【生物課件】 哺乳動物克隆技術(08-08-25)

1、第七章 哺乳動物克隆技術 隨著1997年2月Nature雜志報道英國Roslin研究所等人創(chuàng)造的克隆羊多莉(Dolly)誕生，生物工程掀開了新的一頁?？寺?clone)一詞原意為無性繁殖系，在體外培養(yǎng)的細胞中早有使用，細胞克隆是指由一個細胞經(jīng)細胞分裂而產(chǎn)生出的一群細胞，而動物克隆是指由一個動物經(jīng)無性繁殖而產(chǎn)生的遺傳性狀完全相同的后代個體。卵細胞供體羊Scottish Blackface sheepDollyDollyFinnDorset(Foster Mother, 寄母)核供體羊克隆羊“多莉誕生后，克隆技術研究立即成為世界各國生物學家競相開展的生物學高新技術研究?？寺〖夹g之所以一經(jīng)產(chǎn)生立即引

2、起高度重視，是因為克隆技術不但具有重要的理論意義而且具有良好的應用前景。 第一節(jié) 哺乳動物克隆的開展歷史講授提綱第七章 哺乳動物克隆技術 第二節(jié) 哺乳動物克隆的技術方法第三節(jié) 克隆動物的早衰問題第四節(jié) 克隆動物的應用前景第一節(jié) 哺乳動物克隆的開展歷史同種胚胎細胞克隆同種體細胞克隆異種體細胞克隆克隆動物技術的開展已經(jīng)歷了60余年的漫長探索，根據(jù)供體細胞核與去核卵細胞的來源可歸納為3個標志性的開展階段。1938年，德科學家Hans Spemann最早提出克隆設想。1952年，美國科學家Briggs和King將發(fā)育后期的青蛙胚胎細胞核植入青蛙卵中，沒有發(fā)育。1965年，中國實驗胚胎學家童第周完成了金

3、魚核移植并獲得成功。1981年，Illmensee和Hoppe用小鼠胚胎細胞第一次獲得了克隆小鼠，但其實驗未能被重復。第一個階段 同種胚胎細胞克隆1984年，丹麥科學家Willadsen用胚胎細胞克隆羊獲得成功。1990年，中國科學院發(fā)育生物學研究所杜淼獲得了克隆兔。 隨后，90年代，中國科學家利用胚胎細胞相繼克隆成了兔、羊、豬、牛、小鼠等幾種動物。1993年，美國的First用牛內細胞團細胞成功地獲得了克隆牛。1997年，中國學者孟勵在美國成功獲得克隆猴。 至此，國內外動物克隆采用的均為胚胎細胞。1997年，孟勵首次用胚胎細胞獲得的克隆猴。1997年，英國羅斯林研究所等宣布用成年羊乳腺細胞首

4、次獲得克隆羊。1998年，日本科學家Kato等用牛的輸卵管細胞得到克隆牛。第二個階段 同種體細胞克隆1998年，美國夏威夷大學的Yanagimachi等用克隆鼠的卵丘細胞核作供體，獲得了克隆再克隆小鼠。至此，同種體細胞克隆進入成熟階段。1998年，新西蘭成功地克隆了奶牛，并克隆了世界上僅存的最后一頭珍稀牛。附：同種體細胞克隆研究現(xiàn)狀1999年10月和2000年5月，我國揚州大學與中科院發(fā)育所合作用攜帶外源基因的體細胞克隆出轉基因山羊。2000年6月，我國西北農(nóng)業(yè)大學用體細胞克隆出山羊。2000年9月，美國科學家采用原核互換的兩步核移植方法獲世界首例克隆豬。2001年1月，美國麻省ATC公司克隆

5、出一只印度野牛。2002年初，世界上第一只克隆貓在美國誕生。2002年，世界上第一只克隆兔在法國誕生。2003年5月，世界上第一只克隆騾子在美國誕生。2003年8月，世界上第一只克隆馬在意大利誕生。2002年初，我國首批成年體細胞克隆牛群體誕生。2002年初，在美國誕生的世界上第一只克隆貓。2002年，在法國誕生的世界上第一只克隆兔。2003年5月，在美國誕生的世界上第一只克隆騾子。2003年8月，在意大利誕生的世界上第一只克隆馬。2002年初，在我國誕生的首批成年體細胞克隆牛。1998年1999年，美國人White用珍稀動物盤羊的體細胞核與牛卵結合，韓國黃禹錫將白頭山老虎體細胞核與牛卵結合，

6、我國學者陳大元將大熊貓體細胞核與兔卵結合，均成功克隆出早期胚胎。 2001年10月,意大利科學家報道異種克隆瀕危的歐洲盤羊獲得成功。第三個階段 異種體細胞克隆第二節(jié) 哺乳動物克隆的技術方法克隆動物主要方法：胚胎分割胚胎細胞核移植體細胞核移植連續(xù)細胞核移植優(yōu)質動物體細胞的來源動物卵母細胞的成熟培養(yǎng)重構胚胚胎移植克隆動物檢測體細胞核移植法克隆動物的大體操作流程卵母細胞核體細胞核核移植體外培養(yǎng)1、動物體細胞的體外培養(yǎng)G0期(細胞周期時相)常規(guī)體外培養(yǎng)降低血清使用量細胞分裂停止移核前卵丘卵母細胞復合體(COC)用M199洗3次100l成熟培養(yǎng)液成熟培養(yǎng)液： M199 +10% FCS +10 g/mL

7、 PMSG +10 g/mL HCG5%CO2，38.5，飽和濕度24h 或2830h觀察卵丘擴展情況例:小牛卵母細胞的成熟培養(yǎng)養(yǎng)(IVM)2、卵母細胞的成熟培養(yǎng)盲吸法熒光法擠壓法吸引法蔗糖法3、去核方法帶下注射直接胞質內注射法4、核注射方法透明帶應用piezo-pulse設備直接注射法常規(guī)法原核互換兩步法孤雌活化協(xié)同法誘導法5、核移植方法將數(shù)枚重構胚放入100L的胚胎培養(yǎng)液CR1-aa中培養(yǎng)48h后，選擇4細胞以上的胚胎移入鋪滿飼養(yǎng)層細胞 的培養(yǎng)液滴中。在120h半換液，148h參加1mg/mL的葡萄糖。以后每隔48h半換液。5、重構胚胎的體外培養(yǎng)小鼠胎兒成纖維細胞6、胚胎移植方法假孕的同步

8、發(fā)情的寄母輸卵管內移植子宮角移植體細胞核卵母細胞重構胚移入同步發(fā)情的動物輸卵管或子宮內體體體細胞克隆動物研究路線圖圖圖體外培養(yǎng)去核胚胎移植移核7、克隆動物的檢測方法微衛(wèi)星圖譜法同工酶法克隆?！皠觿拥奈⑿l(wèi)星檢測結果(紅色代表標準分子量，藍色和綠色代表擴增片段)受胎率低26.2%流產(chǎn)率高(53.8%)克隆動物的存活率低35.7%)常出現(xiàn)早衰現(xiàn)象存 在 問 題第三節(jié) 克隆動物的衰老問題克隆羊“多莉出現(xiàn)了早衰現(xiàn)象，其端粒長度比正常出生的羊短了20%，這與供核羊Finn Dorset的6歲年齡直接相關。人類染色體端粒的熒光免疫原位雜交照片1999年，美籍華人楊向中教授第一個報道了克隆動物具有正常長度的端

9、粒和遺傳年齡，得出克隆動物不會未老先衰、克隆動物的遺傳年齡與供體動物年齡無關的結論。此后，這一結論被美國麻省的ATC公司在克隆牛上和美國洛克菲勒大學在克隆鼠上得到證實。總之，由于細胞衰老的分子機理至今仍未能研究清楚，因此有關克隆動物的衰老問題，目前仍在爭論中，還需要進一步的研究來證實。端粒酶結構的模式圖解第四節(jié) 克隆動物的應用前景克隆動物在畜牧業(yè)和醫(yī)學方面具有極為重要的意義，這不僅表現(xiàn)在理論研究方面，更重要的是其在應用開發(fā)方面的實用價值。1. 克隆技術能快速培育出大量的優(yōu)良品種家畜，而用傳統(tǒng)的有性生殖方式培育動物良種不但需要花費很長的時間，而且優(yōu)良性狀難以在后代得到控制?？寺游镌谛竽翗I(yè)和醫(yī)學方面的意義表達在：2. 克隆動物的遺傳背景完全一致，因而可以防止動物實驗的背景干擾，如用在藥物檢測上，所得結果將更加穩(wěn)定可靠。3. 動物克隆技術可以用來保護瀕危動物，用瀕危動物的冷凍細胞隨時可以克隆出新的成體動物，而無須消耗大量的人力物力?？寺游锟蔀樾枰M織器官移植的病人提供所需要的組織器官。 國外已經(jīng)開始了這方面的研究，例如科羅拉多大學的研究者用來源于克隆牛胎兒的多巴胺生成細胞治療帕金森氏病模型大鼠，已取得一定效果。治療性克隆示意圖5、動物克隆技術 如果與 轉基因