20第20章自動化儀器分析ppt課件

1、第二十章 免疫檢驗自動化儀器分析第一節(jié) 自動化免疫濁度分析系統(tǒng) 一、免疫透射比濁法 二、免疫膠乳比濁法 三、免疫散射比濁法 四、免疫比濁分析的影響要素和臨床運用.第四節(jié) 自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)第二節(jié) 自動化發(fā)光免疫分析系統(tǒng) 一、吖啶酯標志化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀 三、 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 四、在臨床免疫檢測中的運用第三節(jié) 自動化熒光免疫分析系統(tǒng) 一、時間分辨熒光免疫分析儀 二、熒光偏振免疫分析儀思索題小結(jié). 免疫檢驗自動化 automation of immunoassays) 是將免疫學(xué)反響檢測過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分別、信號檢測、數(shù)據(jù)處置、打印報告和

2、檢測后的儀器清洗等步驟由計算機控制，自動化進展。.第一節(jié) 自動化免疫濁度分析系統(tǒng) 免疫濁度分析的根本原理是：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反響，構(gòu)成小分子免疫復(fù)合物19S，使反響液出現(xiàn)濁度。在抗體略微過量且固定的情況下，構(gòu)成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的添加而添加，反響液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反響溶液的濁度呈正相關(guān)。 .一定波長的入射光線經(jīng)過抗原抗體反響后的溶液時，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收、反射和折射而減弱，在一定范圍內(nèi)，吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)，而構(gòu)成的免疫復(fù)合物量與參與反響的抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。與知濃度的抗原規(guī)范品比較，可確定標本中抗原含量。一、免疫透射比濁法一原理：. 1

3、.將待檢標本和抗原參考品作適當稀釋。二儀器任務(wù)過程 2.將待測標本和規(guī)范抗原溶液5個濃度抗原規(guī)范品與適當過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反響完成后，在340nm處測定各管吸光度。 3.按log-logit轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進展曲線擬合，制備劑量-反響曲線，由計算機處置，計算出抗原濃度。.三方法評價 優(yōu)點: 靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結(jié)果準確 缺乏: 抗體用量較大； 溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大 透射比濁測定在抗原抗體反響的第二階段，檢 測需在抗原抗體反響到達平衡后進展，耗時較長。 .用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒普通為0.2 m，在遇到相應(yīng)抗

4、原時，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合，引起膠乳顆粒凝聚 ，使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。如下圖：a為單個膠乳顆粒不妨礙光線透過，b為抗原抗體結(jié)合構(gòu)成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光加強。 二、免疫膠乳比濁法一原理：.二方法評價 本法敏感度大大高于普通比濁法，可達ng/L程度，操作簡便，易自動化；血清中的類風(fēng)濕因子(RF)可與IgG Fc段結(jié)合，使IgG致敏膠乳顆粒出現(xiàn)非特異性凝集，用F(ab)2片段替代IgG既可消除此干擾，又可抑制IgG致敏膠乳的自凝景象；免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會嚴重影響結(jié)果。. 粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子遭到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而構(gòu)

5、成散射光。懸浮微粒對光散射構(gòu)成的散射光強度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強度、丈量角度等要素親密相關(guān)，其公式如下：三、免疫散射比濁法(一) 原理. 式I 中為與入射光成角處散射光強度；和I0為入射光的波長和強度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；為顆粒到檢測器的間隔；為散射光與入射光的夾角散射夾角。II042dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24.定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，參與待測抗原，此時反響立刻開場，在反響的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號動搖較大，所獲取的信號計算出的結(jié)果會產(chǎn)生一定的誤差。定時散射

6、比濁法是避開抗原抗體反響的不穩(wěn)定階段，即散射光信號在開場反響7.5s2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反響的最正確時段進展讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。 (二)定時散射比濁法fixed time nephelometry.1. 儀器測定技術(shù)要點 (1) 抗原抗體預(yù)反響階段 (2) 反響階段(3) 信號檢測 .2. 抗原過量檢測 (1) 抗體適當過量 (2) 對抗原過量進展閾值限定 .定時散射比濁法測定原理表示圖 .BN ProSpec全自動特定蛋白分析儀.速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反響的動力學(xué)測定法。所謂速率是指抗原抗體反響在單位時間內(nèi)構(gòu)成免疫復(fù)合物的量不是免疫復(fù)合物累積的量，延續(xù)測定各時間

7、復(fù)合物構(gòu)成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)絡(luò)在一同，構(gòu)成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅12min即可完成。 (三)速率散射比濁法rate nephelometry.儀器測定技術(shù)要點 開啟機器，進展定標 反響階段 抗原過量檢測 .抗原抗體復(fù)合物構(gòu)成的速率累計時間s構(gòu)成IC總量速率累計時間s構(gòu)成IC總量速率 5 810 13 515 251220 603525 1509030 2308035 300 7040 360 6045 415 5550 450 4555 480 3060 500 20.抗原抗體反響速率的動態(tài)變化.IMMAGE全自動特定蛋白分析儀.(三)方法評價 散射比濁法是目前臨床運用較多

8、的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準確、精細等優(yōu)點。采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準確性。但儀器和試劑價錢比較貴, 對抗體的質(zhì)量要求很高。.1.抗原抗體比例 2.抗體的質(zhì)量 3.增濁劑的運用 一免疫比濁分析的影響要素 四、免疫比濁分析的影響要素和臨床運用. 4.偽濁度 5.入射光光源和波長 6.結(jié)果報告中的計量單位 7.規(guī)范曲線制備與質(zhì)量控制 .二臨床運用 免疫比濁分析法主要用于檢測免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、鏈、鏈、免疫球蛋白亞類；補體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、銅

9、藍蛋白(CER)、結(jié)合珠蛋白(HP)、，C-反響蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風(fēng)濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。 .第二節(jié)自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)自動化發(fā)光免疫分析儀主要由樣本盤、試劑盤(盒)、溫育反響系統(tǒng)、固相載體分別清洗系統(tǒng)、信號檢測系統(tǒng)和計算機數(shù)據(jù)處置、控制系統(tǒng)組成。 .吖啶酯標志的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標志抗體或抗原的一類免疫分析法。該儀器利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分別技術(shù)，以吖啶酯為化學(xué)發(fā)光劑，以細小的順磁性微粒為固相載體。其測定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競爭結(jié)合法等一樣。 一、吖啶酯標志化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

10、.YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY順磁性微粒表示圖 磁微粒技術(shù) 磁微粒在電磁場中分別磁微粒標志抗體.發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標志物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后雙抗體夾心法直接化學(xué)發(fā)光的機理1參與酸性H2O2pH10.儀器測定技術(shù)要點 抗原抗體結(jié)合 洗滌、分別 參與氧化劑發(fā)光 信號檢測 . 吖啶酯標志化學(xué)發(fā)光免疫測定表示圖 .ACS：180 SE和ACSCENTAUR化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ACS：180 SEACSCENTAUR.ci8200i2000sr. 酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反響的酶來標志抗原或抗體，在抗原抗體

11、反響后，參與底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，經(jīng)過光信號的強弱來進展被測物的定量。 常用的標志酶有辣根過氧化物酶HRP和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等。 二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀.該儀器采用辣根過氧化物酶HRP標志抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑，還利用加強劑使化學(xué)發(fā)光強度添加、時間延伸。辣根過氧化物酶標志的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀.魯米諾是一種復(fù)原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產(chǎn)生魯米諾衍生物激發(fā)態(tài)。它以光量子輻射方式前往基態(tài)時，發(fā)出微綠色可見光。.魯米諾加強化學(xué)發(fā)光的原理.辣根過氧化物酶標志的化學(xué)發(fā)光免疫測定表示圖 .Vitro

12、s ECi全自動加強化學(xué)發(fā)光酶免分析儀. 堿性磷酸酶標志的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 該儀器是以堿性磷酸酶標志抗原或抗體，以順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑進展測定的自動化儀器。.AMPPD發(fā)光反響原理表示圖 .抗原抗體結(jié)合 洗滌、分別 參與AMPPD發(fā)光劑 信號檢測 儀器測定技術(shù)要點 .堿性磷酸酶標志的化學(xué)發(fā)光免疫測定表示圖 .Access全自動酶標志化學(xué)發(fā)光免疫分析儀.UniCelDxI 800.IMMULITE 2000型全自動酶標志化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng).三堿性磷酸酶標志的微粒子熒光免疫分析儀 該儀器以堿性磷酸酶標志抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體或抗原，以4-甲基傘型

13、酮磷酸鹽4-MUP作為酶促反響的熒光基質(zhì)底物，底物被酶水解后，脫磷酸根基團，構(gòu)成4-甲基傘型酮(4-MU)，用360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm的熒光。 .4-甲基傘型酮磷酸鹽4-MUP反響原理表示圖 .儀器測定技術(shù)要點 抗原抗體結(jié)合 洗滌、分別 參與底物4-MUP 信號檢測 .堿性磷酸酶標志的微粒子熒光免疫測定表示圖.AXSYM全自動酶標志熒光免疫分析儀.AIA-1800型全自動酶標志熒光免疫分析儀. 電化學(xué)發(fā)光免疫分析ECLIA是一種在電極外表由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反響，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，生物素放大技術(shù)，以順磁性微粒為固相載體

14、，用三聯(lián)吡啶釕標志抗原或抗體，三丙胺(TPA)為電子供體，而設(shè)計的一種自動化分析儀器。電化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定、繼續(xù)時間長，易于控制并可根據(jù)待測分子的大小設(shè)計成多種反響方式如夾心法、競爭法等。 三、 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀.三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)3 2+分子構(gòu)造圖.電化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光的反響原理 .磁性微粒直徑2.8m，外表的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體積小，懸浮于反響體系中，構(gòu)成均一穩(wěn)定的液相，在磁場中易于分別。.儀器測定技術(shù)要點 抗原抗體結(jié)合 電化學(xué)發(fā)光反響 光信號檢測 檢測終了 .電化學(xué)發(fā)光免疫測定表示圖 .電化學(xué)發(fā)光免疫測定任務(wù)表示圖.標志磁顆粒在電場中發(fā)光任務(wù)表示圖.ELECSYS 2021型全

15、自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀.Modular Analytics E 模塊170型. 可用于內(nèi)分泌激素類、腫瘤標志物類、心肌標志物類、病毒標志物類、治療性藥物濃度、骨代謝目的和貧血類等方面的檢測，是目前免疫化學(xué)運用最為廣泛的新技術(shù)。 四、在臨床免疫檢測中的運用.第三節(jié) 自動化熒光免疫分析系統(tǒng) 熒光免疫自動化分析主要是將抗原抗體結(jié)合反響與熒光物質(zhì)發(fā)光分析和計算機技術(shù)有機結(jié)合的一項自動化免疫分析技術(shù)。根據(jù)抗原抗體反響后能否需求進展固相分別，分為均相和非均相兩類。非均相熒光免疫測定主要有時間分辨熒光免疫測定法；均相熒光免疫測定主要有熒光偏振免疫測定法。 . 時間分辨熒光免疫測定time resolved

16、 fluorescence immunoassay, TRFIA是以鑭系元素標志抗原或抗體作為示蹤物，并與時間分辨測定技術(shù)相結(jié)合，建立起來的一種新型非放射性微量分析技術(shù)，具有靈敏度高，鑭系元素發(fā)光穩(wěn)定，熒光壽命長，不受樣品自然熒光干擾，規(guī)范曲線范圍寬等特點，已在臨床實驗室廣泛運用。 一、時間分辨熒光免疫分析儀.Eu3+元素激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的stokes位移 一、原理.時間分辨Eu3+元素?zé)晒庑盘栒闪勘硎緢D .二儀器測定技術(shù)要點 抗原抗體結(jié)合 參與Eu3+螯合抗體 參與酸性加強液 4. 信號檢測 .固相雙抗體夾心TRFIA檢測過程表示圖 . 加強液(enhancement solution

17、)，使Eu3+抗體抗原復(fù)合物的PH值降低至23，以利于Eu3+從復(fù)合物上完全解離下來，游離的Eu3+為加強液中的另一種螯合劑所螯合，在協(xié)同劑等其它成分的作用下，與加強液中的-二酮體生成一個Eu3+在其內(nèi)部的維護性膠態(tài)分子團，這是一個新的具有高強度熒光的穩(wěn)定螯合物，它在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，信號的加強效果可達上萬倍，該技術(shù)運用了解離加強步驟，并且采用了前后兩種不同的螯合劑，前一種用于Eu3+與抗體標志，后一種用于與解離下來的Eu3+螯合成新的強熒光發(fā)射分子，因此，又將該技術(shù)稱為解離加強鑭系元素?zé)晒饷庖?dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmu

18、noassay, DELFIA) 三解離加強原理：.auto DELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng).1. TRFIA分析用的酸性加強液易受環(huán)境、試劑、容器等里面的鑭系元素污染，使本底升高，所用試劑和器材應(yīng)盡量防塵。 2.TRFIA分析用載體最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其熒光本底低，并有洗滌微孔板的自動安裝，但不同廠家消費的微孔板，所產(chǎn)生的熒光有很大差別，應(yīng)選擇運用。 四本卷須知.熒光偏振免疫測定(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)，為一種均相熒光免疫測定方法，其利用熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏振光照射后，可吸收光能而產(chǎn)生另一單一平面

19、的偏振發(fā)射熒光，該熒光強度與熒光 標志物質(zhì)在溶液中旋轉(zhuǎn)的速度與分子大小呈反比，常采用抗原-抗體競爭反響原理，適用于小分子半抗原如藥物濃度的檢測。 二、熒光偏振免疫分析儀.光的本質(zhì)是電滋波，光是各個方向電滋波的混合物，當光線經(jīng)過偏振濾光片后，構(gòu)成只需一個方向的電滋波，稱之為偏振光。熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振光藍色光，485nm激發(fā)后，可吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，在其恢復(fù)至基態(tài)時，釋放能量并發(fā)射出單一平面的偏振熒光綠色光，525nm550nm 。偏振熒光強度與熒光物質(zhì)分子在液相中轉(zhuǎn)動的速度呈反比，即分子大轉(zhuǎn)動速度慢，熒光強度大，分子小轉(zhuǎn)動速度快，熒光強度小。 (一) 原理.偏振光和偏振熒光發(fā)生表示圖熒光偏

20、振免疫測定任務(wù)原理表示圖.1. 抗原抗體反響 2.偏振熒光強度測定 二 儀器測定技術(shù)要點.1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標志的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的平均壽命、抗原的相對分子量和復(fù)合物的特性等要素。2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對標本進展預(yù)處置，除去干擾成分。 三本卷須知.第四節(jié) 自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng) 根據(jù)全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處置方式，人們通常將全自動酶免分析儀分成二類，一類為分體機，一類為連體機。分體機是由“前處置系統(tǒng)即全自動樣本處置任務(wù)站和“后處置系統(tǒng)即全自動酶免分析儀兩個獨立的部分組成。連體機是由多個模塊組成，運用一臺計算機、一套操作系統(tǒng)實現(xiàn)了從標本稀釋、加樣到酶標板孵育、洗

21、滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印全自動進展。.一儀器組成和性能1.條形碼識別系統(tǒng) 2.樣本架和加樣系統(tǒng) 3.試劑架 4.溫育系統(tǒng) .5.液路系統(tǒng) 6.洗板系統(tǒng) 7. 酶標板讀數(shù)儀 8.自動裝載傳送系統(tǒng) 9. 計算機管理和信息系統(tǒng) .全自動酶免分析儀中的連體機是將樣本處置任務(wù)站和全自動酶免分析儀結(jié)合起來，任務(wù)速度快，自動化程度高，適宜大批量樣本的處置，如血站系統(tǒng)。分體機，由于它有一個獨立的全自動樣本處置站，加樣速度快，適宜實驗工程變化多、樣本批量不等的臨床實驗室。 二儀器評價.采用流水線式操作.加樣.洗板.1. 什么是免疫檢驗自動化？運用哪些技術(shù)？優(yōu)點是什么？2. 免疫濁度分析的原理是什么？有哪些臨床運用？3. 免疫膠乳比濁法和免疫散射比濁法的原理是什么？4. 定時散射比濁法和速率散射比濁法的測定原理，其抗原過量檢測有什么不同點？5. 免疫比濁分析的影響要素有哪些？6. 吖啶酯標志的化學(xué)發(fā)光