抗原抗體膠體金標(biāo)記蛋白的制備

1、抗原抗體膠體金標(biāo)記蛋白的制備膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。1待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4離心1h，去除聚合物。2待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí)，調(diào)至9.0；標(biāo)記McAb時(shí),調(diào)至8.2；標(biāo)記親和層

2、析抗體時(shí)，調(diào)至7.6；標(biāo)記SPA時(shí)，調(diào)至5.96.2；標(biāo)記ConA時(shí)，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和素時(shí)，調(diào)至910。由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜。3膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的確定（1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。（2）將標(biāo)記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5g/ml50g/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。（4）結(jié)果觀察，對(duì)照管（未加蛋白質(zhì)）

3、和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加1020。4膠體金與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5胎牛血清（BSA）和1聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5BSA使溶液終濃度為1；1聚乙二醇加至總?cè)芤旱?10。5膠體金標(biāo)記蛋白的純化（

4、1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g，4離心1h；20nm40nm膠體金結(jié)合物，14 000g，4離心1h。仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1BSA的PB液（含0.02NaN3），將沉淀重懸為原體積的110，4保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50甘油可貯存于-18保存一年以上。為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用1030蔗糖或甘油進(jìn)行

5、密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。（2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的15110。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm20cm，加樣量為床體積的110，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內(nèi)含0.1BSA，0.05NaN3，pH8.2者用IgG標(biāo)記物），流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時(shí)略混濁，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋

6、白結(jié)合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過濾除菌、分裝,4保存。最終可得到7080的產(chǎn)量。6膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定（1）膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察?；蛴么姿徕檹?fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。（2）膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定：膠體金顆粒在波長(zhǎng)510nm550nm之間出現(xiàn)最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1BSA，0.02NaN3）將膠體金蛋白試劑作120稀釋，OD5200.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.20.4。（3）金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MFIG