多能干細(xì)胞相關(guān)載體及其安全性的研究進(jìn)展 - 副本(共10頁)

1、研究生課程(kchng)論文多能(du nn)干細(xì)胞相關(guān)載體及其安全性的研究進(jìn)展課程(kchng)科目 專 題 討 論 授課教師 龐 全 海 2013 級 碩士 研究生 盧杰麗 學(xué) 號 20132348 多能干細(xì)胞相關(guān)載體及其安全性的研究進(jìn)展摘要(zhiyo)：目前(mqin)人類已能將鼠和人的體細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct3/4，Sox2，Klf4和c-Myc等基因成功(chnggng)改造成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell,iPS cell），這使再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究成為熱點。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(i nduced pl uri potent stem cel l

2、 s, i PS 細(xì)胞)不僅具有與胚胎干細(xì)胞(embryoni c stemcel l , ESC)相似的各項特性，相對于 ESC，iPS 細(xì)胞，尤其患者特異性 iPS 細(xì)胞還具有來源方便、不存在免疫排斥和倫理問題以及可以保留特定個體基因型等優(yōu)點，為再生醫(yī)學(xué)提供了可能的細(xì)胞來源。盡管目前誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用及載藥材料的研究仍面臨著諸多技術(shù)問題，但隨著誘導(dǎo)技術(shù)和載體種類的不斷改進(jìn)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用指日可待。文章綜述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在載體方面的最新研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞: 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；病毒載體誘導(dǎo)；質(zhì)粒載體誘導(dǎo)；酶切系統(tǒng)誘導(dǎo)；重組蛋白誘導(dǎo)；安全性；誘導(dǎo)效率2006年日本京都大學(xué)的Takah

3、ashi等1首次報道，將選擇的特定外源性轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠的成纖維細(xì)胞(xbo)，可以成功誘導(dǎo)出多能性的類胚胎干細(xì)胞，他們把這類細(xì)胞命名為-誘導(dǎo)(yudo)多能干細(xì)胞（iPS cell）。這一新的突破在理論上首次證實了已分化成熟的體細(xì)胞同樣可以被重編程而轉(zhuǎn)化為類胚胎干細(xì)胞，且成功地解決了難以(nny)突破的倫理及免疫排斥問題，為再生醫(yī)學(xué)增加了一個新途徑。運(yùn)用此重編程技術(shù)能從特定疾病的患者體內(nèi)提取成體細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)成疾病特異蚤孕雜細(xì)胞。疾病特異蚤孕雜細(xì)胞的誘導(dǎo)成功更為體外研究遺傳疾病發(fā)生、發(fā)展和組織形成提供了更加廣泛和大量的研究模型，并將有力推動基因治療和藥物研發(fā)。但是，重編程外源基因組及使用病毒

4、載體會影響ips細(xì)胞基因組，即可能引發(fā)潛在的插入性腫瘤和干擾誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化。因此，尋找合適的載體是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)的重要研究課題。載體是由質(zhì)粒、噬菌體及病毒衍生而來的，具有攜帶功能的DNA分子，在載體中可插入外源基因片斷，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或利用病毒進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制導(dǎo)入到一個宿主細(xì)胞中，并在其中進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)。1 使用病毒載體誘導(dǎo)ips細(xì)胞1.1 以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為載體 2007年Okita等2報道，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將Oct3/4，Sox2，Klf4和c-Myc等4種因子導(dǎo)入人類成纖維細(xì)胞，成功誘導(dǎo)成類胚胎干細(xì)胞。幾乎與之同時，美國科學(xué)家Yu等3也成功地將人類成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成類胚胎干細(xì)

5、胞。與Okita研究組所不同的是，Yu等運(yùn)用的載體為慢病毒，所采用的轉(zhuǎn)錄因子是通過自篩而確定的4種因子組合，即Oct3/4，Sox2，Nanog和Lin28。結(jié)果顯示，生成ips細(xì)胞與人的類胚胎干細(xì)胞特性高度一致。隨后，研究小組將ips細(xì)胞注入先天免疫缺陷的裸鼠皮下，得到包含三胚層細(xì)胞的畸胎瘤，進(jìn)一步證實其具有類似胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒(bngd)或慢病毒作為載體轉(zhuǎn)染體細(xì)胞誘導(dǎo)成ips細(xì)胞的方法，因其直接使外源性基因和載體整合到受體體內(nèi)的基因組，會引起(ynq)插入突變以干擾正常的ips細(xì)胞系的功能，而細(xì)胞中殘余的外源因子(ynz)序列的表達(dá)會影響分化，甚至有導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的危險性

6、。特別是原癌基因c-Myc的導(dǎo)入，由其構(gòu)建的嵌合體小鼠中約20%發(fā)生了腫瘤3。因此，目前很多學(xué)者已采用其他方法替代原癌基因c-Myc的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而以逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒為載體誘導(dǎo)ips細(xì)胞的臨床應(yīng)用也受到了極大的限制。1.2 以腺病毒為載體 2008年Stadtfeld等4報道，使用腺病毒載體轉(zhuǎn)染Oct4，Sox2,ccc-Myc和Klf44種因子，成功地將小鼠肝細(xì)胞改造成ips細(xì)胞。研究者使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和Southern blotting等方法未發(fā)現(xiàn)腺病毒載體基因組及轉(zhuǎn)導(dǎo)因子基因組整合到宿主細(xì)胞基因組中的跡象。與逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒相比，腺病毒載體可以使外源基因組不會整合到宿主細(xì)胞基因組當(dāng)中，解

7、決了外源基因組對ips細(xì)胞分化干擾的難題。然而，以腺病毒為載體誘導(dǎo)ips細(xì)胞的效率非常低（0.0001%-0.0018%），比逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的誘導(dǎo)率（0.1%）低很多，這就限制了其臨床應(yīng)用。2 使用質(zhì)粒載體誘導(dǎo)ips細(xì)胞2.1 以質(zhì)粒為載體 2008年日本學(xué)者Okita等5使用質(zhì)粒為載體，攜帶轉(zhuǎn)染所需的因子基因，成功地將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成類胚胎干細(xì)胞-ips細(xì)胞。這種方法不僅防止了病毒載體基因組整合到宿主細(xì)胞基因組中，同時可以防止外源基因干擾ips細(xì)胞的分化。Okita等利用質(zhì)粒的自我復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等特性設(shè)計了兩種攜帶轉(zhuǎn)染因子的質(zhì)粒改造小鼠成纖維細(xì)胞，一種為pCX-OKS-2A，其由一段2A肽

8、（ 來自口蹄疫病毒，具有自我清除作用）攜帶Oct4,Sox2和Klf4三種轉(zhuǎn)導(dǎo)基因；另一種是pCX-c-Myc，由一段2A肽攜帶c-Myc轉(zhuǎn)染基因。兩種質(zhì)粒經(jīng)多次瞬間轉(zhuǎn)染，將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成ips細(xì)胞。此法大大消除了插入性腫瘤形成的風(fēng)險及再激活癌基因的可能性。但其仍然無法突破一個障礙ips細(xì)胞誘導(dǎo)率極低。采用此法轉(zhuǎn)導(dǎo)1106個成體細(xì)胞只成功改造了1-29個ips細(xì)胞，而在同樣的實驗條件下，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體卻能成功轉(zhuǎn)染1-1000個ips細(xì)胞6。西班牙學(xué)者Gonzalez等7改進(jìn)了Okita研究組的方法，他們采用一個質(zhì)粒載體就將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成功地誘導(dǎo)出ips細(xì)胞，并設(shè)計出一個含O

9、ct4,Sox2和Klf4和c-Myc四種轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的多順反子質(zhì)粒載體pCAG-OS-KM，通過瞬間轉(zhuǎn)染的方法改造小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成ips細(xì)胞。但誘導(dǎo)率仍很低。2.2 以oriP/EBNA1質(zhì)粒為載體(zit) Yu等8于2009年利用(lyng)oriP/EBNA1質(zhì)粒，首次生成(shn chn)無外源基因重編程的人ips細(xì)胞。EBNA1和oriP是EB病中與復(fù)制和保持病毒基因組游離性的重要基因元件。具有oriP/EBNA1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人靶細(xì)胞后不整合，并可長期穩(wěn)定存在，不會造成宿主細(xì)胞的突變。同時，由于其具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及免疫逃逸等功能，使質(zhì)粒攜帶的目的基因能夠獲得較高的轉(zhuǎn)染效率9。Yu工作小組

10、經(jīng)研究得出，當(dāng)oriP/EBNA1質(zhì)粒只整合Oct4,Sox2，Nanog及Lin28四種外源基因，其改造人新生兒包皮成纖維細(xì)胞的成功率為0.1%，但當(dāng)再增加Klf4和c-Myc轉(zhuǎn)導(dǎo)基因后，其誘導(dǎo)成功率則增加員10倍。3 使用酶切系統(tǒng)誘導(dǎo)ips細(xì)胞3.1 利用Cre/LoxP重組系統(tǒng) Soldner等10從帕金森患者身上提取成纖維細(xì)胞核利用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的慢病毒載體，通過酶切Cre/LoxP重組系統(tǒng)成功地培育出不含外源基因的人ips細(xì)胞。酶切Cre/LoxP系統(tǒng)可以使某一基因在特定的組織、細(xì)胞中，在細(xì)胞分化，成熟過程的某一時段被剔除，以減輕其帶來的副作用。這雖能除去外源因子序列，但載體序列仍會有

11、殘留，因此仍可能造成插入性突變。此外采用這種方法誘導(dǎo)的成功率仍然很低，轉(zhuǎn)染Oct4,Sox2和Klf4和c-Myc4種基因后，其誘導(dǎo)成功率只有0.01%11。3.2 利用(lyng)piggyBac轉(zhuǎn)座子 Yusa等12報道(bodo)，利用piggyBac轉(zhuǎn)座子方法，將小鼠胚胎(piti)成纖維細(xì)胞成功地改造成ips細(xì)胞。piggyBac是一種從粉紋夜蛾中分離到的、具有TTAA插入位點特異性的DNA轉(zhuǎn)座子。piggyBac可在昆蟲基因組中準(zhǔn)確切離，轉(zhuǎn)化頻率較高，且不受宿主因子的限制13。Yusa研究小組設(shè)計了含有piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、具有自我清除作用的F2A肽及T2A的載體，轉(zhuǎn)染Oct

12、4,Sox2和Klf4和c-Myc基因。此載體能通過piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)形成的轉(zhuǎn)座F2A肽和T2A肽切除插入的外源基因和載體序列，因此，得到的ips細(xì)胞不會留下外源基因組的“ 足跡”，可更好地應(yīng)用于臨床。更重要的是利用piggyBac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染Oct4,Sox2和Klf4和c-Myc基因能使轉(zhuǎn)導(dǎo)率達(dá)到1%，相當(dāng)于以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)率。4 使用重組蛋白誘導(dǎo)ips細(xì)胞 2009年Zhou等將重組蛋白（Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和c-Myc-11R）轉(zhuǎn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，成功地誘導(dǎo)出類胚胎干細(xì)胞-蛋白誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。這一技術(shù)在誘導(dǎo)ips細(xì)胞領(lǐng)域里產(chǎn)生了重大的突

13、破，能在不涉及基因組調(diào)節(jié)的情況下，只憑借蛋白質(zhì)就能將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成ips細(xì)胞，這一技術(shù)大大簡化了將細(xì)胞重編程為類胚胎干細(xì)胞的常用技術(shù)的繁瑣步驟。Zhou的研究小組首先將Oct4,Sox2和Klf4和c-Myc基因重編程大腸桿菌細(xì)胞，促使大腸桿菌表達(dá)源種基因，形成的蛋白經(jīng)過正確折疊、修飾、純化和連接目標(biāo)肽，在目標(biāo)肽的引導(dǎo)下通過滲透法進(jìn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，發(fā)揮誘導(dǎo)功能。實驗證實只有通過反復(fù)多次的轉(zhuǎn)入重組蛋白，才可能誘導(dǎo)出類胚胎干細(xì)胞。這種方法與之前誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的方法相比有以下2點優(yōu)勢：（1）有效地消除了外源基因和序列對細(xì)胞基因的修改造成的風(fēng)險；（2）蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法更加簡單快速、經(jīng)濟(jì)

14、實用。然而，缺點就是難以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，在轉(zhuǎn)導(dǎo)源種重組蛋白及組蛋白脫乙?；敢种苿┍焖幔ㄒ材芴岣逴ct4,Sox2和Klf4基因誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞重編程效率）的作用下，僅能將5104個小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成功改造得到3個ips雜細(xì)胞。5 i PS細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性長期觀察發(fā)現(xiàn)(fxin)，借助反轉(zhuǎn)錄病毒向細(xì)胞導(dǎo)入 Oct4、Kl f4、Sox2、c- M yc等因子誘導(dǎo)的i PS 細(xì)胞導(dǎo)入小鼠體內(nèi)后極易生長腫瘤 14 。究其原因，可能是因為誘導(dǎo)因子中含有致癌基因 c- M yc，逆轉(zhuǎn)錄病毒附帶的一些因子誤激活了宿主的一些致癌基因，或者是反轉(zhuǎn)錄病毒本身誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生了腫瘤等。這些都是i PS 細(xì)胞走

15、向臨床的巨大障礙。為了解決這個問題，國際(guj)上很多實驗室嘗試在不帶入逆轉(zhuǎn)錄病毒的情況下誘導(dǎo) i PS 細(xì)胞的產(chǎn)生，并取得了巨大的成功。Stadtfel d等 15 和 Oki ta等 16 先后利用不容易整合到宿主基因(jyn)的腺病毒及質(zhì)粒為載體向目的細(xì)胞導(dǎo)入上述 4 個因子誘導(dǎo) i PS細(xì)胞產(chǎn)生 ；Wol tj en等 17 利用piggyBac為中介向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入上述4 個因子誘導(dǎo) i PS 細(xì)胞；Gonzal ez等 18 則利用單個多順反子的媒介同時導(dǎo)入上述 4 個因子的方法誘導(dǎo) i PS 細(xì)胞；Zhou等 19 將 Yamanaka因子的蛋白質(zhì)產(chǎn)物導(dǎo)入細(xì)胞誘導(dǎo)i PS 細(xì)胞。結(jié)

16、果，這些方式都在不帶入逆轉(zhuǎn)錄病毒的情況下成功產(chǎn)生了 i PS 細(xì)胞，而且這些i PS 細(xì)胞同樣能表達(dá)ESC 的典型標(biāo)志，如 NANOG 、SOX- 2、SSEA- 1 等并能分化出三胚層，表現(xiàn)出與由逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的i PS細(xì)胞和ESC極為相似的特性。由此 i PS 細(xì)胞的安全性得到了可靠的提高。當(dāng)然，癌癥發(fā)生的危險性雖然能通過這些方式大大降低，但是在沒有完全闡明 iPS 細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)制之前，我們?nèi)匀徊荒苷f iPS 細(xì)胞應(yīng)用于臨床就是安全的，i PS細(xì)胞的安全性和潛在危險性都需要通過長期的觀察和實驗加以證實。此外，與 ESC 相似，如果 i PS細(xì)胞不經(jīng)誘導(dǎo)定向分化就導(dǎo)入受體體內(nèi)亦存在產(chǎn)生畸胎瘤的

17、風(fēng)險。6 結(jié)語ips細(xì)胞研究在短短幾年時間里已取得重大的突破，為避免重編程外源基因可能導(dǎo)致受體發(fā)生插入性腫瘤及影響細(xì)胞分化等潛在性危險，應(yīng)盡量減少外源基因的整合。從2006年Takahashi等轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct4,Sox2和Klf4和c-Myc等24種因子到如今Kim等只轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct4一個基因就誘導(dǎo)得到ips細(xì)胞，可見其研究進(jìn)展是迅速的?？茖W(xué)家首次誘導(dǎo)ips細(xì)胞使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒，出現(xiàn)了載體的序列整合到宿主細(xì)胞基因組，存在癌基因激活的危險。因此，研究者又陸續(xù)研發(fā)了慢病毒、腺病毒、質(zhì)粒載體，重組蛋白轉(zhuǎn)染成體細(xì)胞誘導(dǎo)得到ips細(xì)胞，大大減少了外源基因的整合，然而科學(xué)家在設(shè)計出更安全的載體后，又普遍出現(xiàn)了誘導(dǎo)

18、效率低下的困惑，這嚴(yán)重影響了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用及藥物開發(fā)。因此，ips細(xì)胞領(lǐng)域的研究者都期待著在不轉(zhuǎn)導(dǎo)外來基因組的情況下，通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)或?qū)ふ腋m合的誘導(dǎo)細(xì)胞和載體技術(shù)，創(chuàng)造出更安全、更高效、更穩(wěn)定的ips細(xì)胞。參考文獻(xiàn)：1 Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126 (4): 652-655.2 Okita K, Ichiaska T, Y

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