預測的SARS冠狀病毒刺突蛋白S2亞基B細胞表位肽在大腸桿菌中的表

1、猜測的SARS冠狀病毒刺突卵白S2亞基B細胞表位肽在大腸桿菌中的表馮宇,萬敏,王宣軍,張培因,于永利,王麗穎【關鍵詞】SARS冠狀病毒刺突卵白;,B細胞表位猜測;,朋友10分子;,S2亞基ExpressinfpreditedBellepitpepeptideinS2subunitfSARSrnavirusspikeprtEininE.liandidentifiatinfitsiiantigeniityKeyrdsSARSspikeprtein;Bellepitpepreditin;haperne10;S2subunit摘要目的:研究猜測的SARS冠狀病毒刺突卵白S2亞基B細胞表位肽在大腸桿菌中

2、的表達及其模擬S2卵白的抗原性。要領:用DNAStar軟件對S2亞基序列舉行闡發(fā),猜測B細胞表位地點肽段。通過4輪PR反響人工搭建猜測表位DNA序列并克隆到含有朋友10基因的pET28a(+)載體中,組成重組載體pET28hap10S2epi。重組卵白hap10S2epi在E.liBL21(DE3)中表達并以SDSPAGE和esternblt舉行斷定。用純化的hap10S2epi免疫家兔制備抗血清,并通過ELISA斷定hap10S2epi的抗原性。結果:樂成構建并在大腸桿菌中表達了hap10S2pei交融卵白。hap10S2epi免疫的抗血清能識別真核細胞表達的SARS冠狀病毒全長S2刺突卵白

3、。結論:猜測的SARS冠狀病毒S2刺突卵白B細胞表位肽可以或許誘導家兔產(chǎn)生針對S2卵白的抗體,為研制抗SARS病毒基因工程疫苗奠基了基矗關鍵詞SARS冠狀病毒刺突卵白;B細胞表位猜測;朋友10分子;S2亞基SARS冠狀病毒刺突卵白spikeprtein是組成病毒衣殼突起的重要布局卵白,在病毒侵襲宿主細胞歷程中發(fā)揮緊張生物學成效:與宿主細胞外貌受體結合,并介導病毒與宿主細胞膜交融使病毒進入宿主細胞1,2。S卵白由S1、S2兩個亞基組成,此中S2亞基序列相對守舊并到場病毒與宿主細胞膜交融歷程,被以為是產(chǎn)生中和性抗體的緊張抗原區(qū)3,4。因此,S2卵白與SARS病毒的高度易感性嚴密相干。為進一步探究S

4、2卵白成效,本研究中利用分子生物學軟件對S2卵白的B細胞表位舉行了多參數(shù)猜測,并按照猜測結果用人工合成的要領構建了朋友10S2表位肽交融基因,在E.liBL21(DE3)中表達的表位肽交融卵白與真核表達的全長S2卵白有部門配合的抗原性,這為進一步研究S2卵白成效及研制抗SARS病毒疫苗打下了基矗1質(zhì)料和要領1.1質(zhì)料ERI、NI及HindIII購于寶泰克生物公司。DNA聚合酶、T4DNA毗連酶購自美國Prega公司?？菇M氨酸單克隆抗體Ab、HRP標識表記標幟的羊抗鼠IgG、HRP標識表記標幟的羊抗兔IgG、卡那霉素、氨芐青霉素及IPTG均購自Siga公司。硝酸纖維素膜N購自美國Shleiher

5、Shuell公司。pET表達體系購自美國Nvagen公司。載體pD18T購于大連寶生物生物工程公司。DNA接納試劑盒購自鼎國公司。E.liJ109、BL21由本室保存。用于擴增S2基因的引物由上海生工生物工程公司合成。1.2要領2結果2.1B細胞表位的猜測及DNA段的構建用DNAStar對SARS病毒基因序列編號為AY707461S2卵白中大概B細胞表位舉行猜測,綜合闡發(fā)種種參數(shù),選擇抗原指數(shù)大于0,親水性指數(shù)大于0,氨基酸位于卵白分子外貌大概性大于1而且相近柔性布局的氨基酸區(qū)段作為猜測的B細胞表位。末了選擇位于S2卵白N端第5-122個氨基酸區(qū)段作為包羅猜測B細胞表位的區(qū)段舉行克隆構建圖1。

6、圖1S2卵白親水性地區(qū)、抗原指數(shù)、氨基酸外貌大概性及二級布局柔性地區(qū)闡發(fā)略Fig1TheultiparaeterpreditinfS2subunitfSARSrnavirusspikeprtEin2.2hapS2重組質(zhì)粒的構建與斷定按照表位猜測結果方案4對PR引物,從中心向兩頭顛末4輪PR反響合成400bp擺布的SARS冠狀病毒S2卵白區(qū)大概的B細胞表位編碼基因定名為S2epi圖2,并經(jīng)DNA序列闡發(fā)無誤。將S2epi基因克隆到pET28分子朋友10hap10質(zhì)粒的序列的hap10基因卑劣,構建成pET28hap10S2epi交融基因重組質(zhì)粒,經(jīng)ERI與HindIII酶切電泳后可見一巨細為40

7、0bp擺布的片斷圖3。圖2PR法搭建S2epi基因片斷的電泳圖略Fig2nstrutinfS2epigenebyPR:DNAarker;1:PRprdut.圖3pEThap10S2epi重組質(zhì)粒酶切斷定略Fig3nstrutinfpET28ahap10S2epirebinantvetr:DNAarker;1:pET28ahap10S2epirebinantvetrdigestedbyERIandHindIII;2:pET28aplasiddigestedbyERIandHindIII.2.3重組hap10S2epi卵白的表達與純化將轉化pET28hap10S2epi重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(

8、DE3)經(jīng)IPTG誘導3h后超聲裂解,經(jīng)SDSPAGE斷定,重組卵白為可溶性表達圖4中1和2泳道。裂菌所得上清經(jīng)鎳親和層析及G25除鹽純化后得到表不雅相對分子質(zhì)量(r)約為30000的卵白圖4,與理論盤算推測的重組卵白r符合。圖4hap10S2epi卵白的表達純化略Fig4Expressinandpurifiatinfhap10S2epifusinprtein1:BL21(DE3)induedfr3h;2:BL21(DE3)uninduedLane;3:hap10S2epidesaltedbySephadexG25;4:hap10S2epipreparatinprirtdesalting;5:

9、BreakthrughfratinfrNiSepharseFFlun;6:FratinselutedfrNiSepharseFFlun;:Lleulareightarker.2.4重組hap10S2epi卵白的esternblt斷定用抗Histag的Ab對SDSPAGE電泳闡發(fā)的重組hap10S2epi卵白舉行esternblt斷定,結果表現(xiàn):pET28hap10S2epi重組質(zhì)粒轉化的表達菌出現(xiàn)了陽性條帶,而pET28空質(zhì)粒轉化菌無反響條帶圖5。圖5hap10S2epi基因交融表達產(chǎn)物的esternblt斷定略Fig5Identifiatinfhap10S2epibyesternblt1:B

10、L21(DE3)harbringpET28aplasid;2:BL21(DE3)harbringpET28hap10S2epiplasid.2.5hap10S2epi重組卵白的免疫原性斷定用全長S2卵白作為檢測抗原,接納ELISA法檢測hap10S2epi卵白免疫的家兔血清中抗SARS冠狀病毒S2卵白抗體的程度,結果表現(xiàn):家兔血清1100、1200、1400稀釋組A492值大于陰性比較組A492值2倍圖6,說明家兔血清中含有能識別SARS病毒S2卵白的抗體。圖6hap10S2epi的卵白免疫原性斷定略Fig6Identifiatintheiungeniityfhap10S2epi3討論病毒中和

11、性B細胞抗原表位簡直定對SARS的診斷、疫苗分子方案及免疫干預治療至關緊張。SARS是由冠狀病毒引起的一種急性感抱病,在SARS治療歷程中,利用病愈病人血清獲得了必然的療效,必定了中和性抗體在SARS治療及防范中的作用,但利用病愈病人血清結果并不不變,而且存在埋伏的寧靜性題目。本研究按照B細胞表位特性,先猜測抗原表位,通過人工合成的要領構建出SARS冠狀病毒刺突卵白S2亞基DNA,在大腸桿菌中表達后利用金屬鏊合層析純化得到朋友10S2表位交融卵白hap10S2epi,制止了從SARS患者構造或體液提取DNA的不寧靜性,是一種經(jīng)濟、省時、省力的要領。應用種種相干軟件對卵白質(zhì)的布局和特性舉行猜測,

12、特殊是表位猜測,在醫(yī)學、生物范疇里都得到了證明5。在對SARS病毒S2卵白氨基酸序列闡發(fā)的歷程中,我們創(chuàng)造病毒S2卵白N端5122個氨基酸序列片斷表現(xiàn)多種要領猜測的同等性,該地區(qū)具有較好的親水性和可及性,在二級布局上那么含有不規(guī)矩卷曲和轉角布局,這些特點與卵白質(zhì)抗原決定簇的布局特點符合6。在隨后的ELISA實行中,由交融卵白制備的抗血清與酵母表達的S2完備卵白相結合,證明了我們所猜測的B細胞表位的正確性。更進一步的實行可以利用SARS活病毒舉行病毒中和實行,確定此地區(qū)中是否含有中和性的B細胞表位。分子朋友10hap10為一r10000的卵白,屬于熱休克卵白家屬中的成員,是HSP60的共朋友分子

13、,一同到場卵白的折疊。分子朋友被界說為能結合和不變另一卵白質(zhì)不不變構象異構體的一組卵白質(zhì),并通過結合和開釋,在體內(nèi)可利于其他卵白質(zhì)的準確組裝、折疊、跨膜轉運及錯誤折疊卵白質(zhì)的落解7。真核細胞卵白在原核細胞中表達時每每形成不成溶的包容體。以包容體情勢存在的卵白由于沒有有準確的三級布局,以是不具有相應的生物學活性。從包容體中提取活性卵白要顛末繁瑣的包容體制備、溶解、純化、重折疊等歷程,這不單增長了卵白質(zhì)純化歷程的難度而且每每活性卵白得率很低8。在本研究中,S2表位卵白與分子朋友10形成的交融卵白在大腸桿菌中以可溶的情勢表達,利用交融卵白端所帶有的六聚組氨酸純化標簽可以一步親和層析純化得到較高純度的

14、S2卵白舉行后續(xù)的卵白質(zhì)成效研究,制止了龐大的包容體純化歷程。而且由于hap10S2epi卵白N端的分子朋友10的存在,進步了卵白的表達程度,使得交融卵白表達程度占菌體總卵白的40%擺布。綜上所述,我們通過對SARS病毒S2卵白氨基酸序列的闡發(fā),猜測了S2卵白中B細胞表位地點肽段,然后接納人工合成基因的方法用PR法構建出該肽段的DNA片斷,再將該肽段與朋友10分子在大腸桿菌中舉行交融表達,并用純化后的交融卵白免疫動物制備多克隆抗體,末了應用ELISA法確定產(chǎn)生的抗體可與酵母表達的完備S2卵白結合,證明了所猜測B表位的準確性。本研究結果為進一步研究SARS病毒S2卵白的成效及研制抗SARS病毒基

15、因工程疫苗打下了基矗參考文獻:1TanYJ,LiSG,HngJ.haraterizatinfviralprteinsendedbytheSARSrnavirusgeneJ.AntiviralResearh,2022,65(2):69-78.2梅林,李京,閆婕,等.SARS冠狀病毒編碼卵白質(zhì)及其基因闡發(fā)的研究希望J.細胞與分子免疫學雜志,2022,20(1):126-128.3LiP,GldanN.PhylgenisandbiinfratisfSARSVJ.TRENDSirbi,2022,12(3):106-111.4秦宇,李梅,劉中華,等.抗sarsV重組纖突卵白單克隆抗體的制備和斷定J.細胞與分子免疫學雜志,2022,21(5):611-612.5楊清武,朱佩芳,王正國,等.人TLR4的B細胞上風表位方案、合成及其免疫原性檢測J.中華微生物學和免疫學雜志,2002,22(4):362.6KauayaPT,radSF,DiGergerA,etal.Glysylatindepedentpeptideantigeni