第七章-基因工程菌的發(fā)酵ppt課件(全)

1、第七章 基因工程菌的發(fā)酵 第一節(jié) 基因工程發(fā)酵概述第二節(jié) 基因工程生化產(chǎn)品的分離純化【學習目標】知識目標：能夠陳述基因工程菌的培養(yǎng)方式及發(fā)酵設(shè)備 ；能夠掌握基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)品的分離純化原理及方法 ；能夠掌握基因工程菌生產(chǎn)菌種的保存及管理方法；能力目標：掌握基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)流程 ；掌握基因工程菌發(fā)酵過程中表達系統(tǒng)、培養(yǎng)基、溫度、pH值、溶解氧和誘導條件等因素對發(fā)酵的影響 。3第一節(jié) 基因工程發(fā)酵概述一、基因工程菌的培養(yǎng)方式二、基因工程菌的發(fā)酵設(shè)備三、基因工程菌的發(fā)酵工藝4基因工程（Genetic Engineering）：又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)。所謂基因工程是在分子水平上對基因進行操

2、作的復雜技術(shù)，是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內(nèi)，使這個基因能在受體細胞內(nèi)復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當?shù)墓ぞ呙高M行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠緣雜交的不親和障礙。5基因工程基本過程6一、基因工程菌的培養(yǎng)方式1.分批培養(yǎng)2.補料分批培養(yǎng)3.連續(xù)培養(yǎng)4.透析培養(yǎng)5.固定化培養(yǎng)1.分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)：將定量的微生物接種到封閉的具有定量培養(yǎng)基的容器中，保

3、持一定的溫度、pH、DO，微生物進行生長繁殖。分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限。2.補料分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)：在分批發(fā)酵過程中補充培養(yǎng)基，而不從發(fā)酵體系中排出發(fā)酵液，使發(fā)酵液的體積隨著發(fā)酵時間逐步增加。特點：能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度：一方面，它可以避免在某種營養(yǎng)成分的初始濃度過 高時影響細胞的生長代謝以及產(chǎn)物的形成；另一方面，它還能防止某些限制性營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響細胞的生長和產(chǎn)物的形成。3.連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)：是采用有效的措施讓微生物在某特定的環(huán)境中保持旺盛生長狀態(tài)的培養(yǎng)方法。不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。其中的微生物可長期保持在對數(shù)期的平衡生

4、長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。連續(xù)培養(yǎng)可提高發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效益和自動化水平，此法已成為目前發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展方向。連續(xù)培養(yǎng)如用于發(fā)酵工業(yè)中就稱為連續(xù)發(fā)酵(continuous fermentation）。連續(xù)發(fā)酵與分批發(fā)酵相比有許多優(yōu)點： 自控性，便于利用各種儀表進行自動控制； 高效，它使裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等工藝簡化了，縮短了生產(chǎn)時間和提高了設(shè)備的利用效率； 產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定； 節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽，使水、汽、電的負荷減少。但也存在不足之處： 主要是菌種易于退化，使微生物長期處于高速繁殖的條件下，即使自發(fā)突變率很低，也難以避免變異的發(fā)生； 容易污染，在連續(xù)發(fā)酵中，要保持各種設(shè)備無滲漏，

5、通氣系統(tǒng)不出現(xiàn)任何故障，是極其困難的。因此，“連續(xù)”是有時間限制的，一般可達數(shù)月至一年、兩年； 連續(xù)培養(yǎng)中，營養(yǎng)物的利用率低于分批培養(yǎng)。4.透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)：是對微生物培養(yǎng)用透析膜包裹，并使外部有新鮮培養(yǎng)液流動著的一種培養(yǎng)方法。特點：微生物可不斷地受到新營養(yǎng)的補給，同時也不斷地排出老朽廢物，因此可以延長對數(shù)期的增殖，增大靜止期的細胞數(shù)。通過外液的培養(yǎng)液成分的變化，可使微生物的營養(yǎng)環(huán)境慢慢發(fā)生改變，同時也可隔著膜培養(yǎng)兩種微生物，通過其產(chǎn)生物來了解它們的相互關(guān)系。5.固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)：是通過化學或物理方法，將游離細胞或酶固定于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可以反復利用。優(yōu)點：菌體密度高、反應(yīng)

6、速度快、發(fā)酵周期短、產(chǎn)物分離簡單、反應(yīng)過程控制容易、菌體可重復連續(xù)使用和增加發(fā)酵過程中重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的優(yōu)點。固定化：英文名immobilized; immobilization; 所謂固定化是指用物理或化學方法使酶成為不溶性衍生物或使細胞成為不易從載體上流失的形式制成生物反應(yīng)器用以催化生化反應(yīng)、細胞數(shù)量的增殖等。二、基因工程菌的發(fā)酵設(shè)備1.發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)2.發(fā)酵罐中的反應(yīng)和參數(shù)3.發(fā)酵罐控制系統(tǒng)1.發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)發(fā)酵罐組成：發(fā)酵罐體 攪拌器（高傳質(zhì)作用） 溫控系統(tǒng) 滅菌系統(tǒng) 空氣無菌過濾裝置 殘留氣體處理裝置 參數(shù)測量和控制系統(tǒng)（pH值、O2等） 培養(yǎng)液配制 連續(xù)操作裝置要求：發(fā)酵罐提供菌體生長的最適

7、條件； 培養(yǎng)過程不得污染，保證純菌培養(yǎng)； 培養(yǎng)及消毒過程中不得游離出異物，干擾細胞代謝活動。2.發(fā)酵罐中的反應(yīng)和參數(shù)反應(yīng)：涉及細菌遺傳特性有關(guān)的分子水平的反應(yīng)； 與細菌代謝調(diào)節(jié)有關(guān)的細胞水平的反應(yīng)； 和熱量、質(zhì)量、動量傳遞特性有關(guān)的工程水平的反應(yīng)。參數(shù)： 常測定：溫度、攪拌速度、pH值、DO值、糖含量、罐壓、效價 NH3-N含量、前體濃度、菌體濃度等。 不常測定：氧化還原電位、黏度、排氣中氧氣和二氧化碳含量等3.發(fā)酵罐控制系統(tǒng)發(fā)酵罐控制系統(tǒng)：傳感器、計算機、執(zhí)行器件傳感器： 在線測量的傳感器：測量pH值的發(fā)酵耐高溫電極、測量發(fā)酵罐D(zhuǎn)O值的電極、氧氣分析儀、二氧化碳分析儀等。 需二次傳感技術(shù)的傳

8、感器：酶電極、微生物電極、免疫敏感電極、電化學電極、光學生物傳感器及熱敏、離子敏場效應(yīng)管等（測量時，需將發(fā)酵液引出罐外測定，可采用罐外流通式測量和流動注射法（FIA）測量等技術(shù)）。三、基因工程菌的發(fā)酵工藝1.基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成2.基因工程菌的發(fā)酵條件控制基因工程菌的基本流程 基因工程菌搖瓶培養(yǎng)初步確定工程菌的生長條件發(fā)酵罐放大培養(yǎng)確定最佳工藝參數(shù) 用于制藥的基因工程菌屬于化能異養(yǎng)、好氧型微生物，在有氧的條件下，氧化培養(yǎng)基中的碳源、有機或無機氮源提供能量（APP），進行發(fā)酵生長和繁殖。1.基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成（1）碳源：是基因工程菌生長的第一營養(yǎng)物質(zhì)，其作用在于為正常生理活動和過程提供

9、能量來源，也為細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的合成提供骨架?；蚬こ叹l(fā)酵的物質(zhì)：碳源、氮源、無機鹽、生長因子和選擇劑等?？衫玫奶荚矗禾穷?、有機酸、脂類和蛋白質(zhì)類。 常用的碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。大腸桿菌利用的碳源：蛋白胨、酵母粉等；酵母菌能利用的碳源：葡萄糖、半乳糖等單糖物質(zhì)；絲狀菌利用的碳源：單糖、淀粉等。（2）氮源常用的氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水等。 氮源為基因工程菌生長提供氮素的來源，用于合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷、核酸及其他含氮物質(zhì)。 缺乏氮源細胞無法生長。 酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成和分泌。培養(yǎng)基中的色氨酸對trp啟動子控制的基因表達有影響。（3）

10、無機鹽 無機鹽：磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素；鐵、銅、鋅、錳等微量元素，為基因工程菌生長提供必需的礦物質(zhì)，對代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。無機磷在許多初級代謝的酶促反應(yīng)中是一個效應(yīng)因子，在生物大分子的合成、糖代謝、細胞呼吸及ATP 濃度的控制中，過量的無機磷會刺激葡萄糖的利用、菌體生產(chǎn)和氧消耗過程。 啟動子只有在低磷酸鹽時才被啟動，因此，必須控制磷酸鹽濃度，使細菌生長到一定濃度，磷酸鹽被消耗至低濃度時，目的蛋白才被表達。 起始磷酸鹽濃度應(yīng)控制在0.015mol/L左右，濃度低影響細菌生產(chǎn)，濃度高則導致外源基因不表達。4.生長因子生長因子是指細胞生長所必需的微量有機物，不起碳源和氮源作用。生長因子

11、：維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪等，在胞內(nèi)起輔酶和輔基等作用，參與電子、基團等的轉(zhuǎn)移。由于蛋白胨等天然成分含有各種生長因子，因此，一般在基因工程菌培養(yǎng)基中不單獨添加。（5）選擇劑、誘導物基因工程菌具有營養(yǎng)缺陷或攜帶選擇性標記基因，這種特性保證了基因工程菌的純正性質(zhì)粒的穩(wěn)定性。選擇性標記有兩類：營養(yǎng)缺陷互補標記和抗生素抗性選擇標記?；蚬こ檀竽c桿菌、芽孢桿菌、鏈霉素、真菌等含抗生素抗性基因，常用卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等作為選擇劑?；蚬こ探湍妇Ｓ冒被釥I養(yǎng)缺陷型，如亮氨酸、賴氨酸、色氨酸等。對于誘導表達型的基因工程菌，在細胞生長到一定階段，必須添加誘導物，以解除目標

12、基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。第二節(jié) 基因工程生化產(chǎn)品的分離純化一、細胞破碎二、去除雜質(zhì)三、產(chǎn)物的分離純化四、分離純化方法的選擇建立分離純化的依據(jù)1.含目的產(chǎn)物的起始物料的特點2.物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)3.目的產(chǎn)物的特性4.產(chǎn)品的質(zhì)量要求基因工程菌生化產(chǎn)品的分離與傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化相比，具有以下特點：1.產(chǎn)物大多在細胞內(nèi)，提取前要破碎細胞；2.產(chǎn)物濃度低，雜質(zhì)多，提純難度大；3.產(chǎn)物是大分子蛋白質(zhì)，易失活。一、細胞破碎 細胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。 結(jié)合重

13、組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進展，以前認為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。細胞破碎方法（按是否使用外加作用力）二、去除雜質(zhì) 在純化過程中，非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)不應(yīng)忽視，需要特別注意3種可能存在的非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)，它們是DNA、熱原質(zhì)和病毒。1.去除DNA DNA在pH值為4.0以上呈陰離子形式，可用陰離子交換劑吸附除去，但目的蛋白pI值應(yīng)在6.0以上。 如果蛋白質(zhì)為強酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而不讓DNA吸附上去。 利用親和色譜吸附蛋白質(zhì)，而DNA不被吸附，也可分離。2.去除熱原質(zhì) 熱原質(zhì)（pyrogen）即菌體中細胞壁的脂多糖，大多是革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的。注入人或動物體內(nèi)能引

14、起發(fā)熱反應(yīng)，故名熱原質(zhì)。 相對分子質(zhì)量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原質(zhì)可用超濾或反滲透的方法去除，但對大分子蛋白質(zhì)無效。 脂多糖是陰離子物質(zhì)，可用陰離子交換色譜去除。 脂多糖中脂質(zhì)是疏水性的，可用疏水色譜法去除。 用親和色譜法去除，配基有多粘菌素B、變形細胞溶解物或廣譜的抗體。 3.去除病毒 成品中必須檢查是否含病毒，因為病人的免疫能力低，易受病毒感染。 病毒的最大來源是由宿主細胞帶入。 色譜分離一般能將病毒去除。 必要時，可用紫外線照射使病毒失活，或用過濾法將病毒去除。 三、產(chǎn)物的分離純化 工程菌或工程細胞經(jīng)過細胞破碎和固液分離后，目的產(chǎn)物仍與大量雜質(zhì)混合在一起，這類雜質(zhì)可能有病毒、熱原質(zhì)、氧化產(chǎn)物、核酸、多聚體、雜蛋白、與目的物類似的異構(gòu)體等。 分離純化主要依賴色譜分離方法。該法優(yōu)點：多種多樣的分離機制、設(shè)備簡單、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應(yīng)。色譜技術(shù)主要有離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜、高壓液相色譜等。 基因工程產(chǎn)品制備過程中常用的分離純化方法四、分離純化方法的選擇分離純化應(yīng)遵循的基本原則：1.具有良好的穩(wěn)定性和重復性；2.盡可能減少組成工藝的步驟；3.各技術(shù)和步驟之間能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，工藝與設(shè)備能相互適應(yīng)；4.