分子診斷學(xué)重點(diǎn)內(nèi)容(共8頁)

1、分子診斷學(xué)重點(diǎn)(zhngdin)內(nèi)容（Navy）1、分子診斷學(xué)（molecular diagnostics）是利用分子生物學(xué)技術(shù)來研究機(jī)體外源性和內(nèi)源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)(jigu)或表達(dá)調(diào)控的改變，從而為疾病的預(yù)測、預(yù)防、診治和轉(zhuǎn)歸提供分子水平信息。 2、基因：是一段攜帶功能產(chǎn)物（多肽，蛋白質(zhì)，tRNA和rRNA和某些小分子(fnz)RNA）信息的DNA片段，是控制某種性狀的的遺傳單位。 3、密碼子偏愛（codon bias ）指在不同物種的基因中經(jīng)常為某種氨基酸編碼的只是其中的一個(gè)密碼子。當(dāng)鑒別到一個(gè)ORF時(shí)，密碼子偏愛常常用來確定這個(gè)ORF是否是一個(gè)基因。 4、基因組（g

2、enome）：指一個(gè)細(xì)胞或生物體的一套完整的單倍體遺傳物質(zhì)。 5、C值矛盾：生物體的進(jìn)化程度與基因組大小之間不完全成比例的現(xiàn)象稱為C值矛盾也稱C值佯謬（ C value paradox） 6、N值矛盾：基因組中基因數(shù)目與生物進(jìn)化程度或復(fù)雜程度的不對稱性，稱為N值矛盾或N值佯謬（N value paradox）。 7、基因組計(jì)劃是指以獲得某物種基因組全序列為主要目標(biāo)的科學(xué)計(jì)劃。 8、厘摩爾根（cM）即重組頻率為1%的兩個(gè)基因間的遺傳距離 9、基因組學(xué)（Genomics）指對所有基因進(jìn)行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜）核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一門科學(xué)。 10、鑒別蛋白

3、質(zhì)編碼基因的五項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)是什么？ 開放閱讀框、密碼子偏愛、序列保守性、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、基因失活 11、原核生物是細(xì)菌等原始生物的總稱，是最簡單的細(xì)胞生物體 12、質(zhì)粒：獨(dú)立于細(xì)菌細(xì)胞染色體以外，能自主復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）分子，稱為質(zhì)粒(plasmid) 13、瓊脂糖凝膠電泳泳動速度： 超螺旋DNA分子線性DNA分子半開環(huán)DNA分子14、接合作用(conjugation)當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作(conjugation)。 15、轉(zhuǎn)化作用 (transformation)通過自動獲取或人為

4、地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。 16、轉(zhuǎn)導(dǎo): 以噬菌體為媒介把細(xì)菌的基因從一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的過程.一般是針對溫和噬菌體, 溶血性噬菌體則不會發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo). 17、轉(zhuǎn)染: 病毒侵入宿主細(xì)胞過程. 對原核生物說, 轉(zhuǎn)染是噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞的過程 18、轉(zhuǎn)座： 由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。 19、轉(zhuǎn)座因子 可移動的基因成分，即能在一個(gè)(y )DNA分子內(nèi)部或兩個(gè)DNA分子之間移動的DNA片段，稱為轉(zhuǎn)座因子(transposable element ) 在細(xì)菌中，指

5、可在質(zhì)粒和染色體之間或質(zhì)粒和質(zhì)粒之間可移動的DNA片段 20、轉(zhuǎn)座因子(ynz)的分類：插入序列、轉(zhuǎn)座子、可轉(zhuǎn)座的噬菌體 21、基因轉(zhuǎn)移(zhuny)的方式： 接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染 22、真核生物基因組的一般特征 （一）基因組龐大 （二）線狀雙鏈DNA和二倍體 （三）非編碼區(qū)遠(yuǎn)多于編碼區(qū) （四）斷裂基因（split gene） （五）大量重復(fù)序列存在 23、衛(wèi)星DNA：由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA 分開，因而稱為衛(wèi)星DNA （或隨體DNA） 24、中度重復(fù)序列片段較長（100-幾千bp)具有種屬特異性，可作為DNA標(biāo)記 25、基因家族(gene

6、family)一組功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因，在進(jìn)化過程中從一個(gè)祖先基因經(jīng)重復(fù)和突變演變而來的。 26、假基因（pseudogene）與具正常功能的基因序列相似，但無轉(zhuǎn)錄功能或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無功能的基因。 27、所有組蛋白基因都不含內(nèi)含子，而且組蛋白基因序列都很相似，從而編碼的組蛋白在結(jié)構(gòu)上和功能上也極為相似 28、質(zhì)粒與核DNA區(qū)別： 1.非孟德爾的母系遺傳 2.高突變率 3.異質(zhì)性和復(fù)制分離 4.閾值效應(yīng) 5.半自主復(fù)制與協(xié)同作用 29、線粒體?。河捎诰€粒體呼吸鏈功能不良所導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)多樣化的一組疾病。 30、CpG島：大約有一半的人類基因富含CpG的順序，稱為CpG島 31、單核苷

7、酸的多態(tài)性( single nucleotide polymorphism, SNP) 主要用途： 疾病的連鎖分析與基因的定位 指導(dǎo)用藥和藥物設(shè)計(jì) 用于進(jìn)化和種群多樣性的研究 32、短串聯(lián)重復(fù)序列 ( short tandem repeat , STR) STR在人類基因組內(nèi)平均15-20kb就有一個(gè)STR 點(diǎn)位，占基因組的10%，多存在于非編碼區(qū)及內(nèi)含子中。主要用途： 人類基因遺傳圖譜的制作。目的基因篩選和基因診斷。法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別和親權(quán)鑒定。 33、病毒（virus）是一類比較原始的、有生命特征的、能夠自我復(fù)制的、嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的非細(xì)胞生物，是結(jié)構(gòu)最簡單、最微小的生命形式。 34、末端正向重

8、復(fù)序列 又稱末端冗余（terminal redundancy）是指雙鏈DNA分子兩端有一段相同的核苷酸序列 35、末端反向重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR）指病毒基因組兩端的反向互補(bǔ)重復(fù)序列。ITR可能與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及整合有關(guān) 36、重疊基因：許多病毒基因組的一段DNA序列有兩個(gè)或兩個(gè)以上的開放讀碼框架，可以編碼兩種或兩種以上的多肽鏈，稱為重疊基因 37、分段基因組：指病毒基因組由數(shù)條不同的核酸分子組成，多見于RNA病毒 38、乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是目前已知感染人類(rnli)的最小的雙鏈DNA病毒 39、RNA病毒基因組

9、為線狀單鏈或雙鏈，正鏈RNA病毒基因組均為線狀RNA分子(fnz) 僅HDV的負(fù)鏈RNA病毒基因組為環(huán)狀，其余的負(fù)鏈RNA病毒均為線狀 40、正鏈RNA病毒：基因組序列與mRNA相同，可直接(zhji)作蛋白質(zhì)合成的模板，此類RNA病毒具有侵染能力 41、負(fù)鏈RNA（-RNA）病毒：基因組序列與mRNA互補(bǔ)，基因組只有在其核衣殼蛋白轉(zhuǎn)錄酶存在下，才具有侵染能力 42、蛋白質(zhì)組是指特定細(xì)胞、組織乃至機(jī)體作為一個(gè)生命單元中所擁有蛋白質(zhì)的集合,即生命體中攜帶的基因信息在某一時(shí)段所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。 43、蛋白質(zhì)組學(xué)是指對在特定的時(shí)間和環(huán)境下所表達(dá)的群體蛋白質(zhì)研究的一門學(xué)問。主要在蛋白質(zhì)水平上探索蛋白

10、質(zhì)的表達(dá)模式、作用模式、功能機(jī)制、調(diào)節(jié)控制以及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用。是在生物體或其細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行的,并從一個(gè)機(jī)體或一個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)整體活動來揭示生命的規(guī)律。44、二維凝膠電泳是目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分離技術(shù)。它由兩向電泳組成,第一向以蛋白質(zhì)電荷差異為基礎(chǔ)進(jìn)行分離的等電聚焦凝膠電泳,第二向是以蛋白質(zhì)分子量差異為基礎(chǔ)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。 45、質(zhì)譜技術(shù)是樣品分子離子化后,根據(jù)不同離子間的質(zhì)量、電荷比值(質(zhì)荷比,m/z)差異來確定分子量的技術(shù)。 46、凝膠滯后實(shí)驗(yàn)是近年來發(fā)展起來的用聚丙烯酰胺凝膠電泳直接分析核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合的簡單、快速、敏感方法。通過蛋白質(zhì)與末端標(biāo)記的核

11、酸探針特異性結(jié)合,電泳時(shí)這種復(fù)合物較無蛋白結(jié)合的探針在凝膠中的泳動速度要慢,即表現(xiàn)為相對滯后。 47、細(xì)胞的破碎方法 機(jī)械法：液體剪切法與固體剪切法 本法不適合于染色體DNA的分離與純化 非機(jī)械法：干燥法與溶胞法 溶胞法溫和，能保證較高的得率與較好地保持核酸的完整性而得到廣泛的應(yīng)用 48、核酸的分離與純化應(yīng)去除的污染物主要包括 非核酸的大分子污染物 非需要的核酸分子 在核酸的分離純化過程中加入的對后繼實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用有影響的溶液與試劑 49、核酸濃縮最常用的方法-沉淀。其優(yōu)點(diǎn)很容易地調(diào)整核酸溶液至所需濃度，能去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子。 50、核酸沉淀的洗滌：用70%75%的乙醇51、核酸濃度測定 紫

12、外分光光度法：適用于0.25g/ml的核酸溶液 52、熒光光度法: 用溴化乙錠（EB）。靈敏度可達(dá)1ng5ng，適合低濃度核酸溶液的定量分析。SYBR Gold作為一種新的超靈敏熒光染料，可檢出20pg的雙鏈DNA 53、核酸純度鑒定 (1) 紫外分光光度法：A260/A280 純DNA比值為1.8，純RNA比值為2.0。比值升高與降低均表示不純。 比值為1.8的DNA溶液不一定為純的DNA溶液 一般28S RNA的熒光強(qiáng)度約為18S RNA的2倍，否則提示有RNA的降解。 如果在加樣槽附近有著色條帶，則說明有DNA的污染。 54、核酸(h sun)的保存 DNA的保存 DNA溶于TE緩沖液中

13、在-70可以儲存數(shù)年。 RNA的保存(bocn) RNA可溶于0.3mol/L NaAc溶液或雙蒸水中，在-70至-80保存。以焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解(rngji)RNA可延長保存時(shí)間。RNA沉淀溶于70%乙醇或去離子甲酰胺液中，可在-20中長期保存。 55、基因組DNA分離與純化的方法 酚抽提法、甲酰胺解聚法 、玻棒纏繞法、其他DNA快速提取法 56、裂解緩沖液中各成分的作用： EDTA：二價(jià)金屬離子螯合劑，可抑制DNA酶活性，并降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。 SDS：陰離子去污劑，可降解細(xì)胞膜、乳化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使它們沉淀，同時(shí)降解DNA酶。 無DNA酶的RNA酶：可有效水解RNA而避免D

14、NA的消化 蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)，可消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。 酚：可使蛋白變性沉淀、抑制DNA酶活性。 pH8.0的Tris溶液：能保證抽提后DNA進(jìn)入水相，而避免滯留于蛋白質(zhì)層57、甲酰胺是一種離子化溶劑, 其作用： 裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物、使釋放的蛋白質(zhì)變性、對蛋白酶K的活性無顯著影響 58、玻璃纏繞法得到的DNA用途：構(gòu)建基因組DNA文庫、Southern印跡、PCR擴(kuò)增 59、從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段 DEAE纖維素膜插片電泳法 操作簡單、對小于5kb片段回收率好、回收DNA純度高、但不能回收單鏈DNA、不適于大于15kb的DNA片段回收。 電泳洗脫法 液氮冷凍擠壓法 低

15、熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠塊回收法 商品試劑盒(柱層析） 60、從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段標(biāo)準(zhǔn)方法：壓碎與浸泡法 本法能很好地回收1kb的單鏈或雙鏈DNA 61、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA基本原理： pH12.6高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA都變性，但質(zhì)粒DNA超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離。當(dāng)以pH4.8的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來構(gòu)型，保存在溶液中。 染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。 62、質(zhì)粒純化：CsCl-EB等密度梯度超速離心法(標(biāo)準(zhǔn)

16、方法) 63、聚乙二醇(PEG)沉淀法 優(yōu)點(diǎn):簡單、經(jīng)濟(jì)、適用廣泛，尤其對堿裂解法提取質(zhì)粒的純化效果好. 適用: 分子克隆中所有常規(guī)的酶學(xué)反應(yīng)、高效的哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。 缺點(diǎn): 不能有效分離帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒DNA與閉環(huán)質(zhì)粒DNA。 64、總RNA的分離與純化：(異)硫氰酸胍-酚氯仿法 總RNA提取法中最常使用的是一步法。(異)硫氰酸胍-酚氯仿法是經(jīng)典的一步法 65、同時(shí)制備RNA、DNA與蛋白質(zhì)的一步法：是(異)硫氰酸胍-酚氯仿一步法的改進(jìn)方法。(異)硫氰酸胍-酚的單相裂解試劑裂解細(xì)胞，再加入氯仿后形成兩相。變性的DNA與蛋白質(zhì)位于兩相的界面。上層水相-RNA：通過異丙醇沉淀與75%乙醇洗滌

17、而獲得。可用于mRNA的純化、Northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR反應(yīng)等。處于界面的DNA與蛋白質(zhì)可通過乙醇和異丙醇分級沉淀出來。制備的DNA: 作PCR反應(yīng)模板，蛋白質(zhì)樣品: 主要用于免疫印跡。 66、DNA重組（DNA recombination）不同來源的DNA分子，通過磷酸二酯鍵連接而重新組合的過程 67、重組DNA：在體外用限制性內(nèi)切酶，將不同來源的DNA分子進(jìn)行特異地切割，獲得的目的基因或DNA片段與載體(zit)重新連接，從而組成一個(gè)新的DNA分子。 68、克?。╟lone）由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖以后(yhu)形成的子代群體。 69、DNA分子克隆：構(gòu)建DNA重組體并導(dǎo)入宿

18、主細(xì)胞(xbo)建立無性繁殖體系 70、基因克?。?重組的DNA分子能夠通過一定的方式進(jìn)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中進(jìn)行無性增殖，獲得大量的目的基因或DNA片段的過程。 71、限制性內(nèi)切酶：一類核酸水解酶，能識別和切割雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列, 識別序列一般具雙重對稱性(回文結(jié)構(gòu)) . 72、限制性內(nèi)切酶的主要用途：改造和組建質(zhì)粒組建基因組DNA物理圖譜 基因組DNA同源性研究 DNA重組克隆及亞克隆 DNA雜交與序列分析 73、DNA連接酶(DNA ligase) 基因工程的縫紉針 催化雙鏈DNA一端的3-OH與另一雙鏈DNA5端的磷酸根形成3，5磷酸二酯鍵，使具有相同粘末端或平端

19、的DNA末端連接起來。T4噬菌體DNA連接酶-常用大腸桿菌DNA連接酶-少用 74、堿性磷酸酶：催化DNA，RNA以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的 5 磷酸基團(tuán)水解。 75、載體(Vector)攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具。 76、載體具備的條件 宿主細(xì)胞中有自主復(fù)制能力或能整合到宿主染色體上與基因組一同復(fù)制的能力； 有合適的限制性酶切位點(diǎn)供外源DNA片段插入 分子量不宜過大，便于容納較大的外源DNA片段并獲得較高的拷貝數(shù)，也利于體外重組操作； 具有合適的篩選標(biāo)記，如抗藥性、酶基因、營養(yǎng)缺陷型或形成噬菌斑的能力等；配備與宿主相適應(yīng)的調(diào)控元件，如啟動子、增強(qiáng)子和前導(dǎo)序列等。

20、77、用作克隆載體的理想質(zhì)粒一般具備的特點(diǎn)： 具有松馳型復(fù)制子；復(fù)制子外存在多克隆位點(diǎn)； 具有插入失活的篩選標(biāo)記，如Ampr和Tetr；分子量相對較小但有較高的拷貝數(shù)。 78、噬菌體（Bacteriophage，phage）是一類細(xì)菌病毒的總稱，即感染細(xì)菌的病毒。噬菌體嚴(yán)格依賴于細(xì)菌宿主細(xì)胞生長與繁殖，一旦脫離宿主細(xì)胞，盡管可以生存但不能生長與復(fù)制。 79、噬菌粒（phagemid）是一類由質(zhì)粒與單鏈?zhǔn)删w結(jié)合而成的載體。常用的噬菌粒有pUC118 /pUC119和pTZ19U 80、黏粒（cosmid）又稱柯斯質(zhì)粒，是一種(y zhn)以噬菌體為基礎(chǔ)，專門為克隆大片段而設(shè)計(jì)、并和質(zhì)粒共同構(gòu)建

21、的雜合載體。黏粒載體具有質(zhì)粒和噬菌體載體的雙重(shungchng)特性；具有高容量的克隆能力（3145kb）；具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。黏粒主要同于真核細(xì)胞基因組文庫的構(gòu)建。 81、構(gòu)建(u jin)基因組文庫多用噬菌體和黏性質(zhì)粒作為載體；構(gòu)建cDNA文庫和克隆較小DNA片段常用pUC系列質(zhì)粒；M13噬菌體則用于克隆一些待測的DNA序列。 82、轉(zhuǎn)化作用 (transformation)將重組的DNA分子引入細(xì)菌(原核細(xì)胞),使其在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過程 83、轉(zhuǎn)染作用 (transfection)將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的DNA重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程 84、在生長過程中

22、只有某一階段的細(xì)菌才能成為轉(zhuǎn)化的接受體，這稱為感受態(tài)(competent)細(xì)菌。細(xì)菌的感受態(tài)可誘導(dǎo)產(chǎn)生，如氯化鈣法就可誘導(dǎo)細(xì)菌成為感受態(tài)。感受態(tài)細(xì)菌表面其正電荷增加，細(xì)胞壁和膜通透性增加，有利于DNA分子吸附與吸收. 85、PCR技術(shù)的基本原理：在合適的緩沖體系中,通過加熱使模板DNA雙鏈中的氫鍵斷裂形成單鏈，這個(gè)過程稱為變性。在合適的溫度條件下，特異性引物與模板DNA根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，這個(gè)過程稱為退火。在DNA聚合酶的作用下，引物延伸，形成新的DNA鏈。如此循環(huán)往復(fù)，經(jīng)過多個(gè)循環(huán)后，模板DNA在2個(gè)特異性引物之間的序列就會大量擴(kuò)增。 86、 PCR技術(shù)的特點(diǎn)：高度的靈敏性、特異性、

23、操作簡便易行、用途廣泛87、PCR反應(yīng)體系的影響因素:DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、緩沖液、熱循環(huán)參數(shù) 88、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析： Gel electrophoresis、Restriction endonuclease、Single strand conformation polymorphism （SSCP）、Nucleic acid sequence、Molecular hybridization 89、熒光定量 PCR：通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測樣品的初

24、始模板量 90、基線：是擴(kuò)張曲線的水平部分 91、CT值：從基線到指數(shù)增長期的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù) 92、絕對定量：用于確定未知樣品中某個(gè)核酸序列的絕對量值，即通常說的拷貝數(shù)。 93、相對定量：用于測定一個(gè)測試樣本中目標(biāo)核酸序列與校正樣本中同一序列表達(dá)的相對變化 94、熒光定量實(shí)時(shí) PCR與普通 PCR的比較 實(shí)時(shí)在線監(jiān)控：對樣品擴(kuò)增的整個(gè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加,直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期 降低反應(yīng)的非特異性：使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合,提高了 PCR反應(yīng)的特異性 增加定量的精確性：全程監(jiān)控,準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量 結(jié)果分析更加快捷方便,無需跑膠 95、PCR-ASO

25、檢測基因點(diǎn)突變 :是利用 PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的適當(dāng)片段 ,然后(rnhu)用人工合成的含突變位點(diǎn)的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交 96、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生部批準(zhǔn)項(xiàng)目(xingm)：二級醫(yī)院以上HBV、HCV、TB、CT、HIV、HLA 97、標(biāo)準(zhǔn)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室必須(bx)包括四個(gè)工作區(qū)域(working zones)： 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 標(biāo)本制備區(qū) 擴(kuò)增反應(yīng)區(qū) 產(chǎn)物分析區(qū) 四區(qū)須互相獨(dú)立，并嚴(yán)格按照上述順序設(shè)置，并遵循單一走向的工作區(qū)域。98、環(huán)境污染處理(Contamination around circumstances)： 稀酸或消毒液處理法、紫外線照射法 99、反應(yīng)液污染的處理

26、：在PCR反應(yīng)液（不含Taq DNA聚合酶和模板）中加入0.5uDNase I或核酸內(nèi)切酶（如10u的Msp I），室溫下30-60分鐘。加熱滅活DNase I或核酸內(nèi)切酶，再加入Taq DNA聚合酶和模板做PCR 100、變性（denaturation）在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。 101、變性核酸的特點(diǎn)：粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加 102、融解溫度（Tm）在DNA熱變性時(shí)，其A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度 103、影響Tm的因素：DNA堿基的組成、溶液的離子強(qiáng)度、pH值、變性劑 104、復(fù)性：變性DNA經(jīng)過一定處

27、理重新形成雙螺旋的過程。 105、影響復(fù)性速度的因素： DNA濃度、DNA片段的大小、 DNA片段復(fù)雜性、 合適的復(fù)性溫度、適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度 106、雜交：兩條來源不同，但具有互補(bǔ)序列的核酸，按堿基配對原則復(fù)性形成一個(gè)雜交體，這個(gè)過程即雜交，或稱分子雜交。 107、探針（probe）指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測的分子。 108、基因探針：指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補(bǔ)雜交，雜交后又能被特殊方法檢測的已知被標(biāo)記（同位素或非同位素標(biāo)記）的核苷酸鏈。 109、各類探針特點(diǎn)： 基因組DNA探針：無性繁殖、制備方法簡單；不易降解（與RNA比較）；標(biāo)記方法成熟。 cDNA探針（complementary DNA）：不含內(nèi)含子及高度重復(fù)序列但不易獲得 RNA探針：雜交效率高，穩(wěn)定性高，非特異性，雜交較少,未雜交探針可用RNase 降解，減少本底的干擾。易降解，標(biāo)記方法復(fù)雜 寡核苷酸探針 ： 可根據(jù)需要合成相應(yīng)序列；探針短,序列復(fù)雜性低,分子量小，因此雜交時(shí)間短; 長 度只有1050bp，該識別序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化可明顯降低雜交Tm值?？纱罅亢铣?，價(jià)格低，能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法進(jìn)行非放射性標(biāo)記110、理想的探針(tn zhn)標(biāo)記物應(yīng)