流式細(xì)胞儀原理及應(yīng)用PPT通用通用課件

1、致：流式細(xì)胞術(shù)概述流式細(xì)胞術(shù)的基本概念流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, 簡(jiǎn)稱(chēng)FCM）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀(guān)，并且能夠同時(shí)檢測(cè)快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性，并加以定量的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍 細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量 細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線(xiàn)粒體膜電位 流式細(xì)胞儀的

2、原理液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細(xì)胞依次高速通過(guò)流動(dòng)池，而激光聚焦于流動(dòng)池中心的樣本流上，隨后經(jīng)檢測(cè)的樣本和鞘液流向廢液桶。光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細(xì)胞在激光的照射下產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)，同時(shí)被前向光電二極管和一組光電倍增管（PMT）接收，熒光信號(hào)經(jīng)一系列雙色性反射鏡和帶通或長(zhǎng)通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)電子系統(tǒng)：熒光信號(hào)和散射光信號(hào)經(jīng)二極管和PMT接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過(guò)模/數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，以圖形的形式呈現(xiàn)給操作者散射光信號(hào)FALS SensorLaser散射光信號(hào)Right Angle Light Detector Cell ComplexityS

3、SCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident Light Source前向角散射光（FSC, Forward Scatter）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對(duì)復(fù)雜性外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）GranulocytesMonocytesLymphocytes流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)熒光信號(hào)使用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量熒光信號(hào)雙色直接染色數(shù)據(jù)存儲(chǔ)FCS 2.0格式常以列表模式（LIST MODE)：將

4、每個(gè)細(xì)胞的每個(gè)檢測(cè)參量依次排列順序存儲(chǔ)FITC/PE雙染樣本數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）二維點(diǎn)圖（Dot Plot）等高線(xiàn)圖（Contour Plot）密度圖（Density）三維圖（3D Plot）等單參數(shù)直方圖分析數(shù)據(jù)分析直方圖分析多參數(shù)散點(diǎn)圖分析數(shù)據(jù)分析等高圖和密度圖分析數(shù)據(jù)分析三維圖分析流式細(xì)胞儀的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用HIV免疫分型，CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞亞群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞計(jì)數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用免疫功能研究血小板分析（心腦血管疾?。┘?xì)胞周期

5、和倍體分析細(xì)胞凋亡干細(xì)胞研究樹(shù)突細(xì)胞研究腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究抗腫瘤藥物作用機(jī)制以及多藥耐藥性的研究放療/化療療效的研究淋巴細(xì)胞亞群分析使用經(jīng)熒光素標(biāo)記的特異單克隆抗體，進(jìn)行多色染色，同時(shí)分析淋巴細(xì)胞膜上多種白細(xì)胞分化抗原（CD分子）的表達(dá)，可以將淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開(kāi)，進(jìn)行定性分析各淋巴細(xì)胞亞群的百分含量淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)，進(jìn)行定量分析淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為B淋巴細(xì)胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細(xì)胞（CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān)總T和總B可以用來(lái)判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK細(xì)胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能， 能夠介導(dǎo)對(duì)某些腫瘤細(xì)胞和病毒感

6、染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。淋巴細(xì)胞亞群分析根據(jù)CD4、CD8表達(dá)，T淋巴細(xì)胞又分為T(mén)輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+）T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+）Th/Ts 評(píng)價(jià)那些自身免疫失調(diào)、被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)診斷原發(fā)性免疫缺陷病（如先天性無(wú) r 球蛋白血癥）或繼發(fā)性免疫缺陷?。ㄈ鏏IDS）造血干細(xì)胞移植后免疫重建（6個(gè)月NK；9個(gè)月T、B）Th/Ts：機(jī)體免疫功能亢進(jìn)：自身免疫性疾病，如SLE、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等（治療有效恢復(fù)正常）Th/Ts：機(jī)體免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活動(dòng)性肝炎和活動(dòng)性肝硬化、再障、結(jié)核、腫瘤等移植后動(dòng)態(tài)免疫監(jiān)測(cè)：急排臨床癥狀出現(xiàn)前

7、1-5天，活化T和Th/Ts持續(xù)，1.2預(yù)示急排；Th/Ts持續(xù)表明可能感染，比值1.08，可能性大，0.2應(yīng)停用免疫抑制劑；實(shí)體腫瘤療效和病人免疫狀態(tài)觀(guān)察治療前常伴T(mén) 、Th/Ts，放/化療有效可恢復(fù)；淋巴細(xì)胞免疫表型正?；蛑委熀竽芑謴?fù)正常者預(yù)后常較好；探索疾病發(fā)病機(jī)理、進(jìn)程和預(yù)后（炎癥、腫瘤）臨床意義判斷病人的機(jī)體免疫狀態(tài)常見(jiàn)疾病的T 淋巴細(xì)胞的變化： CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 （活動(dòng)期） 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 - 或 （活動(dòng)期） 多發(fā)性硬化癥 重癥肌無(wú)力 膜型腎小球腎炎 胰島素依賴(lài)性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性貧血 上呼吸道感染 常見(jiàn)疾病的T 淋巴細(xì)胞的變化 CD

8、3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 腫瘤 再障及粒細(xì)胞減少癥 巨細(xì)胞病毒感染 血小板減少 活動(dòng)性特應(yīng)性皮炎 過(guò)敏性皮炎 淋巴細(xì)胞亞群雙色分析12%76%49%26%11%AIDS 病人T亞群分析27-51%15-44%50-84%先天性無(wú) r 球蛋白血癥5-18%乳腺癌患者T淋巴細(xì)胞亞群變化TriTEST/MultiTest與T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)使用三色試劑或四色免洗試劑樣本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL免洗操作，減少細(xì)胞丟失絕對(duì)計(jì)數(shù)TruCOUNT管預(yù)先加有已知數(shù)量微球，在流式細(xì)胞儀上直接得到T淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)含量，提高工作效率和計(jì)數(shù)的精確度單平臺(tái)計(jì)數(shù)報(bào)告T淋巴細(xì)胞及TH、T

9、S百分含量、絕對(duì)含量和H/S比值TriTEST CD4/CD8/CD3分析與T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)%T LymphCD3+ Abs CntCD3+CD4+ %T LymphCD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+ %T LymphCD3+CD8+ Abs CntT H/S RatioMultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19淋巴細(xì)胞活化功能研究T淋巴細(xì)胞活化細(xì)胞數(shù)目增殖細(xì)胞表面表達(dá)活化標(biāo)記分泌細(xì)胞因子CFSE示蹤原理羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，CFSE進(jìn)入細(xì)胞后可以不可逆地與

10、細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFsE標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半。這樣，在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中，各連續(xù)代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈對(duì)遞減，利用流式細(xì)胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測(cè)通道可對(duì)其進(jìn)行分析。 體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均可以應(yīng)用Dilution of CFSE with cell divisionLyons and Parish, 1994JIM, 171;131Divisions:3 2 1 0CFSEFL-1 (Log)Divisions: 3 2 1 0葡萄球菌腸毒素刺激牛時(shí)間變化示意圖，T淋巴細(xì)胞活化細(xì)胞數(shù)目增殖細(xì)胞表面表達(dá)活化標(biāo)記分泌細(xì)胞

11、因子T細(xì)胞激活抗原表達(dá)的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)FastImmune Assay System快速全面檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能 BD FastImmune Activation System快速免疫活化檢測(cè)系統(tǒng)lymphocyte Activation 4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulus優(yōu)點(diǎn)快速全程單核細(xì)胞成熟粒細(xì)胞原幼細(xì)胞，在紅細(xì)胞中不表達(dá)；SSC是側(cè)向角參數(shù)，反應(yīng)細(xì)胞的顆粒度（成熟粒細(xì)胞單核細(xì)胞原幼細(xì)胞淋巴細(xì)胞）。目前，國(guó)際上采用CD45SSC設(shè)門(mén)（Gating），可非常輕松地將白血病細(xì)胞與正常細(xì)胞分開(kāi)，增加白血病免疫分型的準(zhǔn)確性CD45

12、的臨床應(yīng)用用CD45-SSC設(shè)門(mén)尋找異常細(xì)胞，將細(xì)胞分為5個(gè)群體，當(dāng)幼稚細(xì)胞達(dá)70-80%時(shí)，即可大致估計(jì)AL的類(lèi)型。骨髓成分復(fù)雜，各種大小和分化程度的細(xì)胞均有，若不用CD45-SSC設(shè)門(mén)，我們檢測(cè)到的陽(yáng)性細(xì)胞的百分率是以總細(xì)胞為分母來(lái)計(jì)算，當(dāng)時(shí)以陽(yáng)性細(xì)胞大于20%為界線(xiàn)，現(xiàn)在以CD45-SSC設(shè)門(mén)，排除了正常細(xì)胞的干擾，陽(yáng)性細(xì)胞的百分率是以幼稚細(xì)胞為分母，因此再以陽(yáng)性細(xì)胞20%作界線(xiàn)則不太合適了，所以，用CD45-SSC設(shè)門(mén)尋找異常細(xì)胞時(shí)，以定性比定量更重要。正常人血液白細(xì)胞免疫表型散點(diǎn)圖正常人血液細(xì)胞免疫表型T淋巴細(xì)胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+

13、，部分細(xì)胞CD（16+56）+，無(wú)CD4+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞B淋巴細(xì)胞：CD45+、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK細(xì)胞：CD45+ 、CD（16+56）+/CD3-單核細(xì)胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中性粒細(xì)胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表達(dá)更高嗜酸性粒細(xì)胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表達(dá)更高正常人骨髓有核細(xì)胞免疫表型散點(diǎn)圖正常人骨髓細(xì)胞免疫表型淋巴細(xì)胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD5+/

14、CD7+（T淋巴細(xì)胞）；CD10-/CD19（B淋巴細(xì)胞）單核細(xì)胞:CD45+,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA-粒系細(xì)胞:原粒細(xì)胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+早幼粒細(xì)胞及其以下各階段中性粒細(xì)胞：CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，與原粒細(xì)胞或更幼稚細(xì)胞的表型有明顯差異巨核細(xì)胞：CD45+、CD41+/CD61+幼紅細(xì)胞：CD45-、CD36+/GlyA+T-ALL免疫表型B-ALL免疫表型 HLA-DR CD19 CD1

15、0 CD20 CD22 CD79a 其它 早期前B-ALL + + - - C+/M- + 34/38+ 普通型ALL + + + - C-/M + 34/38 前B-ALL + + + + B-ALL + + - + + + Kappa+/ Lambda+ *CD10+的ALL療效好，有CD34+病人往往合并t(9,22),需強(qiáng)化治療 成熟AML免疫表型急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）骨髓細(xì)胞免疫分型散點(diǎn)圖急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋML-M3）骨髓細(xì)胞免疫分型散點(diǎn)圖FCM在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用能正確區(qū)別AML和ALL，并能進(jìn)一步區(qū)別ALL中的T系和B系及亞型能正確鑒別AML中難于鑒別的M0、M

16、6、M7診斷雙系或雙表型白血病發(fā)現(xiàn)僅表達(dá)個(gè)別次要非本系列相關(guān)抗原的白血病診斷少見(jiàn)疑難白血病（如HCL）免疫分型 對(duì)下列情況具有重要意義 用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來(lái)源的白血病。形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）或急性未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記?；旌闲园籽?。部分髓系白血病。目前，免疫分型對(duì)粒-單核細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。慢性淋巴細(xì)胞白血病。微小殘留白血病。陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH陣發(fā)性血紅蛋白尿是由于紅細(xì)胞膜的獲得性缺陷，對(duì)激活補(bǔ)體異常敏感的一種慢性血管內(nèi)溶血患者體內(nèi)紅細(xì)胞呈不均一性利用流式細(xì)胞術(shù)和CD55和CD59單克隆抗體，對(duì)PNH患者紅

17、細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板進(jìn)行分析，證實(shí)存在膜蛋白表達(dá)缺陷的血細(xì)胞，并計(jì)算缺陷細(xì)胞在全血中所占比例陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH正常人紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板CD59表達(dá)完全陽(yáng)性PNH患者血細(xì)胞分為三型：型：CD59表達(dá)完全陽(yáng)性，熒光強(qiáng)度與正常人陽(yáng)性峰熒光強(qiáng)度接近型：CD59表達(dá)部分陽(yáng)性，熒光強(qiáng)度介于型與型之間 型：CD59表達(dá)完全陰性分析PNH患者各型細(xì)胞所占百分比，評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度紅細(xì)胞 PNH分析 A 正常人B D 病人網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)Retic-COUNT操作快速、簡(jiǎn)便計(jì)數(shù)精確低水平網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)IRF臨床應(yīng)用：預(yù)測(cè)骨髓移植效果判斷貧血發(fā)病原因評(píng)價(jià)生物制劑的療效網(wǎng)織血小板的檢測(cè)人們最

18、先于1969年指出網(wǎng)織血小板是一類(lèi)能被新亞甲藍(lán)深染的血小板。如網(wǎng)織紅細(xì)胞一樣它們是代表了新生的血小板。以后的二十年中，人們發(fā)現(xiàn)網(wǎng)織血小板為骨髓新釋放的未成熟成分，含有大量的RNA，因此，外周血中網(wǎng)織血小板的多少，可以間接反映骨髓巨核系造血的活躍程度。并能用常規(guī)的檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞的噻唑橙（TO）等核酸染料染色。在流式細(xì)胞儀上方便、準(zhǔn)確地檢測(cè)。臨床應(yīng)用正常人網(wǎng)織紅細(xì)胞1.07% 缺鐵性貧血（IDA )4.78%臨床應(yīng)用再障（AA)0.03% 溶血性貧血（HA)29.33%造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)造血干細(xì)胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血細(xì)胞。造血干細(xì)胞的特征是：大?。‵SC）和顆粒度（SSC）介于成熟

19、淋巴細(xì)胞、大淋巴細(xì)胞相似細(xì)胞內(nèi)含有較多核酸物質(zhì) CD34表達(dá)弱陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性 CD45表達(dá)弱陽(yáng)性在干細(xì)胞移植時(shí)需要做造血干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)干細(xì)胞移植應(yīng)用血液系統(tǒng)病癥: L&L , 再生障礙想貧血惡性腫瘤:乳腺癌、兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌遺傳性異常病變免疫缺陷:血紅蛋白病血小板檢測(cè)血小板膜糖蛋白復(fù)合物診斷血小板缺陷性疾病CD41-CD61復(fù)合物：血小板無(wú)力癥CD42a-CD42b 復(fù)合物：巨大血小板癥血小板活化的相關(guān)檢查血小板顆粒膜糖蛋白，如CD62，CD63血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1血小板減少性疾病血小板自身抗體檢測(cè)網(wǎng)織血小板的檢測(cè)血小板脫落微粒的檢測(cè)血小板活化IIb/III

20、a復(fù)合物（CD41/CD61）在所有靜止和活化的血小板上都有表達(dá)血小板活化時(shí)發(fā)生的改變IIb/IIIa復(fù)合物發(fā)生變構(gòu)，表達(dá)PAC-1血小板內(nèi)顆粒釋放，分泌促進(jìn)凝血反應(yīng)的物質(zhì)，這時(shí)表達(dá)CD62PCD61圈血小板門(mén)PAC-1/1：陰性對(duì)照，靜止的血小板PAC-1/CD62P：試驗(yàn)管，ADP刺激下活化的血小板，報(bào)告血小板活化百分含量血小板活化血小板活化直接測(cè)量循環(huán)血小板活化狀態(tài)與反應(yīng)性可直接測(cè)定凝血酶等誘導(dǎo)劑活化的血小板血小板活化與臨床的關(guān)系：監(jiān)測(cè)血小板活化相關(guān)疾病過(guò)程，抗血小板藥物療效或治療藥物的影響，預(yù)測(cè)血栓形成心肌缺血（心絞痛、心肌梗塞）與血小板活化有關(guān)預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后發(fā)生急性缺血事件的危

21、險(xiǎn)性缺血性腦血管病與血小板活化有關(guān)子癇前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加抗血小板治療療效監(jiān)測(cè)腦栓塞病人血小板活化檢測(cè)A CD61-SSC設(shè)分析門(mén)B 陰性對(duì)照C 治療前 PAC-I 27.74%CD62P 15.86%D 溶栓后 PAC-I 9.13%CD62P 4.12% 血小板無(wú)力癥（CD41缺陷，PAC-I下調(diào)）巨血小板癥藍(lán)陰性對(duì)照綠正常人紅病人CD41表達(dá)上調(diào)CD42a/CD42b缺失血小板自身抗體 ITP病人DNA細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期G2MG0G1s0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細(xì)胞數(shù)量2N4NDNA細(xì)胞周期分析參數(shù)DNA倍體性Plo

22、idy 細(xì)胞內(nèi)染色體DNA含量二倍體Diploid 正常體細(xì)胞內(nèi)染色體DNA含量DNA指數(shù)（DI） 測(cè)定標(biāo)本的G0/G1期細(xì)胞DNA含量 與同種系正常細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞 DNA含量的比值，表示細(xì)胞倍體性S期含量SPF S期細(xì)胞占總周期細(xì)胞的比例增殖指數(shù)PI 增殖細(xì)胞占總周期細(xì)胞的比例CV G0/G1期細(xì)胞DNA含量變異系數(shù)DNA分析的臨床意義DNA分析診斷腫瘤DNA非整倍體細(xì)胞峰或突出的四倍體細(xì)胞峰S期細(xì)胞含量10-15% DNA倍體分析：結(jié)合臨床病理的形態(tài)學(xué)診斷，對(duì)一些惡性腫瘤進(jìn)行早期診斷，跟蹤隨訪(fǎng)和早期治療，提高治愈率和生存率。尤其對(duì)一些細(xì)胞抽吸物、體液、組織液、灌洗液脫落細(xì)胞的分析，

23、意義尤為重要。研究各期細(xì)胞比率與腫瘤組織分級(jí)的關(guān)系。提示腫瘤患者預(yù)后。增殖狀態(tài)分析：反映了腫瘤的生長(zhǎng)速度和侵襲性，判斷臨床治療方法的療效或用于探討新藥新方法的作用機(jī)理和療效。FCM在腫瘤早期診斷和鑒別診斷中的作用DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個(gè)重要標(biāo)志在淋巴瘤（L&L）病理形態(tài)學(xué)不能做出診斷前可提供確切診斷信息DNA非整倍體的交界瘤應(yīng)按惡性對(duì)待形態(tài)學(xué)表現(xiàn)良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示惡變可能DNA指數(shù)可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標(biāo)FCM參數(shù)的預(yù)后意義DNA及倍體分析在某些腫瘤有預(yù)后價(jià)值：膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、皮膚黑色素瘤S期比率與腫瘤組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)：

24、肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直腸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、腦型星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡PI分析PI - Fluorescence# Events凋亡細(xì)胞正常G0/G1期細(xì)胞正常DNA倍體分析0 200 400 600 8001000PI Fluorescence2N4N1280 200 400 600 8001000PI FluorescenceAneuploid peakDNA index 1.21DNA異倍體129秋水仙素處理羅田甜柿獲得12 倍體再生植株正常人骨髓細(xì)胞DNA周期分析（ModFIT）腫瘤細(xì)胞SPF(S期含量)腫瘤細(xì)胞(單克隆)(14.18%)正常骨髓細(xì)胞(2.93%)腫瘤細(xì)

25、胞(多克隆)(28.52%)132乳腺癌及乳腺良性病變的流式檢測(cè)對(duì)比分析細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的分析細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死是兩個(gè)不同的過(guò)程細(xì)胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學(xué)檢查DNA Ladders實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢查與凋亡相關(guān)的病理過(guò)程（HIV、自身免疫性疾病、腫瘤）研究凋亡調(diào)控因素如癌基因、細(xì)胞因子及藥物等對(duì)凋亡的影響凋亡檢測(cè)-每一步都有檢測(cè)試劑盒細(xì)胞凋亡檢測(cè)凋亡相關(guān)細(xì)胞膜變化的檢測(cè)凋亡相關(guān)線(xiàn)粒體變化的檢測(cè)凋亡相關(guān)酶活性的檢測(cè)凋亡相關(guān)DNA片段的檢測(cè)凋亡相關(guān)基因蛋白的檢測(cè)細(xì)胞膜變化的檢測(cè)早期凋亡磷脂酰絲氨酸（PS）外翻，DNA不斷裂線(xiàn)粒體膜電位變化的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測(cè)細(xì)胞膜變化的檢測(cè)磷脂酰絲氨

26、酸（PS）的檢測(cè)早期凋亡早期凋亡PS檢測(cè)及結(jié)果判斷早期凋亡特征磷脂膜（PS）外翻，但是細(xì)胞膜保持完整性，因此PI染色為陰性DNA沒(méi)有發(fā)生斷裂 結(jié)果判定早期凋亡：AnnexinV+/PI-死亡或者晚期凋亡： AnnexinV+/PI+正常的活細(xì)胞： AnnexinV-/PI-ANNEXIN-V/PI檢測(cè)ANNEXIN-V/PI檢測(cè)control處理16h后處理24h后142線(xiàn)粒體水平檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)品線(xiàn)粒體膜電位的檢測(cè)BD Mitoscreen（JC-1）Cat# 551302 25tests原理：熒光染料JC-1在活細(xì)胞中以聚體形式存在于線(xiàn)粒體基質(zhì)上產(chǎn)生紅色熒光，在凋亡細(xì)胞中，以單體形式存在不與線(xiàn)粒

27、體結(jié)合而產(chǎn)生綠色熒光。操作簡(jiǎn)單，試劑直接加入細(xì)胞中，20分鐘后檢測(cè)JC-1 檢測(cè)結(jié)果流式圖凋亡相關(guān)酶活性的檢測(cè)背景知識(shí)細(xì)胞凋亡過(guò)程中，胞內(nèi)主要蛋白通常被降解，調(diào)節(jié)這一過(guò)程的蛋白叫Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）Caspase 3是參與DNA維護(hù)和調(diào)控細(xì)胞的組分裂解 Caspase 3激活=細(xì)胞凋亡檢測(cè)原理：是通過(guò)特異性抗體檢測(cè)全長(zhǎng)或者剪切后的caspase活性。CBA分析凋亡信號(hào)通路 YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYDETECTORANTIBODYLYSATE ORSUPERNATANTBEADSYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY

28、YYYYYYYYYYYYYYYYWashRead on Flow CytometerActive Caspase-3Bcl-2Cleaved PARP一系列熒光強(qiáng)度不同的微球包被有特異性捕獲抗體，與待測(cè)樣本和檢測(cè)抗體孵育后，形成“三明治”復(fù)合物Active Caspase-3Bcl-2Cleaved PARPBcl-2、Caspase-3、PARP構(gòu)成的凋亡調(diào)控通道主要蛋白，對(duì)于凋亡研究具有特殊的意義(CBA Human apoptosis kit 557816)流式檢測(cè)活性Caspase-3相關(guān)產(chǎn)品：Active Caspase-3 Apoptosis kit（550914），包含了 固定破

29、膜液，洗滌液和PE標(biāo)記抗體； 特點(diǎn)：細(xì)胞需要固定破膜，然后才能染色化療前后胃癌活檢標(biāo)本中Caspase-3+細(xì)胞化療前(3.49%)化療后(94.86%)149DNA水平的凋亡檢測(cè)-晚期檢測(cè)凋亡晚期DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段檢測(cè)方法Tunel流式法，通過(guò)在核酸片段末端標(biāo)記，跟傳統(tǒng)相比優(yōu)點(diǎn)在于可以計(jì)算凋亡百分比DNA Ladder分析，但凋亡細(xì)胞太少時(shí)作不到TUNEL簡(jiǎn)介通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP （多為dUTP）接到DNA片段的3-OH端，再通過(guò)熒光檢測(cè)定量分析結(jié)果。TUNEL（Terminal deoxynucleoti

30、dyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）DNA斷裂點(diǎn)檢測(cè)152TUNEL法流式分析凋亡結(jié)果BrdU-FITC/PI檢測(cè)S期154凋亡檢測(cè)總結(jié)檢測(cè)水平 細(xì)胞 核酸 細(xì)胞膜 胞內(nèi)通路 線(xiàn)粒體 檢測(cè)方法 免疫熒光 TUNEL法 Annexin V/PI Caspase通路 線(xiàn)粒體染料 微生物 微生物細(xì)菌的計(jì)數(shù)檢測(cè)與鑒定（CBA)血清血診斷(CBA)抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞活力檢測(cè)（細(xì)菌活力）圖 流式細(xì)胞術(shù)分析GFP轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)量調(diào)節(jié)性T細(xì)胞研究進(jìn)展免疫耐受機(jī)制以往研究認(rèn)為：（“被動(dòng)”方式）胸腺細(xì)胞及前B（pre-B）細(xì)胞在中樞免疫器官中的克隆清除

31、 進(jìn)入外周的成熟淋巴細(xì)胞表達(dá)針對(duì)自身抗原的識(shí)別受體被誘導(dǎo)進(jìn)入免疫無(wú)能狀態(tài)而不表現(xiàn)任何自身反應(yīng)性 部分淋巴細(xì)胞對(duì)自身抗原的免疫忽視 免疫耐受機(jī)制近年研究表明 ： （“主動(dòng)”方式）調(diào)節(jié)性T（Tr）細(xì)胞以“主動(dòng)”的方式維持自身免疫耐受 這一發(fā)現(xiàn)將改變我們對(duì)自身免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并將對(duì)免疫學(xué)基本理論的發(fā)展產(chǎn)生重大影響。 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志 FOXP3（Forkhead box protein P3）是一個(gè)50kD的轉(zhuǎn)錄因子，也稱(chēng)為Scurfin、JM2、IPEX。它是一個(gè)主要調(diào)節(jié)基因 。CD4+/CD25-細(xì)胞上FOXP3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可以誘導(dǎo)GITR、CD103和CTLA4的表達(dá)，并且

32、促使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型形成。 FOXP3在X連鎖自身免疫過(guò)敏失調(diào)綜合征（XLAAD或IPEX）患者中發(fā)生突變。 FOXP3過(guò)度表達(dá)會(huì)引起機(jī)體的免疫應(yīng)答下降，表明它是一個(gè)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的主要轉(zhuǎn)錄因子。FOXP3表達(dá)于細(xì)胞內(nèi) 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分類(lèi)根據(jù)來(lái)源、特異性及效應(yīng)機(jī)制可分為天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和獲得性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞天然性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：在正常人和小鼠的外周血及脾臟組織的CD4+T細(xì)胞中約有510的細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)CD25分子，該群細(xì)胞從胸腺中發(fā)育，組成性表達(dá)foxp3，在體內(nèi)外發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能獲得性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：是由外周T細(xì)胞在特定的條件下分化出來(lái)，通過(guò)分泌高水平的IL-10和 TGF-而發(fā)揮其抑制功能.Re

33、gulatory T Cells Background:its DevelopmentThymusPeripheryT cell precursorTr1Th3FoxP3-?iDC and/or in thePresence of IL-10And/or TGFbConventional T cellNave T cellNaturally occurring Treg cellAdaptive Treg cellCD25GITRCTLA-4FoxP3+CD4CD127CD25GITRCTLA-4FoxP3+CD4CD127FoxP3-人Tr細(xì)胞表達(dá)特征：CD127+CD127是非二聚體IL-7受體CD127表達(dá)于胸腺細(xì)胞，T、B祖細(xì)胞，成熟T細(xì)胞，單核細(xì)胞及其它淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞T細(xì)胞活化后CD127表達(dá)下調(diào)CD127表達(dá)下調(diào)發(fā)生在Tr細(xì)胞CD127下調(diào)同時(shí)CD25高表達(dá)、FoxP3+為T(mén)r細(xì)胞CD127優(yōu)于傳統(tǒng)的FoxP3+保證了細(xì)胞的活性從Human PBMCs中分離Tr細(xì)胞FoxP3染色確認(rèn)Tr細(xì)胞FoxP3染色確認(rèn)Tr細(xì)胞小結(jié)CD127弱表達(dá)FoxP3+CD127loCD25hi-intCD127和FoxP3聯(lián)合應(yīng)用于Tr細(xì)胞的功能性研究（體內(nèi)體外）樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）