大豆和枸杞蛋白PAGE問題及其分析(共14頁)

1、 - 13 -本科(bnk)畢業(yè)論文 題 目 大豆(ddu)和枸杞蛋白PAGE問題(wnt)及其分析 學(xué) 院 專 業(yè) 畢業(yè)屆別 姓 名 指導(dǎo)教師 職 稱 二一 五 年 五 月目錄(ml) TOC h z t 3張鵬飛,1,1張鵬飛,1,2張鵬飛,1,4招拍掛,1,5張鵬飛,1,6張鵬飛,1 HYPERLINK l _Toc421026520 摘要(zhiyo) PAGEREF _Toc421026520 h - 2 - HYPERLINK l _Toc421026521 關(guān)鍵詞 PAGEREF _Toc421026521 h - 2 - HYPERLINK l _Toc421026523 前言

2、(qin yn) PAGEREF _Toc421026523 h - 2 - HYPERLINK l _Toc421026524 1 材料與方法 PAGEREF _Toc421026524 h - 3 - HYPERLINK l _Toc421026525 1.1 材料 PAGEREF _Toc421026525 h - 3 - HYPERLINK l _Toc421026526 1.1.1 藥品 PAGEREF _Toc421026526 h - 3 - HYPERLINK l _Toc421026527 1.1.2 儀器 PAGEREF _Toc421026527 h - 4 - HYPE

3、RLINK l _Toc421026528 1.2 方法 PAGEREF _Toc421026528 h - 4 - HYPERLINK l _Toc421026529 1.2.1 豆粉和枸杞勻漿的制備 PAGEREF _Toc421026529 h - 4 - HYPERLINK l _Toc421026530 1.2.2 大豆和枸杞蛋白質(zhì)的提取 PAGEREF _Toc421026530 h - 4 - HYPERLINK l _Toc421026530 1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 PAGEREF _Toc421026530 h - 5 - HYPERLINK l _Toc421026

4、531 1.2.3.1 分離膠和濃縮膠的配制 PAGEREF _Toc421026531 h - 5 - HYPERLINK l _Toc421026532 1.2.3.2 樣品處理 PAGEREF _Toc421026532 h - 5 - HYPERLINK l _Toc421026533 1.2.3.3 電泳 PAGEREF _Toc421026533 h - 5 - HYPERLINK l _Toc421026534 1.2.3.4 染色與脫色 PAGEREF _Toc421026534 h - 5 - HYPERLINK l _Toc421026535 2 結(jié)果與分析 PAGEREF

5、 _Toc421026535 h - 5 - HYPERLINK l _Toc421026536 2.1 封膠 PAGEREF _Toc421026536 h - 5 - HYPERLINK l _Toc421026537 2.2 制膠 PAGEREF _Toc421026537 h - 6 - HYPERLINK l _Toc421026538 2.3 樣品提取 PAGEREF _Toc421026538 h - 8 - HYPERLINK l _Toc421026539 2.4 電極緩沖液與樣品緩沖液 PAGEREF _Toc421026539 h - 9 - HYPERLINK l _T

6、oc421026540 2.5 電泳 PAGEREF _Toc421026540 h - 9 - HYPERLINK l _Toc421026541 2.6 染色與脫色 PAGEREF _Toc421026541 h - 10 - HYPERLINK l _Toc421026542 2.7 結(jié)果觀察 PAGEREF _Toc421026542 h -11 - HYPERLINK l _Toc421026543 3 結(jié)論與討論 PAGEREF _Toc421026543 h - 11 - HYPERLINK l _Toc421026544 參考文獻 PAGEREF _Toc421026544 h

7、 - 12 - HYPERLINK l _Toc421026545 致謝 PAGEREF _Toc421026545 h - 13 -大豆和枸杞(gu q)蛋白PAGE問題(wnt)及其分析摘要(zhiyo)：采用堿溶酸沉法和(NH4)2SO4沉淀法分別提取大豆蛋白和枸杞蛋白，用SDS電泳技術(shù)對大豆蛋白、枸杞蛋白以及標(biāo)準(zhǔn)蛋白規(guī)范化的實驗，總結(jié)實驗封膠、制膠、樣品提取、電泳、染色脫色等步驟中常見問題并作出詳細(xì)分析。結(jié)果表明：實驗過程中最主要的問題是電泳重復(fù)性差，此為還有封膠時出現(xiàn)漏膠、電泳時出現(xiàn)拖尾、染色時出現(xiàn)染色深淺不一等現(xiàn)象。通過分析選擇最適合的實驗方法在實驗中省時省材達到電泳試驗的最終目的

8、。關(guān)鍵詞：SDS；蛋白質(zhì)；問題；分析Problems and analysis of PAGE for soybean and Lycium barbarum protein Abstract: By alkali-solution and acid-isolation and (NH4) 2SO4 precipitation extraction of soybean protein and Lycium barbarum protein, respectively, by SDSprotein electrophoresis of soybean, wolfberry, and stand

9、ardized test of standard proteins, summarizing experiments sealant, adhesive, sample extraction steps such as bleaching, electrophoresis, staining and make a detailed analysis of common problems in. Results showed that electrophoresis is the main problem in the experimental process reproducibility i

10、s poor, and there was a leakage of adhesive and sealant gel electrophoresis occurred when there was a dyed two-tone tail, dyeing and so on. Analysis to select the most suitable experimental method in the experiment of time and materials to achieve the ultimate purpose of electrophoresis tests . Key

11、words: SDS；Protein；Problem；Analysis前言自Raymond等1于1959年10月在科學(xué)雜志上介紹丙烯酰胺能在緩沖溶液中聚合反應(yīng)，形成穩(wěn)定、透明、有彈性的凝膠后，Raymond用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)成功分離出血清和血紅素。隨后Chang等2成功分離鏈孢霉菌的可溶性蛋白質(zhì)，該技術(shù)在蛋白電泳中得到廣泛應(yīng)用。在樣品介質(zhì)和聚丙烯稀酰胺中加入了離子去污劑和強還原劑后，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基的分子量的大小，從而電荷因素可以被忽略3,4，這使PAGE技術(shù)得到進一步發(fā)展。Laemmli5對PAEG的改進更使SDS成為在生命科學(xué)研究領(lǐng)域分析蛋白特性和純度

12、的一種基礎(chǔ)性技術(shù)。從此電泳技術(shù)也成為“生物化學(xué)”與“分子生物學(xué)”課程中的基礎(chǔ)實驗6。電泳是指帶電(di din)顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程，它們在某個(mu )特定的pH值下攜帶電荷，在電場(din chng)的作用下，帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的方向移動7。電泳技術(shù)就是在電場的作用下，由分子帶電性質(zhì)、大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定的技術(shù)。電泳過程必須在支持介質(zhì)中進行，而凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進了電泳技術(shù)的發(fā)展，使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要手段之一。 30多年來，聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中

13、對蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍、分辨率最高的分析鑒定技術(shù)。在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗課程和SRTP項目研究中大量接觸了聚丙烯酰胺凝膠電泳綜合設(shè)計性實驗之后發(fā)現(xiàn)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗中用分離膠和濃縮膠后，雖然分離效果好，但制膠與電泳所需的時間為10多個小時。用到的實驗耗材較多，操作步繁雜，一次操作成功率低。本文通過對大豆蛋白、枸杞蛋白以及標(biāo)準(zhǔn)蛋白進行凝膠電泳實驗，為節(jié)省實驗耗材、縮短實驗時間、提高實驗效率來總結(jié)實驗中常見的問題并且做出相應(yīng)的分析，為基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗 課程的電泳實驗提供參考。1 材料與方法 1.1 材料枸杞、市售大豆、標(biāo)準(zhǔn)蛋白（牛血清蛋白、牛

14、血紅蛋白）。1.1.1 藥品Tris堿、十二烷基磺酸鈉（SDS）、過硫酸銨(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、巰基乙醇、蔗糖、甘氨酸、瓊脂、考馬斯亮藍R250、甲醇、36%乙酸、去離子水、考馬斯亮藍G250、牛血清白蛋白、牛血紅蛋白、NaOH（2M）、HCl（1M）。電極緩沖液：Tris 6g，Gly 28.8g，SDS 2g，去離子水溶解后，用HCl調(diào)pH值至8.3，去離子水定容至2000ml冰箱中儲存?zhèn)溆谩?0%丙烯酰胺（Acr）：Acr 30g，去離子水溶后定容至100ml，過濾，冰箱中儲存?zhèn)溆谩?%甲叉雙丙烯酰胺（Bis）：Bis 1g，去離子水溶后定容至100ml，過濾，冰箱中儲存

15、備用。分離(fnl)膠緩沖液（1.5M Tris，pH8.7）：Tris 18.17g，適量(shling)去離子(lz)水溶解，然后用1M HCl調(diào)pH值至8.7，定容至100ml，冰箱中儲存?zhèn)溆?。濃縮膠緩沖液（0.5M Tris，pH6.8）：Tris 6.06g，適量去離子水溶解，然后用1M HCl調(diào)pH值至6.8，定容至100ml，冰箱中儲存?zhèn)溆谩?0%SDS：SDS 1g，加去離子水10ml溶解，冰箱中儲存?zhèn)溆谩?0%過硫酸銨：1g過硫酸銨，加去離子水10ml溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。樣品緩沖液（pH8.0）：Tris 6.05g、蔗糖10g、巰基乙醇5ml、溴酚藍0.05g、SDS 1g、溶

16、于去離子水，用1M HCl調(diào)pH值至8.0，定容至50ml，冰箱中儲存?zhèn)溆?。脫色液：甲醇：乙酸?6%）：去離子水=5:1:5（體積比）8 。染色液（0.25%考馬斯亮藍R250）：1g考馬斯亮藍R250，用脫色液400ml溶解，過濾備用。標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制9:100g/ml牛血清白蛋白溶液：稱取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml，吸取上述溶液40ml，用蒸餾水稀釋至100ml。100g/ml牛血紅白蛋白溶液：稱取牛血紅白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml，吸取上述溶液40ml，用蒸餾水稀釋至100ml。 1.1.2 儀器 XB-11立式粉碎機，篩子（6080目），艾納憂全營

17、養(yǎng)果蔬破壁養(yǎng)生機，海爾電冰箱，TGL-16M高速低溫冷凍離心機（湘儀），超純水系統(tǒng)，多功能電磁爐，格蘭仕微波爐，電泳儀，電泳槽，微量進樣器。1.2 方法1.2.1 豆粉和枸杞勻漿的制備稱取大豆5g，去皮，粉碎，過篩。收集豆粉，經(jīng)過脫脂之后烘干儲存，使用時溶于去離子水備用。稱取枸杞60g，清洗、干燥用破壁打漿機放入冰水制漿。用紗布粗過濾，得到濾液，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2 大豆和枸杞蛋白質(zhì)的提取大豆蛋白使用堿溶酸沉法進行提取，取備用的脫脂豆粉用雙蒸水溶解，調(diào)PH至8.5左右，離心留上清液。調(diào)上清液pH至4.5左右，離心后沉淀冰箱保存留用。 枸杞蛋白使用( NH4)2SO4沉淀法提取，制備枸

18、杞勻漿，均分三份。分別調(diào)pH為6、7、8，在不同的pH值下，分別設(shè)置(NH4)2SO4的飽和度為60%、70%、80%進行鹽析，然后透析，提取出蛋白質(zhì)備用。1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳1.2.3.1 分離膠和濃縮(nn su)膠的配制10濃縮(nn su)膠（5%）：30%Arc 3ml，1%Bis 3ml，濃縮(nn su)膠緩沖液7.5ml，雙蒸水16.5ml，10%SDS 300ul，10%過硫酸銨0.2ml，TEMED 50ul。分離膠（10%）：30%Arc 9.75ml，1%Bis 7.5ml，分離膠緩沖液3.75ml，雙蒸水8.8ml，10%SDS 100ul，10%過硫酸銨0

19、.3ml，TEMED 80ul。1.2.3.2 樣品處理將大豆和枸杞蛋白質(zhì)提取液與樣品緩沖液1:1混合，加熱煮沸3分鐘，10000r/min離心3分鐘，棄去沉淀留上清液稀釋四倍即可點樣。1.2.3.3 電泳準(zhǔn)備電泳槽及電泳儀，檢查電泳槽是否漏液，接通電源設(shè)置電壓，按設(shè)計方案點樣進行電泳。1.2.3.4 染色與脫色剝離膠片，置于染色液中，在微波爐中加熱5min，然后自然冷卻10min左右，漂洗2-3次。將膠片置于脫色液中，微波加熱5min，然后冷卻10min左右，換一次脫色液，浸泡過夜，待膠片背景透明即可進行拍照分析。2 結(jié)果與分析2.1 封膠如圖1所示本實驗使用的是垂直電泳板。封膠過程中圖a表

20、示的 DYCZ-28D垂直電泳板由于相對較高而難于封膠；圖b表示的DYCZ-30垂直電泳板相對較低封膠較為簡單。組裝電泳槽前首先對部件嚴(yán)格清洗并干燥。清洗玻璃板使用洗潔精，自來水多次沖洗，然后用吹風(fēng)機快速吹干。如果玻璃板出現(xiàn)損壞則需及時更換，以防止由于清洗不干凈或者玻璃板損壞出現(xiàn)的凝膠粘板。組裝時玻璃板與橡膠條要緊密接觸，以防止實驗中經(jīng)常出現(xiàn)的玻璃板和隔片的底部表面接觸不緊密出現(xiàn)的滲漏現(xiàn)象。其次組裝電泳槽時螺絲要均勻用力對角線旋緊，以防止玻璃片受力不均而出現(xiàn)碎裂，用力過大致使封膠破損漏液現(xiàn)象的發(fā)生。最后稱量2g瓊脂溶于100ml蒸餾水放入微波爐中使其充分溶解進行多次加熱處理后進行封膠，以防止封

21、膠失敗。出現(xiàn)漏膠現(xiàn)象后需酌情處理，如果滲漏較輕時可將電極緩沖液倒入槽中用來阻止膠液的滲漏，但電極緩沖液一定要低于膠面，同時必須用吸管吸取膠液不斷地注入玻璃板之間防止加樣孔變??；當(dāng)滲漏過快時則需要重新封膠。封膠時還必須保持所封膠體里面沒有氣泡的出現(xiàn)。在實驗結(jié)束后要對整個儀器進行徹底的清洗并且合理的保存。 圖1 垂直(chuzh)電泳(din yn)板注：a DYCZ-28D型電泳(din yn)板 b DYCZ-30型電泳板2.2 制膠本實驗使用了連續(xù)凝膠體系和不連續(xù)凝膠體系。連續(xù)電泳指電泳系統(tǒng)使用相同孔徑的凝膠，這種電泳系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)時分辨率較低，加樣時必須成一條極窄的帶，才樣品很好地分離。不

22、連續(xù)電泳指用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳。在不連續(xù)電泳中由于濃縮膠的堆積作用，使樣品如圖2-a所示在濃縮膠和分離膠的界面上壓線行成一窄帶后，再進入分離膠。電泳時還會出現(xiàn)如圖2-b所示由于電極緩沖液pH值、凝膠體系離子等的影響而出現(xiàn)出現(xiàn)蛋白分離效果差，經(jīng)常也出現(xiàn)如圖2-c所顯示的波浪現(xiàn)象。在使用不連續(xù)凝膠體系時，制膠前將事配置好的分離膠沿隔片緩慢的倒入傾斜的電泳槽內(nèi)，避免在凝膠內(nèi)產(chǎn)生氣泡。當(dāng)加入適量的分離膠后，輕輕地在分離膠溶液上面覆蓋一層1-5mm厚的去離子水，使分離膠表面變得平整。在傾倒分離膠和壓面水時一定要緩慢，如果傾倒過快可能會使膠體里面出現(xiàn)氣泡。當(dāng)去離子水傾倒干凈后可先插入梳子，然后將

23、事先配置好的濃縮膠用吸管緩慢注入隔片以防止灌膠入之后插梳子時梳子齒底部出現(xiàn)氣泡。如氣泡已經(jīng)產(chǎn)生，凝膠沒有凝固時可用震蕩的方法或者用細(xì)鋼絲、長針頭將氣泡挑出；如膠已經(jīng)凝固則要重新制膠，以避免對電泳效果的影響。在壓面水和分離膠界面出現(xiàn)一個清晰的界面后，可微微的傾斜電泳槽使隔片中的去離子水流出。也可用濾紙輕輕吸去隔片中的水，但是一定不可觸及到分離膠界面。制膠時由于凝膠濃度不均勻或者凝膠里面存在氣泡，將導(dǎo)致如圖2-d所示的譜帶運動軌道不直，這種情況下則需要重新配置凝膠。在實驗當(dāng)中經(jīng)常遇見凝膠不聚合的現(xiàn)象，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)上述問題的原因有以下幾個方面。首先可能是由于試劑加入比例不恰當(dāng)，因為在配置濃縮膠和

24、分離膠時所添加的工作液比較多，實驗中經(jīng)常出現(xiàn)錯加或者漏加現(xiàn)象，所以在添加試劑時要嚴(yán)格(yng)按照試劑用量認(rèn)真添加，盡量在整個過程中由單人操作。其次是工作液出現(xiàn)問題，主要是凝膠儲備液放置時間(shjin)過長，尤其是AP。所以要將配置好的儲備液放置到冰箱(bngxing)中儲存，每次配置溶液不宜過多，AP要現(xiàn)用現(xiàn)配。最后是試劑被污染或不純所引起的，如果試劑純度不夠，往往出現(xiàn)凝膠不聚合或者成膠韌性較差所以要使試劑有足夠純度。除了凝膠不聚合之外，實驗中還經(jīng)常遇見凝膠聚合太快或者太慢的現(xiàn)象，主要由TEMED、AP的使用量不合理造成，所以在配置凝膠時要添加適量的TEMED、AP。而凝膠聚合太快或者膠面

25、不平、凝膠里面存在氣泡、導(dǎo)致凝膠體系不均一，會出現(xiàn)如圖2-e所示的染色后區(qū)帶不整齊。 在凝膠凝聚后要緩慢均勻用力拔出樣品梳。如果用力不均勻可能導(dǎo)致加樣孔損壞現(xiàn)象的發(fā)生，損壞程度較輕可用微量注射器加以糾正，損壞嚴(yán)重則必須重新制作。如果電泳完成后出現(xiàn)如圖2-f所示的膠片龜裂，可能由于玻璃板陳舊導(dǎo)致的膠體粘板或點樣后沒有及時的電泳、凝膠聚合反應(yīng)時過量的產(chǎn)熱而引起的，在遇見上述問題后主要通過保證定期檢查更換實驗器材、點樣完成后及時電泳的方法來解決。圖2制膠時常見問題注：a枸杞不連續(xù)電泳實驗中濃縮膠堆積作用形成的平行(pngxng)壓線；b枸杞不連續(xù)電泳(din yn)實驗中由電極(dinj)緩沖液PH

26、值、凝膠體系離子等影響而出現(xiàn)蛋白分離效果差；c大豆電泳實驗中壓線時形成的波浪現(xiàn)象；d大豆電泳實驗中凝膠濃度不均勻或凝膠里存在氣泡形成的譜帶運動軌道不直；e大豆電泳實驗中凝膠體系不均形成的區(qū)帶不整齊；f標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳實驗中由于膠體粘板中出現(xiàn)的膠片龜裂2.3 樣品提取枸杞蛋白提取實驗前期枸杞用量為5g，電泳完成后將出現(xiàn)如圖3-a所示的膠片上蛋白質(zhì)條帶淺的現(xiàn)象。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)主要是枸杞用量太少和實驗中研磨、過濾的消耗，提取的蛋白質(zhì)量少。后期增加枸杞用量至60g，并對研磨、過濾、離心等都做了較大的調(diào)整。前期使用研缽進行研磨，發(fā)現(xiàn)對枸杞、枸杞籽研磨不完全。最后改進使用艾納憂全營養(yǎng)果蔬破壁養(yǎng)生機在冰水中進行制漿

27、，使枸杞和枸杞籽充分研磨。研磨完成后，用紗布將勻漿轉(zhuǎn)移過濾。鹽析時使用了固體(NH4)2SO4使蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度中充分析出，離心時增加離心速度到6000r/min并離心20min，使蛋白質(zhì)充分沉淀。并且透析時間增加到 64 h，使用聚乙二醇濃縮，實驗結(jié)果蛋白質(zhì)條帶清晰。在大豆蛋白質(zhì)提取實驗中同樣做了相似的調(diào)整，經(jīng)過實驗之后確定了5g大豆進行實驗，因為大豆蛋白比較豐富使用量過多將出現(xiàn)如圖3-b左側(cè)所示的電泳條帶過寬，而右側(cè)顯示了經(jīng)過稀釋之后大豆蛋白電泳條帶。此外用堿溶酸沉法提取蛋白質(zhì)時嚴(yán)格控制了實驗中pH值，使實驗中蛋白質(zhì)最大限度的被提取。樣品制備完成之后應(yīng)該短時間內(nèi)進行電泳，如果樣品放置時

28、間過長可能會導(dǎo)致如圖3-c所示的電泳條帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象。在本實驗中使用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白主要是牛血清蛋白和牛血紅蛋白，按照實驗方法配置好之后放置到冰箱備用，標(biāo)準(zhǔn)蛋白可保持一個月之久。樣品提取(tq)后在點樣之前要在樣品中加入樣品緩沖液，加入樣品緩沖液后樣品可經(jīng)過(jnggu)煮沸長時間冷凍保存，但是如果多次反復(fù)的凍融會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集，所以(suy)對樣品保存時應(yīng)該分批放置，每次只取使用量。樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大可能引起如圖3-d所示的蛋白質(zhì)條帶拖尾，所以電泳時對樣品充分加熱并且離心去除雜質(zhì)。蛋白質(zhì)條帶拖尾也可能是Tris、樣品提取液或者電極緩沖液被污染所引起的，要及時更換Tris溶液、重新清

29、洗、調(diào)配電極緩沖液溶液。圖3樣品提取常見問題注：a枸杞用量太少導(dǎo)致電泳后膠片上蛋白質(zhì)條帶淺的現(xiàn)象；b大豆蛋白量過多出現(xiàn)的電泳條帶過寬；c標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品放置時間過長導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象；d標(biāo)準(zhǔn)蛋白點樣前未加熱離心或試劑污染造成的蛋白質(zhì)條帶拖尾2.4 電極緩沖液與樣品緩沖液加入電極緩沖溶液是為了調(diào)節(jié)合適的離子濃度和pH值，保持分離物質(zhì)分子構(gòu)象不變。緩沖液在電泳過程中的一個作用是維持合適的pH。電泳時正極與負(fù)極都會發(fā)生電解反應(yīng)，長時間的電泳將使正極變酸，負(fù)極變堿。一個好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強的緩沖能力，使溶液兩極的pH保持基本不變。電泳過程中經(jīng)常出現(xiàn)由于電泳緩沖液pH下降導(dǎo)致如圖4-a所示的電泳條帶散

30、開現(xiàn)象，調(diào)節(jié)好緩沖體系之后對枸杞蛋白進行標(biāo)準(zhǔn)化實驗后，得到如圖4-b 所示的圖片。所以電泳過程中要保持恒定的pH值，另外電泳時間還隨pH增高而增加。電泳緩沖液的另一個作用是使溶液具有一定的導(dǎo)電性，形成一定的電流，而電流過低時電泳速度變慢；太高時就會造成膠發(fā)熱甚至熔化。電極緩沖液在每次實驗完成之后可收集保存重復(fù)使用。使用前先觀察是否有沉淀如果有則進行加熱，之外還要調(diào)節(jié)好緩沖液pH，如緩沖液變質(zhì)則要重新配置。電極緩沖液一般重復(fù)使用3-4次最好。加入樣品緩沖溶液同樣也是為了調(diào)節(jié)(tioji)合適的離子濃度和pH值，也主要(zhyo)影響(yngxing)樣品中蛋白質(zhì)的解離。在樣品緩沖液中需加入巰基乙

31、醇使蛋白二硫鍵還原,有利于蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合,蛋白樣品被加熱變性能使SDS與蛋白充分結(jié)合，當(dāng)未添加SDS或者-巰基乙醇導(dǎo)致蛋白質(zhì)解離差，電泳時顯示如圖4-c所示情況，當(dāng)添加SDS或者-巰基乙醇后可顯示如圖4-d所示情況。圖4緩沖體系影響常見問題注: a電泳緩沖液PH下降導(dǎo)致枸杞蛋白電泳條帶散開； b枸杞蛋白標(biāo)準(zhǔn)化實驗后形成的正常條帶； c標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品未添加SDS形成的效果圖； d標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品添加SDS形成的效果圖2.5 電泳電泳是本實驗最重要的一步，電泳前先要進行點樣，點樣前將電極緩沖液倒入電泳槽，液面必須高于儲液槽短玻璃，否則會造成電路斷路。然后按實驗方案用微量注射器點樣，操作時將針頭放至

32、樣品孔底部，緩慢推動注射器并且隨著樣品注入量的增加而升高注射器針頭以防止將氣泡帶入，氣泡的存在會使樣品混入到相鄰的加樣孔中。點樣是一個比較細(xì)致的過程，整個過程耗時較長。點樣期間如果點樣串位或者點樣孔被破壞，點樣后樣品將發(fā)生自然漂移。所以在點樣之前必須對所點樣進行標(biāo)記。點樣時加樣量過少導(dǎo)致蛋白質(zhì)條帶過淺，點樣時一般每孔上樣的最低蛋白質(zhì)量（每一條帶）：0.1ug，上樣最大蛋白質(zhì)量：2040ug【11】。實驗中也經(jīng)常遇見樣品無法進入加樣孔底部的現(xiàn)象，主要原因是樣品緩沖液中蔗糖含量太低，所以在配置樣品緩沖液時應(yīng)該添加足夠的蔗糖，另外甘油也可起相同的作用。點樣完成之后接通電源設(shè)置電泳條件。在此過程中時有

33、錯誤發(fā)生，比如電極連接相反導(dǎo)致蛋白質(zhì)如圖5-ab所示的反向漂移；電泳槽內(nèi)金屬絲斷裂而未及時更換導(dǎo)致斷路。所以在電泳開始前需逐項檢查線路，排除電路不通的問題。電源接通依據(jù)為電泳槽內(nèi)金屬箔絲上出現(xiàn)小氣泡。此外電泳過程中由于電壓不穩(wěn)定導(dǎo)致蛋白質(zhì)遷移率發(fā)生變化，所以應(yīng)在恒壓的條件下電泳，可以保證蛋白質(zhì)恒定的遷移速率。電泳過程中還要保證溫度的恒定，實驗中可將電泳儀放置到冰箱中進行電泳，否則會出現(xiàn)如圖5-c所示現(xiàn)象的發(fā)生。圖5電泳(din yn)時常見問題a大豆蛋白電泳時電極(dinj)連接相反導(dǎo)致蛋白質(zhì)反向漂移；b枸杞蛋白(dnbi)電泳時電極連接相反導(dǎo)致蛋白質(zhì)反向漂移；c標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳時溫度變化形成的效

34、果圖2.6 染色與脫色染色與脫色過程中主要出現(xiàn)如圖6-a所示的膠片染色時間過短導(dǎo)致染料沒有完全穿透凝膠出現(xiàn)染色效果差，或者沒有加入充足的染料進行充分的震蕩。一般來說，微波染色時間約為5分鐘左右，否則脫色需要花費更長的時間。如果脫色后顯得染色效果差則可以再次染色。在染色時還會出現(xiàn)染色深淺不一現(xiàn)象，原因可能是提取液或點樣用量不一、在染色時染色液較少、膠片重疊染色而造成的6-b，所以染色時倒入充足的染色液并且盡量單層染色脫色。圖6染色與脫色常見問題 a標(biāo)準(zhǔn)蛋白膠片染色時間過短染色效果；b標(biāo)準(zhǔn)蛋白膠片重疊染色效果2.7 結(jié)果觀察對膠片進行染色脫色(tu s)完成后，在實驗設(shè)備允許的情況下可使用凝膠成像

35、分析(fnx)系統(tǒng)進行分析膠片。枸杞蛋白標(biāo)準(zhǔn)化實驗(shyn)后經(jīng)過凝膠成像分析系統(tǒng)進行拍照，之后進行如圖7-b進行條帶分析。如果實驗條件簡陋時可使用如圖7-b所示的方法進一步分析。圖7膠片分析 a大豆蛋白膠片凝膠成像系統(tǒng)分析圖示；b大豆蛋白膠片簡單分析圖示3 結(jié)論與討論SDS是一種可靠的分析蛋白質(zhì)特性的技術(shù)。盡管在電泳實驗指導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)有了詳細(xì)的講述，但是對初學(xué)者來說在實驗中仍然出現(xiàn)許多問題。本文在提取枸杞和大豆蛋白基礎(chǔ)上進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，進行凝膠電泳常見問題的分析。結(jié)果表明在進行封膠、制膠、樣品提取、電泳、染色脫色等過程中都有問題出現(xiàn),整個實驗過程中最主要的是電泳重復(fù)性較差12，主要由樣品制備條件不一、凝膠制備不規(guī)則、凝膠儲備液放置過久所引起，一般來說與電泳過程無關(guān)。為保證電泳過程有較好的重復(fù)性，在凝膠制作時嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作，保證使用新配的儲備液。除此之外主要出現(xiàn)的問題還有封膠時出現(xiàn)漏膠，