷移率，從而顯示出多態(tài)性。在性。在SSCP 分析時，應(yīng)先將擴(kuò)增后的分析時，應(yīng)先將擴(kuò)增后的

37、DNA片段變片段變性為單鏈，然后在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。性為單鏈，然后在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。檢測單核苷酸差異的方法檢測單核苷酸差異的方法基因芯片法基因芯片法 其基本原理是利用其基本原理是利用DNA分子的變性雜交特性，通過分子的變性雜交特性，通過DNA芯片上的固定探針或樣品芯片上的固定探針或樣品DNA與游離樣品與游離樣品DNA或或探針雜交來推斷未知靶分子的序列，雜交發(fā)生與否可采探針雜交來推斷未知靶分子的序列，雜交發(fā)生與否可采用熒光標(biāo)記技術(shù)來檢測。由于該技術(shù)可將大量探針同時用熒光標(biāo)記技術(shù)來檢測。由于該技術(shù)可將大量探針同時固定于支持物上，所以一次可以對大量固定于支持物上，所以一次可以對

38、大量DNA分子進(jìn)行檢分子進(jìn)行檢測分析，解決了傳統(tǒng)印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、測分析，解決了傳統(tǒng)印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的分子少、效率低的問題。檢測目的分子少、效率低的問題。 近年來的實驗結(jié)果指近年來的實驗結(jié)果指出，一次實驗就可以同時分析成千個多態(tài)性。出，一次實驗就可以同時分析成千個多態(tài)性。檢測單核苷酸差異的方法檢測單核苷酸差異的方法 基因單堿基多態(tài)檢測的芯片一般采用等長移位基因單堿基多態(tài)檢測的芯片一般采用等長移位設(shè)計法，即按靶序列從頭到尾依次取一定長度的互設(shè)計法，即按靶序列從頭到尾依次取一定長度的互補(bǔ)的核苷酸序列形成一探針組合，這組探針是與靶補(bǔ)的核苷酸序列形成一探針組合，這組探針是與靶序列完全匹配的野生型探針，然后對于每一野生型序列完全匹配的野生型探針，然后對于每一野生型探針，將其中間位置的某一堿基分別用其它三種堿探針，將其中間位置的某一堿基分別用其它三種堿基替換，形成三種不同的單堿基變化的核苷酸探針，基替換，形成三種不同的單堿基變化的核苷酸探針，這種設(shè)計可以對某一段核酸序列所有可能的這種設(shè)計可以對某一段核酸序列所有可能的SNPs位位點(diǎn)進(jìn)行掃描。點(diǎn)進(jìn)行掃描?；蛐酒ɑ蛐酒ǚ肿訕?biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域 和經(jīng)典的表型遺傳