布病血清學(xué)檢疫定稿

1、動物布氏桿菌病血清學(xué)診斷動物布氏桿菌病血清學(xué)診斷 1887年英國軍醫(yī)Bruce首先從死于“馬耳他熱”的英國士兵的脾臟中分離出羊種布氏菌。 布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌屬（Brucella）的細(xì)菌侵入機體，引起傳染變態(tài)反應(yīng)性的人畜共患傳染病。 布魯氏菌病簡稱布病。 布魯氏菌簡稱為布氏菌布魯氏菌病布魯氏菌病 適用范圍適用范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動物布魯氏菌病的診斷技術(shù)。 本規(guī)定的虎紅平板凝集試驗、乳牛全乳環(huán)狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病的監(jiān)測及診斷泌乳母牛布病的初篩試驗；試管凝集試驗和補體結(jié)合試驗適用于診斷羊種、牛種和豬種布病感染的家畜。 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的試管凝集試驗不適用

2、于犬種和綿羊副睪種布病感染家畜的檢疫。布魯氏菌病檢驗方法：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌病檢驗方法：依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T18646-2002 布氏桿菌分離培養(yǎng)布氏桿菌分離培養(yǎng) 布菌培養(yǎng)：瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)。 布菌鑒定：菌落形態(tài)觀察、涂片、染色、鏡檢布氏菌，診斷血清凝集試驗。試管增菌試管增菌圖2血平皿 布氏菌菌落圖1瓊脂布魯氏菌菌落布氏菌革蘭染色鏡檢布氏菌革蘭染色鏡檢 布病布病血清學(xué)血清學(xué)檢驗檢驗12布病虎紅平板凝集實驗布病虎紅平板凝集實驗布病試管凝集實驗布病試管凝集實驗布病虎紅平板凝集實驗布病虎紅平板凝集實驗 材料準(zhǔn)備：材料準(zhǔn)備： 抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清由青島易邦生物科技公司提供，按說明用

3、。 受檢血清應(yīng)新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和無腐敗氣味。 準(zhǔn)備一塊潔凈玻璃板，畫成若干個4厘米小格或虎紅平板凝集試驗玻璃板、陶瓷板。 用移液器，適于滴加0.03ml（即300l）液體。 原理：原理： 利用酸性帶色的抗原與被檢血清作用時能抑制血清中的IgM類抗體的凝集活性，主要檢查血清中的IgG類抗體。操作方法操作方法 在實驗薄片上標(biāo)記好位置滴加0.03ml的抗原。圖1. 在每一個標(biāo)記好的布病抗原上滴加0.03ml的待檢血清，用移液器吸頭攪混均勻。 每次試驗應(yīng)設(shè)陰性、陽性血清對照圖圖1 1 判定結(jié)果前最好將抗原與血清混合物搖動幾下.如圖3. 在陰性、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判

4、定。 被檢血清在4分鐘內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象者判為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（）。 每份被檢血清在規(guī)定時間內(nèi)出現(xiàn)凝集反應(yīng)者判為陽性，不出現(xiàn)凝集為陰性反應(yīng)。結(jié)果判定結(jié)果判定注意事項注意事項 本抗原適合于大數(shù)量田間檢疫和篩選診斷試驗用。 本試驗出現(xiàn)陽性反應(yīng)的動物，需經(jīng)試管凝集試驗或其它輔助試驗方可定性。 本抗原使用前應(yīng)充分搖勻，方可使用。 凡本抗原出現(xiàn)污染或搖不散的凝集塊者不得使用。布魯氏菌病試管凝集試驗布魯氏菌病試管凝集試驗 原理：布氏菌侵入機體后，就會刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，這種抗體可與相應(yīng)的布氏菌抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，就會形成肉眼可見的凝集反應(yīng)，也就是用

5、已知抗原查未知抗體。 稀釋液：0.5%石碳酸生理鹽水。檢驗羊血清時用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，如果血清稀釋用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋亦用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液。 1.2抗原、陽性血清、陰性血清由指標(biāo)單位提供，按說明書使用。 1.3 凝集試驗管（三分管）、試管架、吸管及溫箱等。 三分是英制管道直徑長度的叫法，換算成毫米為三分是英制管道直徑長度的叫法，換算成毫米為9.525mm，這里指內(nèi)徑約為，這里指內(nèi)徑約為10mm試管試管材料準(zhǔn)備 1.按常規(guī)方法采血分離血清。 2.運送和保存血清樣品時防止凍結(jié)和受熱，以免影響凝集價。若3d內(nèi)不能送檢，按每9ml血清加1ml5%石碳

6、酸生理鹽水防腐，也可冷藏方法運送血清。 3.被檢血清的稀釋 以羊和豬為例，每份血清用4支凝集試管。 3.1 第1管標(biāo)記檢驗編碼后加1.15mL稀釋液。 3.2 第24管各加入0.5mL稀釋液。 3.3 然后向第1管內(nèi)加入0.1mL被檢血清，并混合均勻。充分混勻后棄去混合液0.25mL。操作方法 3.4 取0.5ml混合液加入第2管，混合均勻。 3.5 再吸第2管混合液0.5mL至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液0.5mL。 3.6 稀釋完畢，從第1至第4管的血清稀釋度分別為1:12.5、1:25、1:50和1:100。 3.7 牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是第

7、1管加1.2mL稀釋液和0.05mL被檢血清。 3.8 將0.5mL稀釋好（具體稀釋倍數(shù)參照試劑生產(chǎn)廠家的要求，一般是1：20）的抗原加入已稀釋好的各血清管中，并振搖均勻，羊和豬的血清稀釋則依次變?yōu)?:25、1:50、1:100和1:200，牛、馬和駱駝的血清稀釋度則依次變?yōu)?:50、1:100、1:200和1:400。 大規(guī)模檢疫時也可只用2個稀釋度，即牛、馬、鹿、駱駝用1：50和1：100，豬、山羊、綿羊和狗用1:25和1:50。 1號管2 號管 3號管 4號管. n0.5%石炭酸10%鹽水1.150.50.50.5.最后一最后一管棄去管棄去0.5ml 被檢血清或陽陰性血清對照加加0.1m

8、l血清，血清，混勻后棄去混勻后棄去0.25ml最后最后體積為體積為1ml0.50.50.5. 試 管 中 加抗原以前液體量0.50.50.50.50.50.5加抗原液加抗原液（1：10稀稀釋好的釋好的） 0.50.50.50.50.50.5血清稀血清稀釋度釋度1:251:501:1001:200.充分混勻充分混勻3718-2418-24小時溫育小時溫育 結(jié)果判定 +-吸0.5ml 12 3 4. n0.5%石炭酸鹽水1.20.50.50.5.最后一管最后一管棄去棄去0.5ml 被 檢 血 清或 陽 陰 性血清對照加加0.05ml血清，混血清，混勻后棄去勻后棄去0.25ml最最后體積為后體積為1

9、ml0.50.50.5.試 管 中 加抗 原 以 前液體量0.50.50.50.50.50.5加抗原液加抗原液（1：10稀稀釋好的釋好的） 0.50.50.50.50.50.5血清稀血清稀釋度釋度1:501:1001:2001:400.充分混勻充分混勻3718-2418-24小時溫育小時溫育 結(jié)果判定 +-吸0.5ml比濁管的制備 + + + +生理鹽水（ml） 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00稀釋抗原（ml） 1.00 0.75 0.50 0.25 0.001.000.750.500.250.250.500.751.001.001.001.001.0051234 3.9 每次

10、試驗均應(yīng)設(shè)陽性血清、陰性血清和抗原對照， a)陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與被檢血清相同。 b)陽性血清對照：陽性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與被檢血清相同。 c)抗原對照：稀釋好的抗原液0.5ml,再加0.5ml稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。 3.10 將稀釋好各管置3740溫箱24小時，取出檢查并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)準(zhǔn) 1供判定參照比濁管制備方法略 2 結(jié)果判定 2.1凝集成度分為： 參照比濁管，按各試管上層液體清亮度判讀 菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮； 菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮； 菌體凝集顯著，液體50%清亮； 凝集物有沉淀，液體25%清亮； 凝集物無沉淀，液體均勻混濁。 2.2牛、馬、鹿、駱駝1：100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1：50血清稀釋，出現(xiàn)“”以上凝集現(xiàn)象時，被檢血清判定為陽性。 2.3牛、馬、鹿、駱駝1：50血清稀釋，豬、山羊、綿羊、狗1：25血清稀釋，出現(xiàn)“”以上凝集現(xiàn)象時，被檢血清判定為可疑反應(yīng)。 可疑反應(yīng)家畜經(jīng)34周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽性。豬和馬經(jīng)重檢仍保持可疑水平，而農(nóng)場的牲畜沒有臨床癥狀和大批陽