基因診斷3ppt課件

1、 第 10 章 基因診斷 Gene diagnosis China Medical University Department of Medical Genetics p480. 本章內(nèi)容提示 基因診斷概念 基因診斷方法 直接診斷Southern 間接診斷PCR-RFLP DNA多態(tài) 基因診斷 實(shí)例：.第一節(jié) 基因診斷技術(shù) 第二節(jié) 基因診斷方法及實(shí)例. 基因診斷： 利用分子生物學(xué)技術(shù)從DNA 程度檢測(cè)人類遺 傳性疾病的基因缺陷，又稱DNA分析法。 傳統(tǒng)的診斷：表現(xiàn)型基因型 基 因 診 斷：基因型表現(xiàn)型 逆向診斷.基因診斷的特征：1 不受資料來(lái)源影響 外周血、活體穿刺組織、孕婦外周血、血斑等2

2、病癥前診斷 尤其對(duì)于一些延遲顯性疾病如Huntingtong舞蹈病3 產(chǎn)前診斷 防止患兒出生，提高人口質(zhì)量.第一節(jié) 基 因 診 斷 技 術(shù)Southern印跡雜交.基 因 診 斷 技 術(shù)Northern印跡雜交.基 因 診 斷 技 術(shù)斑 點(diǎn) 雜 交點(diǎn)樣Probe-32P檢測(cè)AB1 2 3 4.基 因 診 斷 技 術(shù)熒光原位雜交.基 因 診 斷 技 術(shù)熒光原位雜交.基 因 診 斷 技 術(shù)聚合酶鏈反響.基 因 診 斷 技 術(shù)聚合酶鏈反響.基 因 診 斷 技 術(shù) 多重PCR在一個(gè)PCR體系中參與數(shù)對(duì)PCR引物，覆蓋區(qū)域不重疊用于檢測(cè)同一基因多個(gè)外顯子的缺失E1 E2 E3.基 因 診 斷 技 術(shù) R

3、T-PCR以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA用于研討基因表達(dá)使微量mRNA迅速擴(kuò)增，提高mRNA檢出的靈敏度.基 因 診 斷 技 術(shù) PCR-SSCPSingle Strand Conformation Polymorphism單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差別，這種差別將呵斥一樣或相近長(zhǎng)度的單鏈DNA電泳遷移率的不同。據(jù)此，可用于DNA中單個(gè)堿基的替代、微小的缺失或插入的檢測(cè)。.基 因 診 斷 技 術(shù) - primer - 32P-dNTP摻入 PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物 變性 單鏈DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 自顯影 1為正常 結(jié)果分析 2、4、5為純合患者 3為雜

4、合子 . .基 因 診 斷 技 術(shù)生 物 芯 片.第二節(jié) 基 因 診 斷 方 法及實(shí)例直接診斷直接檢測(cè)致病基因的突變 基因突變類型缺失、點(diǎn)突變、反復(fù)、插入等間接診斷運(yùn)用DNA多態(tài)為遺傳標(biāo)志進(jìn)展連鎖 分析，確定待測(cè)者能否得到帶有致病的染色體，從而間接地作出診斷 DNA多態(tài)RFLP、VNTR、SNP.一 DNA多態(tài)DNA多態(tài)DNA Polymorphism： 群體中每個(gè)個(gè)體DNA區(qū)域中等位基因或片段存在兩種或兩種以上的方式，對(duì)基因功能沒(méi)有影響，稱DNA多態(tài)。 它經(jīng)過(guò)孟德?tīng)柗绞竭z傳。常用做遺傳分析中的標(biāo)志。.DNA分析中常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)志有3類：1RFLP：稱限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性

5、標(biāo)志；2反復(fù)序列多態(tài)性VNTR：如短串聯(lián)反復(fù)序列STR，為第二代多態(tài)性標(biāo)志；3單堿基多態(tài)性SNP：DNA序列的單個(gè)核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標(biāo)志。.一) 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP由于堿基變異能夠?qū)е孪拗泼盖悬c(diǎn)消逝或新的酶切點(diǎn)出現(xiàn)，引起不同個(gè)體DNA在用同一限制酶切割時(shí)，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段，稱 RFLP RFLP按孟德?tīng)柟诧@性方式遺傳，是非常有用的遺傳標(biāo)志。.Allele II 產(chǎn)生了新的酶切點(diǎn) Allele I Allele II12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb RFLPSouther

6、n blot檢測(cè)結(jié)果 .AlleleII酶切位點(diǎn)消逝 .二)數(shù)目變異串聯(lián)反復(fù)，variable number tandem repeats, VNTR反復(fù)序列以各自的中心序列反復(fù)單元，首尾相連多次反復(fù)，稱為串聯(lián)反復(fù)序列，其反復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，構(gòu)成多態(tài)即 VNTR。散在分布于染色體上。反復(fù)單位625bp長(zhǎng)，稱為小衛(wèi)星DNA。反復(fù)單位26bp長(zhǎng)，如TAn, (CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA。.VNTR兩側(cè)酶切位點(diǎn)固定，但兩酶切點(diǎn)之間的串聯(lián)反復(fù)拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段。DNA多態(tài)可以經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后電泳來(lái)檢出，稱擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)amplified fragment length p

7、olymorphism, Amp-FLP.VNTR 酶切，電泳后的檢測(cè)結(jié)果大小.PCR-VNTR檢測(cè).PCR-VNTR.三)單核苷酸多態(tài)性SNPSingle Nucleiotide PolymorphismSNP：發(fā)生在基因組中的單個(gè)核苷酸的替代根據(jù)SNP在基因中的位置，分為： 基因編碼區(qū)SNP 基因周邊SNP 基因間SNP在人類基因組中每100300個(gè)核苷酸就有一個(gè)SNP.二、基診斷方法及實(shí)例 直接檢測(cè)致病基因本身的異常。通常運(yùn)用基因本身或臨近DNA序列作為探針，進(jìn)展Southern 雜交，或經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，以檢測(cè)基因點(diǎn)突變、缺失、插入等異常及性質(zhì)。主要適用于知基因異常疾病的診斷。直接

8、基因診斷及實(shí)例.直接基因診斷 突變型遺傳病的直接基因診斷e.g. 鐮形細(xì)胞貧血的Gene診斷 .1Southern blot 珠蛋白鏈基因第6位密碼子發(fā)生突變 GAGGTG 谷Aa纈Aae.g. 鐮形細(xì)胞貧血的Gene診斷.知限制酶Mst 1識(shí)別序列 CCTNAGG CCTGAGG CCTGTGG突變后不能識(shí)別，酶切位點(diǎn)消逝，限制酶切片段長(zhǎng)度發(fā)生變化。.2) ASO探針診斷 知突變Gene部位和性質(zhì)，合成寡核苷酸探針，32P標(biāo)志，進(jìn)展斑點(diǎn)雜交。 Normal Gene Probe與正常 Probe 雜交穩(wěn)定 Mutation S Gene Probe與異常 S雜交 穩(wěn)定 .等位基因特異性寡核苷

9、酸探針ASOAllele-specific-oligonucleotide .斑點(diǎn)雜交結(jié)果： / /S S/S 正常探針 突變探針突變型遺傳病的直接基因診斷.突變型遺傳病的直接基因診斷.BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe 1 地中海貧血的基因診斷基因不同程度的缺失可引起不同類型的地中海貧血。直接基因診斷 缺失型遺傳病的直接基因診斷.Southern blot 檢測(cè)結(jié)果： / /- /- - - /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺414kb10kb缺失型遺傳病的直接基因診斷.2地貧的Gene診斷珠蛋白基因兩側(cè)有pst1酶切位點(diǎn)， pst1酶切正常可得

10、到4.4kb片段珠蛋白基因缺失0.7kb片段， pst1酶切那么得到3.7 kb片段為0 缺失型遺傳病的直接基因診斷.以Gene為探針，Southern blot 方法檢測(cè) /A /0 0/0 4.4kb3.7kb缺失型遺傳病的直接基因診斷.3 DMD的基因診斷DMD屬XRDMD基因是最大的基因，有79個(gè)外顯子DMD基因突變主要以缺失為主，可涉及基因的不同部位E1 E2 E3缺失型遺傳病的直接基因診斷.病例外顯子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp535113缺失型遺傳病的直接基因診斷.二間接基因診斷方法及實(shí)例 當(dāng)致病基因雖然知，但其異常性質(zhì)未知時(shí)，或疾病Gen

11、e本身尚未知時(shí)，主要經(jīng)過(guò)Gene和DNA多態(tài)的連鎖分析間接地作出診斷。. 連鎖分析基于遺傳標(biāo)志與Gene在染色體上連鎖， 經(jīng)過(guò)對(duì)受檢者及其家系進(jìn)展連鎖分析，分析子代獲得某種遺傳標(biāo)志與疾病的關(guān)系，間接推斷受檢子代能否獲得帶有致病基因的染色體，間接地判別并做出診斷。 遺傳標(biāo)志是基因組中的DNA 多態(tài) 如：RFLP，VNTR 等。間接基因診斷.遺傳標(biāo)志相關(guān)基因表型分析間接基因診斷.1 Southern blot-RFLP診斷(PKU) PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點(diǎn),用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb 兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。間接基因診斷.患者為19k

12、b片段的純合子,闡明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb 和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。間接基因診斷.2 成年型多囊腎病的診斷例：成年型多囊腎病APKD，AD ，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證明APKD Gene與珠蛋白基因3端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列3HVR嚴(yán)密連鎖，因此，可以經(jīng)過(guò)連鎖分析進(jìn)展診斷。間接基因診斷.

13、以3HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的基因組DNA進(jìn)展Southern Blot 基因組DNAPvuII酶切DNA片段變性轉(zhuǎn)膜探針變性雜交結(jié)果分析間接基因診斷. 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 間接基因診斷.結(jié)果分析 患者I1、II1和II2有3.4kb片段，闡明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟德?tīng)柗绞竭z傳。II5不含3.4kb片段，產(chǎn)前診斷正常。間接基因診斷.3 甲型血友病診斷PCRRFLP 甲型血友病的基因診斷：知甲型血友病XR，獲得家系成員基因組DNA 。 PCR 142 bp BcLI 142bp 99 bp 43bp 電泳 結(jié)果分析p

14、1p2142bp99bp43bpBcl IBcl I -Bcl I +間接基因診斷.間接基因診斷. 142bp99bp1 2123III 1間接基因診斷.結(jié)果分析1先癥者II 1具有99bp片段而發(fā)病，該片段來(lái)自母親。2II2有142bp/99bp，為雜合子。142bp來(lái)自父親，為正常片段，99bp片段是來(lái)自母親而成為攜帶者。31為99bp片段 假設(shè)是 男性 為患者99bp片段來(lái)自母親；女性為攜帶者來(lái)自父母雙方間接基因診斷.單體型分析有時(shí)用一種酶和一個(gè)探針不能提供可供分析的信息，需采用一種以上的酶結(jié)合幾個(gè)基因探針雜交分析。根據(jù)同一條染色體上限制性位點(diǎn)的喪失或獲得而出現(xiàn)的一組多態(tài)位點(diǎn)所構(gòu)成的不同

15、片段長(zhǎng)度的組合類型進(jìn)展分析，該分析方法稱單體型分析Haplotyping)間接基因診斷. 舉例：PKU家系Hind 酶切： 患兒4.2/4.0kb雜合體 父母4.2/4.0kb雜合體 均為雜合體，無(wú)法分析。再用sph酶切：患兒 純合7.0kb 父親 純合7.0kb 母親 9.7kb和7.0kb雜合體間接基因診斷.結(jié) 果 1 2 1 2 3 4.2kb 4.0kb 11kb 9.7kb 7.0kb IIIHind Sph 間接基因診斷.分析： 患兒1從母親和父親各獲得一個(gè)7.0kb突變型從Hind 酶切結(jié)果看出： 正常同胞3為純合4.0kb ，也是sph 7.0kb純合體，故母親H 4.0kb S 7.0kb 構(gòu)成單體型，母親7.0kb為突變型，因此，母親H 4.0kb S 7.0kb為突變單體型。間接基因診斷.患兒1為H