色譜分析(中國藥科大學) 第4章-第7節(jié) 檢測方法

1、第七節(jié) 檢測方法一、理想檢測器的特征靈敏度高對所有溶質(zhì)都有快速反應相應對流動相流量和溫度變化都不敏感不引起柱外譜帶擴展二、檢測器的性能指標檢測器的靈敏度：單位樣品量（或濃度）進入檢測器時所給出的響應值。最低檢出限：指檢測器能給出可觀測的信號（S/N3）時進入檢測池的最小樣品濃度。線性范圍 三、紫外吸收檢測器（ultraviolet absorption detector, UVD）原理式中，I為透射光強度，I0為入射光強度，T為透光率，A為吸光度（absorbance），又稱光密度（optical density: OD）或消光值（extinction, E），b為光在溶液中經(jīng)過的距離，一般為

2、吸收池厚度，c是吸光物質(zhì)溶液的濃度，為吸光系數(shù)。如果溶液濃度單位采用mol/L，b的單位為cm，則相應的吸光系數(shù)為摩爾吸光系數(shù)（molar absorptivity）或摩爾消光系數(shù)，單位為L/(molcm)，用符號表示，則由上式可見，吸光度與吸光系數(shù)、溶液濃度和光路長度成直線關(guān)系，當紫外檢測器樣品的光路長度一定時，值越大，靈敏度越高。而的數(shù)值大小取決于波長和樣品物質(zhì)的性質(zhì)，它表明物質(zhì)分子對特定波長輻射的吸收能力。單波長紫外檢測器光源：低壓汞燈波長：254nm結(jié)構(gòu)：雙光路單流路系統(tǒng)特點：適用于相當多的有機化合物，特別是對芳香族化合物。該檢測器具有靈敏度高，穩(wěn)定性好，結(jié)構(gòu)簡單，使用維護方便等優(yōu)點。

3、多波長紫外檢測器光源：氘燈、氫燈或中壓汞燈波長：200nm400nm特點：靈敏度要比單波長式UV-254檢測器略低，選擇性比UV-254高。紫外/可見分光式檢測器光源：氘燈（紫外區(qū)）/鎢燈（可見區(qū)）。(deuterium lamp 氘燈；comparator 比色器；grating 光柵；splitter 分光器；slit 狹縫。)掃描型可變波長紫外檢測器它能在停止流動的情況下，記錄樣品池中洗脫組分的吸收行為。優(yōu)點：既可提供色譜圖，又可提供紫外吸收光譜圖，既可進行定量，又可進行定性。缺點：停流掃描中斷了色譜信息，也會導致色譜峰展寬。光二極管陣列紫外檢測器光電二極管陣列檢測器，又稱光電二極管矩陣

4、檢測器，表示為DAD（diode array detector）、PDA（photo-diode array）或PDAD（photo-diode array detector）。工作原理與儀器結(jié)構(gòu)由于光電二極管陣列檢測器在結(jié)構(gòu)上的主要特點是用光電二極管陣列同時接受來自流通池的全光譜透過光。為了適應這種特點，所以它在結(jié)構(gòu)和光路安排上與普通的色散型紫外可見光檢測器有重要區(qū)別。樣品與光柵的相對位置正好相反的結(jié)構(gòu)，經(jīng)常被稱為“倒光學”（reversed optics）系統(tǒng)。一般，每個陣列有2001024個光電二極管組成，它們的光敏范圍為200600nm，每只光二極管的分辨率為12nm。特點同時得到多個

5、波長的色譜圖，因此可以計算不同波長的相對吸收比。在色譜分離期間，對每個色譜峰的指定位置實時記錄吸收光譜圖，并計算其最大吸收波長。在色譜運行期間可以逐點進行光譜掃描，得到時間波長吸收值三維圖形?？梢赃x擇整個波長范圍的寬譜帶檢測，僅需一次進樣，將所有組分檢測出來。光電二極管陣列檢測器的光路紫外檢測器的光路應用色譜峰的純度檢查）比較光譜法純物質(zhì)峰:在色譜峰范圍內(nèi)任何洗脫時間處所取的光譜圖應該是一致的，僅在振幅上有差異（見圖1），不純物質(zhì)峰：在色譜峰的不同部位得到的吸收光譜中，吸收最大值發(fā)生了位移（見圖2）。）吸收比法（比率色譜法）對于純物質(zhì)來說，兩個特定波長處的吸收比應為一常數(shù)，與濃度無關(guān)，所以吸收

6、比可以用作色譜峰純度的檢查指標。純物質(zhì)色譜峰各點處的濃度不同，因而吸收光譜振幅大小不一，但吸收比應當相等。）雙波長法紀錄被測組分在兩個等吸收波長處的吸收值差對時間色譜圖，純峰應該得到一個零信號，否則證明有雜質(zhì)存在。色譜峰的鑒定與標準品或標準光譜比較 三維色譜能提供更多更全面的信息寬譜帶檢測可以選擇整個波長范圍，例如從190nm600nm，譜帶寬度為400nm，僅需一次進樣，則在這一段波長范圍內(nèi)有吸收的所有組分都能被檢測出來。峰抑制（peak suppression）如果兩個化合物在色譜圖中并未完全分開，但他們的吸收光譜卻有很大差別。通過選擇適當?shù)臏y定波長、參比波長和帶寬，使一種化合物的色譜峰被

7、完全抑制，提高選擇性，實現(xiàn)未分離峰的準確定量分析。這種峰抑制技術(shù)的代價是靈敏度將降低約1030。選擇最佳波長使檢測波長隨時間變化而變化，從而提高每一分離組分的檢測靈敏度；采用各組分的最大吸收波長同時進行多通道（多信號）檢測。四、熒光檢測器 (fluorescence detector , FD )工作原理與儀器結(jié)構(gòu)許多化合物存在光致發(fā)生的現(xiàn)象，即它們可被入射光（稱為激發(fā)光）所激發(fā)而發(fā)出波長相同的共振輻射或波長較長的特征輻射，即熒光。熒光檢測器就是在樣品的激發(fā)波長處測量發(fā)射光的強弱。（photo cell：光電池，即檢測器，將熒光強度轉(zhuǎn)化為電信號）優(yōu)點靈敏度極高。比紫外可見光檢測器約高兩個數(shù)量級

8、，最小檢測量可達10-13g。良好的選擇性。線性范圍較寬，約104105（比紫外吸收檢測器窄）。受外界條件的影響較小。只要選作流動相的溶劑不會發(fā)射熒光，熒光檢測器就能適用于梯度洗脫。缺點應用范圍較窄（措施：與熒光試劑發(fā)生反應生成熒光衍生物）。熒光分析的干擾因素較多，影響測定的準確度。五、電化學檢測器 （electrochemical detector, ECD）原理利用被測物在電極上發(fā)生氧化還原反應而產(chǎn)生電流，從而得以檢測的一種方法。電化學檢測器測得的電信號與發(fā)生電極反應的被測組分的摩爾數(shù)成正比。適用范圍可氧化化合物：酚、二羥基、過氧化物等可還原化合物：酮、醛、共軛不飽和化合物等特點高靈敏度，

9、最低檢出限，可達10-12g/ml，故適合痕量分析。高選擇性，專屬性強。線性動力學測定范圍寬（106）。六、示差折光檢測器（Refractive Index Detector）原理基于連續(xù)測定色譜柱流出物折射率的變化而用于測定樣品濃度。溶有樣品的流動相和流動相本身之間折射率之差即表示樣品在流動相中的濃度。原則上凡是與流動相折射指數(shù)沒有差別的樣品都可用它來測定。結(jié)構(gòu)類型反射式、偏轉(zhuǎn)式、干涉型。特點檢測限可達10-610-7g/ml；對溫度非常敏感；檢測靈敏度不高，但由于對所有的物質(zhì)都有響應。七、蒸發(fā)光散射檢測器(Evaportive light Scattering Detector, ELSD

10、)工作原理與儀器結(jié)構(gòu)ELSD都是三部分組成，即霧化器、加熱漂移管和光散射池。霧化用惰性氣體霧化脫洗液；蒸發(fā)流動相在加熱管（漂移管）中蒸發(fā)；檢測樣品顆粒散射光后得到檢測。影響ELSD的因素漂移管溫度的影響隨溫度升高，流動相蒸發(fā)趨向完全，信噪比升高，但溫度過高可能導致組分部分氣化而使信號變小。最優(yōu)溫度應是在流動相基本揮發(fā)的基礎上，產(chǎn)生可接受噪音的最低溫度。載氣流速對響應值的影響隨氣體流速的增大，響應值隨之減小。最優(yōu)氣體流速應是在可接受噪音的基礎上，產(chǎn)生最大響應的最低氣體流速。鹽對基線噪音的影響對高濃度的鹽，鹽的不完全揮發(fā)會造成基線升高，使樣品響應值受氣體流速的影響相對變??；對低濃度的鹽，鹽較完全揮

11、發(fā)使響應值受其影響較大。對用做緩沖鹽的鹽既要容易揮發(fā)，又要具有好的純度，一般鹽的揮發(fā)性越大，所需的氣體流速和漂移管溫度越低。ELSD的特點通用型質(zhì)量檢測器。靈敏度高，LOD為10ng，采用細內(nèi)徑柱可使檢測靈敏度增至最大。對流動相系統(tǒng)溫度變化不敏感，不必嚴格控制溫度?？蛇M行梯度洗脫，基線平穩(wěn)，分離時間短，提高定量精度。適用于非揮發(fā)性物質(zhì)。流動相應是易揮發(fā)的溶劑，可用100%水及可揮發(fā)的緩沖溶液，但緩沖液濃度應盡可能低。峰面積和峰高的自然對數(shù)分別與濃度的自然對數(shù)有較好的線性關(guān)系。八、液相色譜與其它儀器的聯(lián)用與質(zhì)譜聯(lián)用LC-MS結(jié)合了液相色譜和質(zhì)譜，取長補短，因而集LC的高分離能力與MS的高靈敏度、

12、高專屬性于一體。原理樣品轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)離子。利用離子在電場和磁場中的運行性質(zhì)，將這些離子在真空狀態(tài)下按其質(zhì)荷比(m/z)進行分離。質(zhì)譜圖就是一張以相對離子流強度為縱坐標、以質(zhì)荷比(m/z)為橫坐標的曲線圖。作用定性：主要是以HPLC為分離手段，以質(zhì)譜為定性手段，進行藥物體內(nèi)代謝物的研究，或降解產(chǎn)物的研究。定量：主要以樣品中組分的基峰的高度為指標進行定量，但一般需以同位素標記的被測物為內(nèi)標才能確保定性的準確性。若沒有同位素內(nèi)標，則至少也要選擇結(jié)構(gòu)及裂解方式基本與被測物相似的物質(zhì)作為內(nèi)標。與核磁共振聯(lián)用優(yōu)點核磁共振（NMR）是一種信息豐富的檢測手段，其化學位移和偶合常數(shù)能提供豐富的有關(guān)分子中每個氫原子的局部電子環(huán)境的結(jié)構(gòu)信息。應用范圍在聚合物應用方面：測定組分結(jié)構(gòu)和分子量、聚合物動力學研究等。在藥物和臨床化學方面有：不需事先分離就