Folin酚法測定蛋白質(zhì)含量

1、100Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量一、目的掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法，熟悉分光光度計的操作。二、原理Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin試劑）還原，產(chǎn)生深藍色（磷鉬藍和磷鎢藍混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為51OOpg蛋白質(zhì)。Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。三、實驗材料、主要儀

2、器和試劑1實驗材料綠豆芽下胚軸（也可用其它材料如面粉）2儀器（1）722型（或721型）分光光度計（2）4000r/min的離心機（3）分析天平（4）容量瓶（50mL）（5）量筒（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）3試劑（純度均為分析純）（1）0.5mol/LNaOH（2）試劑甲：（A）稱取10gNa2CO3,2gNaOH和0.25g酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水定容至500mL。（B）稱取0.5gCuSO45H2O,溶解后用蒸餾水定容至100mL。每次使用前將（A）液50份與（B）液1份，即為試劑甲，其有效期為1d,過期失效。（3）試劑乙：在1.5L容積的磨口回流器中加入100g鎢酸鈉（N

3、a2WO42H2O）和700mL蒸餾水，再加50mL85%磷酸和100mL濃鹽酸充分混勻，接上回流冷凝管，以小火回流10h?；亓鹘Y(jié)束后，加入150g硫酸鋰和50mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15min,驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（倘若仍呈綠色，再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)沸騰15min）。然后稀釋至1L,過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存，使用前大約加水1倍，使最終濃度相當(dāng)于1mol/L。四、操作步驟1標(biāo)準曲線的制作（1）配制標(biāo)準牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精確稱取0.0250g結(jié)晶牛血清白蛋白，倒100入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，燒杯內(nèi)的殘液用少量蒸餾水沖洗數(shù)次，

4、沖洗液一并倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，則配成250pg/mL的牛血清白蛋白溶液。（2）系列標(biāo)準牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通試管，按表1加入標(biāo)準濃度的牛血清白蛋白溶液和蒸餾水，配成一系列不同濃度的牛血清白蛋白溶液。然后各加試劑甲5mL，混合后在室溫下放置10min,再各加0.5試劑乙，立即混合均勻（這一步速度要快，否則會使顯色程度減弱）。30min后，以不含蛋白質(zhì)的1號試管為對照，用722型分光光度計于650nm波長下測定各試管中溶液的光密度并記錄結(jié)果。（1）標(biāo)準曲線的繪制：以牛血清白蛋白含量（pg）為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線。2樣品的提取及測定（1）準確稱取綠豆芽

5、下胚軸1g,放入研缽中，加蒸餾水2mL，研磨勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)入離心管，并用6mL蒸餾水分次將研缽中的殘渣洗入離心管，離心4000r/min、20min。將上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，作為待測液備用。（2）取普通試管2支,各加入待測溶液1mL，分別加入試劑甲5mL，混勻后放置10min,再各加試劑乙0.5mL,迅速混勻，室溫放置30min,于650nm波長下測定光密度，并記錄結(jié)果。五、結(jié)果計算計算出兩重復(fù)樣品光密度的平均值，從標(biāo)準曲線中查出相對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量X（pg）,再按列公式計算樣品中蛋白質(zhì)的百分含量。XCgg）稀稱倍數(shù)樣品中蛋白質(zhì)含量怏2樣品重閭汕六、附注（1）進行測定時

6、，加Folin試劑要特別小心，因為Folin試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但此實驗的反應(yīng)只是在pH10的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加試劑乙（Folin試劑）時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會使顯色程度減弱。（2）本法也可用于游離酪氨酸和色氨酸含量測定。七、思考題含有什么氨基酸的蛋白質(zhì)能與Folin-酚試劑呈藍色反應(yīng)？測定蛋白質(zhì)含量除Folin-酚試劑顯色法以外，還可以用什么方法？參考答案含有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）能與Folin-酚試劑反應(yīng)呈藍色，因為Folin-酚試劑在堿性溶液中極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原為藍色化合物（鉬蘭和鎢蘭混合物）。除Folin-酚試劑顯色法以外，紫外吸收法也可以進行