第七章 化學(xué)酶工程

1、第七章第七章 化學(xué)酶工程化學(xué)酶工程前言前言n一一 酶的化學(xué)修飾原因酶的化學(xué)修飾原因q1 穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。q2 酶的主要動力學(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)酶的主要動力學(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)易受產(chǎn)物和抑制劑易受產(chǎn)物和抑制劑抑制。抑制。q3體外的反應(yīng)條件不在其最適反應(yīng)條件范圍內(nèi)。體外的反應(yīng)條件不在其最適反應(yīng)條件范圍內(nèi)。q4臨床應(yīng)用的特殊要求不符合臨床應(yīng)用的特殊要求不符合體內(nèi)使用時候，異體蛋體內(nèi)使用時候，異體蛋白抗原性、蛋白水解酶、半衰期短、不能在靶部位有效白抗原性、蛋白水解酶、半衰期短、不能在靶部位有效聚集。聚集。n教學(xué)重點(diǎn)：教學(xué)重點(diǎn)：酶分子化學(xué)修飾的原理；酶分子化學(xué)

2、修飾的原理；酶分子化學(xué)修飾的方法酶分子化學(xué)修飾的方法7.1. 酶化學(xué)修飾酶化學(xué)修飾n定義：定義：n在較溫和條件下，以可控方式使酶同某些化學(xué)試劑發(fā)生在較溫和條件下，以可控方式使酶同某些化學(xué)試劑發(fā)生特異反應(yīng)，特異反應(yīng)，引起酶分子中某些基團(tuán)發(fā)生共價的化學(xué)改變引起酶分子中某些基團(tuán)發(fā)生共價的化學(xué)改變的過程的過程（狹義）（狹義） 。n凡凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，而使酶蛋白共價結(jié)構(gòu)發(fā)，而使酶蛋白共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，稱為酶蛋白的化學(xué)修飾（廣義）。生改變，稱為酶蛋白的化學(xué)修飾（廣義）。酶修飾的方向酶修飾的方向n1蛋白質(zhì)水平（化學(xué)修飾）n2 核酸水平q1酶經(jīng)化學(xué)修飾后，能減少由于內(nèi)部平衡力

3、被破壞而引起的酶分子酶經(jīng)化學(xué)修飾后，能減少由于內(nèi)部平衡力被破壞而引起的酶分子伸展，增強(qiáng)伸展，增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性；酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性；q2 酶表面形成緩沖外殼，抵御外界環(huán)境，維護(hù)酶活性部位穩(wěn)定性。酶表面形成緩沖外殼，抵御外界環(huán)境，維護(hù)酶活性部位穩(wěn)定性。q3 大分子修飾劑產(chǎn)生的空間障礙遮蓋酶活性部位或敏感鍵，增加酶大分子修飾劑產(chǎn)生的空間障礙遮蓋酶活性部位或敏感鍵，增加酶抗抑制劑、抗蛋白水解酶的能力?？挂种苿?、抗蛋白水解酶的能力。q4 修飾可破壞抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，使酶抗原性降低或消失。修飾可破壞抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，使酶抗原性降低或消失。7.1.2酶化學(xué)修飾的內(nèi)在機(jī)制及原理酶化學(xué)修飾的內(nèi)在機(jī)制及原理

4、酶分子化學(xué)修飾的基本要求酶分子化學(xué)修飾的基本要求n1酶性質(zhì)的了解酶性質(zhì)的了解n2修飾劑的選擇修飾劑的選擇n3修飾反應(yīng)條件的選擇修飾反應(yīng)條件的選擇n4. 修飾反應(yīng)的定性定量檢測修飾反應(yīng)的定性定量檢測1酶性質(zhì)的了解酶性質(zhì)的了解n1 酶活性部位情況酶活性部位情況n2 酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件n3 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性等。酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性等。2修飾劑的選擇修飾劑的選擇n1 修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長度對蛋白質(zhì)修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長度對蛋白質(zhì)的吸附性。的吸附性。n2 修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置。修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置。n

5、3 修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。3修飾反應(yīng)條件的選擇修飾反應(yīng)條件的選擇n1 反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例。反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例。n2 反應(yīng)體系的反應(yīng)體系的pH條件、溶劑性質(zhì)，離子強(qiáng)度。條件、溶劑性質(zhì)，離子強(qiáng)度。n3 反應(yīng)溫度及時間。反應(yīng)溫度及時間。4. 修飾反應(yīng)的定性定量檢測修飾反應(yīng)的定性定量檢測n需建立適當(dāng)?shù)姆椒▽Ψ磻?yīng)進(jìn)程進(jìn)行跟蹤，獲得一系列有關(guān)需建立適當(dāng)?shù)姆椒▽Ψ磻?yīng)進(jìn)程進(jìn)行跟蹤，獲得一系列有關(guān)修飾反應(yīng)的數(shù)據(jù)；以確定修飾程度和部位。修飾反應(yīng)的數(shù)據(jù)；以確定修飾程度和部位。n間接分析法，被修飾的殘基經(jīng)分離純化后，通過其含有的間接分析法，被修飾的

6、殘基經(jīng)分離純化后，通過其含有的同位素標(biāo)記量或有色修飾劑的光譜強(qiáng)度、熒光標(biāo)記量來測同位素標(biāo)記量或有色修飾劑的光譜強(qiáng)度、熒光標(biāo)記量來測定反應(yīng)程度。定反應(yīng)程度。n對修飾部位進(jìn)行鑒定，需要被修飾的酶蛋白經(jīng)總降解和氨對修飾部位進(jìn)行鑒定，需要被修飾的酶蛋白經(jīng)總降解和氨基酸分析?；岱治?。7.1.17.1.2 小結(jié)小結(jié)化學(xué)修飾原因化學(xué)修飾原因酶修飾的方向酶修飾的方向基本原理基本原理酶分子化學(xué)修飾的基本要求酶分子化學(xué)修飾的基本要求1 穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。2 酶的主要動力學(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。3體外的反應(yīng)條件不在其最適反應(yīng)條件范圍內(nèi)。4臨床應(yīng)用的特殊要求不符合。核酸水平蛋白質(zhì)水平1 增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)

7、定性與耐熱性2 酶表面形成緩沖外殼，抵御外界環(huán)境，維護(hù)酶活性部位穩(wěn)定性。3 大分子修飾劑產(chǎn)生的空間障礙遮蓋酶活性部位或敏感鍵，增加酶抗抑制劑、抗失活因子能力。4 修飾可破壞抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，使酶抗原性降低或消失。酶性質(zhì)的了解修飾劑的選擇修飾反應(yīng)條件的選擇修飾反應(yīng)定性定量檢測7.1.3 酶分子化學(xué)修飾的方法酶分子化學(xué)修飾的方法1. 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾 （1）幾種重要的修飾反應(yīng)）幾種重要的修飾反應(yīng)（2）特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)）特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾2. 酶分子的親和標(biāo)記酶分子的親和標(biāo)記 3.大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾聚乙二醇聚乙二醇右旋糖酐及右旋

8、糖酐硫酸酯右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽糖肽具有生物活性的大分子物質(zhì)具有生物活性的大分子物質(zhì)4. 酶分子的化學(xué)交聯(lián)酶分子的化學(xué)交聯(lián)1. 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾 n酶分子側(cè)鏈上有各種不同的活潑功能基團(tuán)，可與一些試酶分子側(cè)鏈上有各種不同的活潑功能基團(tuán)，可與一些試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，達(dá)到對酶分子進(jìn)行化學(xué)修飾的目的。劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，達(dá)到對酶分子進(jìn)行化學(xué)修飾的目的。n一幾種重要的修飾反應(yīng)一幾種重要的修飾反應(yīng)n二特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾二特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾n三三. 研究新熱點(diǎn)（擴(kuò)展）研究新熱點(diǎn)（擴(kuò)展）一幾種重要的修飾反應(yīng)一幾種重要的修飾反應(yīng)q1?；磻?yīng)酰化反應(yīng)酶分

9、子側(cè)鏈基團(tuán)的?；磻?yīng)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的酰化反應(yīng)2烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng) 修飾劑特點(diǎn)：修飾劑特點(diǎn)：帶有活潑的鹵素原子，鹵素原子的電負(fù)性使烷基帶有部分帶有活潑的鹵素原子，鹵素原子的電負(fù)性使烷基帶有部分正電荷，容易導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)發(fā)生烷基化。正電荷，容易導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)發(fā)生烷基化。親核基團(tuán)：親核基團(tuán)：親近核的基團(tuán)親近核的基團(tuán),核核,來自于原子核這個概念，帶正電。即：來自于原子核這個概念，帶正電。即：親近正電荷的基團(tuán)，據(jù)異性相吸，這樣的基團(tuán)帶負(fù)電荷。親近正電荷的基團(tuán)，據(jù)異性相吸，這樣的基團(tuán)帶負(fù)電荷。2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯碘乙酸碘乙酸3氧化和還原反應(yīng)氧化和還原反應(yīng) 具有氧化性的試劑，能將側(cè)鏈基

10、團(tuán)氧化（在修飾反應(yīng)中要控制好反應(yīng)條件，具有氧化性的試劑，能將側(cè)鏈基團(tuán)氧化（在修飾反應(yīng)中要控制好反應(yīng)條件， 以免強(qiáng)氧化劑使肽鏈發(fā)生斷裂）以免強(qiáng)氧化劑使肽鏈發(fā)生斷裂）受氧化反應(yīng)作用的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，硫醚基，咪唑基，酚基受氧化反應(yīng)作用的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，硫醚基，咪唑基，酚基還原劑：還原劑： -巰基乙醇，二硫蘇糖醇（主要作用于酶分子中二硫鍵的修飾試劑巰基乙醇，二硫蘇糖醇（主要作用于酶分子中二硫鍵的修飾試劑 ）酶分子中巰基的可逆保護(hù)反應(yīng)酶分子中巰基的可逆保護(hù)反應(yīng)（連四硫酸鈉或連四硫酸鉀）（連四硫酸鈉或連四硫酸鉀）4芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng) 四硝基甲烷四硝基甲烷酶分子酪氨酸殘基的酚羥基在苯環(huán)酶分子酪氨酸

11、殘基的酚羥基在苯環(huán)3和和5位上容易發(fā)生位上容易發(fā)生親電取代的硝化和碘化反應(yīng)親電取代的硝化和碘化反應(yīng)3-硝基酪氨酸衍生物，具有特殊光譜，硝基酪氨酸衍生物，具有特殊光譜，用于直接的定量測定用于直接的定量測定二特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾二特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾 酶分子側(cè)鏈上的功能基團(tuán)：氨基，羧基，巰基，咪唑基，胍酶分子側(cè)鏈上的功能基團(tuán)：氨基，羧基，巰基，咪唑基，胍基，吲哚基，酚基，羥基，硫醚基，二硫鍵?；?，吲哚基，酚基，羥基，硫醚基，二硫鍵。1氨基的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾-賴氨酸側(cè)鏈賴氨酸側(cè)鏈-氨基是酶分子中氨基是酶分子中親核反應(yīng)活性很高的基團(tuán)。親核反應(yīng)活性很高的基團(tuán)。 2羧基的化學(xué)

12、修飾羧基的化學(xué)修飾 3巰基的化學(xué)修飾：具有很強(qiáng)的親核性巰基的化學(xué)修飾：具有很強(qiáng)的親核性專一性強(qiáng)的巰基修飾劑專一性強(qiáng)的巰基修飾劑最常用的定量酶分子中巰基數(shù)目最常用的定量酶分子中巰基數(shù)目的修飾劑（的修飾劑（Ellman試劑）試劑）n可溶性的可溶性的N -乙基馬來酰亞胺敏感型融合蛋白受體；乙基馬來酰亞胺敏感型融合蛋白受體；n定位在高爾基體中，通過膜泡融合調(diào)節(jié)內(nèi)體運(yùn)輸。定位在高爾基體中，通過膜泡融合調(diào)節(jié)內(nèi)體運(yùn)輸。4咪唑基的化學(xué)修飾咪唑基的化學(xué)修飾 5胍基的化學(xué)修飾胍基的化學(xué)修飾 6. 二硫鍵的化學(xué)修飾二硫鍵的化學(xué)修飾n-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）三三. 研究熱點(diǎn)研究熱點(diǎn)-核酸

13、類酶的修飾核酸類酶的修飾 nRNA酶的側(cè)鏈基團(tuán)修飾：指組成酶的側(cè)鏈基團(tuán)修飾：指組成RNA的核苷酸殘基上的功能團(tuán)，的核苷酸殘基上的功能團(tuán)，主要是核糖主要是核糖2-位置上的羥基以及嘌呤、嘧啶堿基上的氨基。位置上的羥基以及嘌呤、嘧啶堿基上的氨基。n方法：方法：n核苷酸置換修飾核苷酸置換修飾n2-位置上的羥基去除位置上的羥基去除n接上氨基酸等有機(jī)化合物接上氨基酸等有機(jī)化合物7.1.3 結(jié)束結(jié)束n重要的修飾反應(yīng)重要的修飾反應(yīng)n特定氨基酸殘基側(cè)特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾?；磻?yīng)?；磻?yīng)烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng)氧化和還原反應(yīng)氧化和還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)氨基的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)

14、修飾羧基的化學(xué)修飾羧基的化學(xué)修飾巰基的化學(xué)修飾巰基的化學(xué)修飾咪唑基的化學(xué)修飾咪唑基的化學(xué)修飾胍基的化學(xué)修飾胍基的化學(xué)修飾二硫基的化學(xué)修飾二硫基的化學(xué)修飾1. 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾 7.1.3 酶分子化學(xué)修飾的方法酶分子化學(xué)修飾的方法1. 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾 （1）幾種重要的修飾反應(yīng)）幾種重要的修飾反應(yīng)（2）特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)）特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾2. 酶分子的親和標(biāo)記酶分子的親和標(biāo)記 3.大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾聚乙二醇聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽糖肽具有生物活性的大分子物質(zhì)

15、具有生物活性的大分子物質(zhì)4. 酶分子的化學(xué)交聯(lián)酶分子的化學(xué)交聯(lián)酶分子的親和標(biāo)記酶分子的親和標(biāo)記n親和標(biāo)記概念：親和標(biāo)記概念：n利用酶和底物親和性，使用利用酶和底物親和性，使用與酶底物結(jié)構(gòu)類似的修飾劑與酶底物結(jié)構(gòu)類似的修飾劑，專一性專一性共價共價結(jié)合到酶分子活性部位氨基酸殘基上，是位點(diǎn)結(jié)合到酶分子活性部位氨基酸殘基上，是位點(diǎn)專一性的化學(xué)修飾。（只對特定部位的特定基團(tuán)進(jìn)行共價專一性的化學(xué)修飾。（只對特定部位的特定基團(tuán)進(jìn)行共價標(biāo)記。）標(biāo)記。）n專一性不可逆抑制專一性不可逆抑制Ks型不可逆抑制（親和標(biāo)記）型不可逆抑制（親和標(biāo)記）Kcat型不可逆抑制：底物的類似物，但型不可逆抑制：底物的類似物，但結(jié)構(gòu)中

16、結(jié)構(gòu)中潛藏著一種化學(xué)活性基團(tuán)潛藏著一種化學(xué)活性基團(tuán)，酶與底物類似物結(jié)合，酶與底物類似物結(jié)合，酶促催化作用進(jìn)行到一定階段以后，潛在的化學(xué)基團(tuán)酶促催化作用進(jìn)行到一定階段以后，潛在的化學(xué)基團(tuán)被暴露、活化，和酶活性中心發(fā)生共價結(jié)合，使酶失活。被暴露、活化，和酶活性中心發(fā)生共價結(jié)合，使酶失活。該過程為酶的該過程為酶的“自殺自殺”。自殺性底物：青霉素亞砜自殺性底物：青霉素亞砜7.1.3 酶分子化學(xué)修飾的方法酶分子化學(xué)修飾的方法1. 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾 （1）幾種重要的修飾反應(yīng)）幾種重要的修飾反應(yīng)（2）特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)）特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾2. 酶分

17、子的親和標(biāo)記酶分子的親和標(biāo)記 3.大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾聚乙二醇聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽糖肽具有生物活性的大分子物質(zhì)具有生物活性的大分子物質(zhì)4. 酶分子的化學(xué)交聯(lián)酶分子的化學(xué)交聯(lián)有機(jī)大分子對酶的修飾有機(jī)大分子對酶的修飾q概念：利用水溶性和生物活性的大分子與酶通過共價鍵概念：利用水溶性和生物活性的大分子與酶通過共價鍵結(jié)合，使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的結(jié)合，使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能；特性與功能；q特點(diǎn)：這些水溶性和生物活性大分子不能直接與酶分子特點(diǎn)：這些水溶性和生物活性大分子不能直接與酶分子上的基團(tuán)反應(yīng)，使用之前需

18、進(jìn)行活化上的基團(tuán)反應(yīng)，使用之前需進(jìn)行活化常用的大分子修飾劑常用的大分子修飾劑 q聚乙二醇聚乙二醇 q右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯q糖肽糖肽 q具有生物活性的大分子物質(zhì)具有生物活性的大分子物質(zhì) 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）n用的最多的一類修飾劑；用的最多的一類修飾劑；n特點(diǎn)：溶解度高，沒有免疫原性和毒性；特點(diǎn)：溶解度高，沒有免疫原性和毒性；n應(yīng)用：采用應(yīng)用：采用只帶有一個可被活化羥基聚乙二醇只帶有一個可被活化羥基聚乙二醇（MPEG）：）：MPEG三氯均嗪類衍生物（三氯均嗪類衍生物（7-15,7-16）n用聚乙二醇修飾過的超氧化物岐化酶，用聚乙二醇修飾過的超氧化物岐化酶，可降低

19、或消除酶可降低或消除酶的抗原性，提高抗蛋白水解酶能力，延長酶在體內(nèi)半衰的抗原性，提高抗蛋白水解酶能力，延長酶在體內(nèi)半衰期時間，從而提高酶的藥效。期時間，從而提高酶的藥效。聚乙二醇分子式聚乙二醇分子式糖肽糖肽n來源：通過蛋白水解酶降解纖維蛋白或來源：通過蛋白水解酶降解纖維蛋白或-球蛋白得到；球蛋白得到；n糖肽上的氨基經(jīng)活化后，與酶分子中的氨基反應(yīng)，以共價鍵結(jié)糖肽上的氨基經(jīng)活化后，與酶分子中的氨基反應(yīng)，以共價鍵結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對酶的修飾；合，實(shí)現(xiàn)對酶的修飾；n戊二醛法活化糖肽之后，進(jìn)行酶的修飾戊二醛法活化糖肽之后，進(jìn)行酶的修飾具有生物活性的大分子物質(zhì)具有生物活性的大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)類修飾蛋白質(zhì)類修飾n血漿

20、蛋白質(zhì)是血漿的天然組分；n分子質(zhì)量比較大；n其中人血清白蛋白應(yīng)用較多的酶修飾劑。常用修飾方法常用修飾方法q1戊二醛法：戊二醛雙功能基團(tuán) q2碳二亞胺法：碳二亞胺作為交聯(lián)劑 q3活性酯法： 戊二醛法戊二醛法n利用戊二醛利用戊二醛雙功能基團(tuán)的活潑性雙功能基團(tuán)的活潑性，使白蛋白和酶分子上的氨，使白蛋白和酶分子上的氨基發(fā)生交聯(lián)而對酶進(jìn)行修飾?；l(fā)生交聯(lián)而對酶進(jìn)行修飾?；钚怎シɑ钚怎シ╭（1）原理：根據(jù)多肽合成原理發(fā)展起來）原理：根據(jù)多肽合成原理發(fā)展起來 q（2）特點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，減少了修飾反應(yīng)中副反應(yīng)）特點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，減少了修飾反應(yīng)中副反應(yīng)的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。q（3）工藝步驟：）工藝步驟：活性酯法介

21、導(dǎo)白蛋白修飾酶的反應(yīng)過程：活性酯法介導(dǎo)白蛋白修飾酶的反應(yīng)過程：a 白蛋白琥珀?；椎鞍诅牾；?b 活性酯形成反應(yīng)活性酯形成反應(yīng) c 修飾反應(yīng)修飾反應(yīng) 大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾 概念概念 常用的水溶性和生物活性大分常用的水溶性和生物活性大分子修飾劑子修飾劑 舉例：舉例：聚乙二醇聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽糖肽具有生物活性的大分子物質(zhì)具有生物活性的大分子物質(zhì)聚乙二醇結(jié)合修飾聚乙二醇結(jié)合修飾SOD7.1.3 酶分子化學(xué)修飾的方法酶分子化學(xué)修飾的方法1. 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾 （1）幾種重要的修飾反應(yīng)）幾種重要的修飾反應(yīng)（2）特定氨基酸

22、殘基側(cè)鏈基團(tuán)）特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾2. 酶分子的親和標(biāo)記酶分子的親和標(biāo)記 3.大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾聚乙二醇聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽糖肽具有生物活性的大分子物質(zhì)具有生物活性的大分子物質(zhì)4. 酶分子的化學(xué)交聯(lián)酶分子的化學(xué)交聯(lián)n交聯(lián)劑：交聯(lián)劑：具有兩個活性反應(yīng)基團(tuán)的雙功能試劑具有兩個活性反應(yīng)基團(tuán)的雙功能試劑，可在酶分子內(nèi)，可在酶分子內(nèi)相距較近的兩個氨基酸殘基直接形成共價交聯(lián)，使酶分子空間相距較近的兩個氨基酸殘基直接形成共價交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更穩(wěn)定。構(gòu)象更穩(wěn)定。n交聯(lián)酶晶體制備交聯(lián)酶晶體制備擴(kuò)充知識點(diǎn)擴(kuò)充知識點(diǎn)金屬離子置換修飾金屬離

23、子置換修飾q把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。稱為金屬離子置換修飾。q常用的離子：大都是二價金屬離子。常用的離子：大都是二價金屬離子。-淀粉酶中的鈣離子淀粉酶中的鈣離子（ Ca2+ ），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子（），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子（ Zn2+ ），超氧化），超氧化物岐化酶分子中的銅、鋅離子（物岐化酶分子中的銅、鋅離子（ Ca2+ 、Zn2+ ）q從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶會喪失催化活性。從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶會喪失催化活性。重新加入原

24、有的金屬離子，酶的催化活性可恢復(fù)。若用另重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，可使酶呈現(xiàn)不同的特性：酶的活一種金屬離子進(jìn)行置換，可使酶呈現(xiàn)不同的特性：酶的活性降低或增加。性降低或增加。舉例舉例n將基質(zhì)金屬蛋白酶的將基質(zhì)金屬蛋白酶的Zn2+除去，然后用除去，然后用Ca2+置換，則酶置換，則酶活力可提高活力可提高20-30%。若將鈣型蛋白酶制成結(jié)晶，則其酶。若將鈣型蛋白酶制成結(jié)晶，則其酶活力比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高活力比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高2-3倍。倍。 n應(yīng)用：只是適用于在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。應(yīng)用：只是適用于在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶

25、。金屬離子置換修飾的過程金屬離子置換修飾的過程n除去原有的金屬離子除去原有的金屬離子：加入金屬螯合劑加入金屬螯合劑EDTA，使酶分子中，使酶分子中的金屬離子與的金屬離子與EDTA形成螯合物。通過透析、超濾等將形成螯合物。通過透析、超濾等將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去，此時，酶稱為無活性狀金屬螯合物從酶液中除去，此時，酶稱為無活性狀態(tài)。態(tài)。n加入置換離子加入置換離子：去離子的酶液中加入另一種金屬離子，酶：去離子的酶液中加入另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，得到置換后的酶。蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，得到置換后的酶。n定義：定義：n在較溫和條件下，以可控方式使酶同某些化學(xué)試劑發(fā)生在

26、較溫和條件下，以可控方式使酶同某些化學(xué)試劑發(fā)生特異反應(yīng)，從而特異反應(yīng)，從而引起酶分子中某些基團(tuán)引起酶分子中某些基團(tuán)發(fā)生共價的化學(xué)發(fā)生共價的化學(xué)改變的過程（狹義）改變的過程（狹義） 。7.1.17.1.2 小結(jié)小結(jié)化學(xué)修飾原因化學(xué)修飾原因酶修飾的方向酶修飾的方向基本原理基本原理酶分子化學(xué)修飾的基本要求酶分子化學(xué)修飾的基本要求1 穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。2 酶的主要動力學(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。3體外的反應(yīng)條件不在其最適反應(yīng)條件范圍內(nèi)。4臨床應(yīng)用的特殊要求不符合。核酸水平蛋白質(zhì)水平1 增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2 酶表面形成緩沖外殼，抵御外界環(huán)境，維護(hù)酶活性部位穩(wěn)定性。3 大分子修飾劑產(chǎn)生的

27、空間障礙遮蓋酶活性部位或敏感鍵，增加酶抗抑制劑、抗失活因子能力。4 修飾可破壞抗原決定簇的結(jié)構(gòu)，使酶抗原性降低或消失。酶性質(zhì)的了解修飾劑的選擇修飾反應(yīng)條件的選擇修飾反應(yīng)定性定量檢測7.1.3 酶分子化學(xué)修飾的方法酶分子化學(xué)修飾的方法1. 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾 （1）幾種重要的修飾反應(yīng)）幾種重要的修飾反應(yīng)（2）特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)）特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾的化學(xué)修飾2. 酶分子的親和標(biāo)記酶分子的親和標(biāo)記 3.大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾聚乙二醇聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽糖肽具有生物活性的大分子物質(zhì)具有生物活性的大分子物質(zhì)4.

28、 酶分子的化學(xué)交聯(lián)酶分子的化學(xué)交聯(lián)5. 金屬離子置換修飾金屬離子置換修飾化學(xué)修飾（廣義）化學(xué)修飾（廣義）n凡凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，而使酶蛋白共價結(jié)構(gòu)發(fā)，而使酶蛋白共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，稱為酶蛋白的化學(xué)修飾（廣義）。生改變，稱為酶蛋白的化學(xué)修飾（廣義）。n利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能?？臻g結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能。7.1.4 化學(xué)修飾酶的特性化學(xué)修飾酶的特性n1熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性n2抗原性抗原性n3體內(nèi)半衰期體內(nèi)半衰期n4最適最適pHn5酶學(xué)性質(zhì)

29、的改變酶學(xué)性質(zhì)的改變n6對組織的分布能力變化對組織的分布能力變化1熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性原因：原因：n1修飾劑存在多個活性反應(yīng)基團(tuán)，可與酶多點(diǎn)交聯(lián)，修飾劑存在多個活性反應(yīng)基團(tuán)，可與酶多點(diǎn)交聯(lián)，穩(wěn)穩(wěn)定了酶的天然構(gòu)象，增強(qiáng)了酶的結(jié)構(gòu)剛性定了酶的天然構(gòu)象，增強(qiáng)了酶的結(jié)構(gòu)剛性，不易伸展打，不易伸展打開。開。n2減少了酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動。減少了酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動。熱穩(wěn)定性舉例：熱穩(wěn)定性舉例：q例：例：q過氧化氫酶：右旋糖酐：過氧化氫酶：右旋糖酐：50/10min50/10min，40%-90% 40%-90% q糜蛋白酶：右旋糖酐：糜蛋白酶：右旋糖酐：37/6h37/6h，0%-70% 0%-70%

30、q糜蛋白酶：肝素：糜蛋白酶：肝素：37/6h37/6h，0%-80% 0%-80% q尿酸酶：人血清白蛋白：尿酸酶：人血清白蛋白： 37/48h37/48h，50%-95%50%-95%二抗原性二抗原性q原因：原因：n組成抗原決定簇的基團(tuán)組成抗原決定簇的基團(tuán)與修飾劑形成了共價鍵與修飾劑形成了共價鍵，破壞了，破壞了抗原決定簇的結(jié)構(gòu)抗原決定簇的結(jié)構(gòu)n大分子大分子修飾劑遮蓋抗原決定簇修飾劑遮蓋抗原決定簇和阻礙抗原、抗體產(chǎn)生結(jié)和阻礙抗原、抗體產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)合反應(yīng)q部分可消除。部分可消除。PEGPEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明顯。果明顯。3體內(nèi)半衰期體內(nèi)半衰期q體內(nèi)半衰期延長體內(nèi)半衰期延長q酶在經(jīng)化學(xué)修飾之后，增強(qiáng)了抗蛋白水解酶、抗抑制劑和抗失活酶在經(jīng)化學(xué)修飾之后，增強(qiáng)了抗蛋白水解酶、抗抑制劑和抗失活因子的