實驗八+凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)

1、實驗八 凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)1一目的要求：學(xué)習(xí)和掌握凝膠過濾層析分離蛋白質(zhì)的原理與方法。2二原理凝膠過濾即凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)，也稱分子排阻層析(molecular exclusionchromatography)，分子篩層析(molecular sieve chromatography)或凝膠滲透層析(gel permeation chromatography)。當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同

2、程度地自由出入凝膠珠的內(nèi)外。這樣由于不同大小的分子所經(jīng)的路徑不同而得到分離，大分子物質(zhì)先被洗脫出來，小分子物質(zhì)后被洗脫出來。 葡聚糖凝膠（Sephadex ）是最常用的凝膠。3三、器材與試劑120cm層析柱、葡聚糖凝膠Sephadex-50、蒸餾水、 三角鐵架、 4mg/ml 藍(lán)色葡聚糖溶液、6mg/ml細(xì)胞色素C溶液、2mg/ml重鉻酸鉀溶液。4四、實驗操作1、凝膠溶脹取Sephadex G-50 15g，加500ml蒸餾水室溫溶脹一天（或沸水浴中溶脹1小時）。待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細(xì)顆粒，然后再放些蒸餾水?dāng)噥y，靜置使凝膠下沉，再傾去上層清液，至無細(xì)顆粒為止。 5實驗操作2、裝柱取

3、120cm層析柱一根，底部出口套上乳膠塑料管，向?qū)游鲋鶅?nèi)加蒸餾水趕走在層析柱下過濾層的死體積和接口處的氣泡，在蒸餾水高度約占層析柱內(nèi)部總體積的1/3時，關(guān)閉下端出口。自頂部緩緩加入Sephadex-50懸液，待底部凝膠沉積1-2cm時，再打開出口，凝膠加至離層析柱頂部約3cm即可。用蒸餾水過柱幾遍，以穩(wěn)定床體積(不能讓凝膠表面露出水面)。在裝柱過程中，凝膠柱內(nèi)若有氣泡和分離斷層現(xiàn)象時，可用玻棒攪動消除這些現(xiàn)象或重新裝柱，裝柱結(jié)束后其凝膠表面應(yīng)平整6實驗操作 3、加樣：取4mg/ml 藍(lán)色葡聚糖溶液、6mg/ml細(xì)胞色素C溶液、2mg/ml重鉻酸鉀溶液各6滴混合，即為上柱樣品。將出口打開，使表面

4、的蒸餾水流出，直至恰好與表面相平（不可使床面干掉），關(guān)緊出口，用滴管將上述樣品緩緩地加到床表面( 不要使平整的床表面攪動)。打開出口，讓樣品進(jìn)入床內(nèi)，直至樣品全部進(jìn)Sephadex凝膠柱，關(guān)緊出口。滴加蒸餾水使之成2cm水柱 。7實驗操作4、洗脫和收集 調(diào)節(jié)蠕動泵流速，使得進(jìn)水速度0.3ml/min。打開出口，讓柱內(nèi)液體緩慢流出,流速0.3ml/min， (不能讓凝膠表面露出水面)取小試管20支，每管收集1ml，觀察兩種顏色出現(xiàn)的管號。8實驗操作5、繪制洗脫曲線。9五、注意事項接頭不漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液裝柱要均勻，不要過松也不要過緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此而壓緊凝膠。但也不要過慢，使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過程中，凝膠床高度下降。始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水